CN115873672A - 一种细菌生物膜清除剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细菌生物膜清除剂及其制备方法，属于杀菌剂技术领域。本发明采用了可食用、安全性高的桃分离组分作为主要活性成分，佛手提取物作为辅助组分，能够协同配合，影响细菌生物膜的生理功能，显著增强了这一清除剂的清除生物膜效果，生物膜的清除效果达96％。本发明的生物膜清除剂全部采用天然原料，显著改善了安全性，副作用显著降低。
Description
技术领域
本发明涉及一种细菌生物膜清除剂及其制备方法，属于杀菌剂技术领域。
背景技术
生物膜(biofilm)内所包裹的细菌具有不同于一般游离细菌所具备的特性，生物膜内所包裹的细菌的毒力下降，这是因为细菌所分泌的毒素被包裹在膜内，使得细菌对机体或组织的侵袭能力下降。生物膜可与机体呈“共生”状态。膜内的细菌抗药性增加，构成生物被膜主要成分的胞外聚合物会阻止抑菌剂的进入，此外，渗透压的作用也会阻止抑菌剂进入。正是因为生物膜内所包裹的细菌的免疫逃逸特性和抗药性的的存在，使得生物膜所造成的污染遍布于农产品、乳制品、肉制品等诸多食品种类中。
目前，在不影响食品质量的前提下，微生物控制策略还不能够有效地彻底消灭农产品中的有害微生物。研究表明，延长新鲜农产品货架期的主要环节是清洗，然而清洗只能减少部分微生物，这可能是因为微生物受到了自身所产生的生物膜的保护。农产品通常不经过任何加工处理，可以直接食用，因此最后的包装步骤被认为是关键控制点。被单核细胞增多性链球菌污染的哈密瓜可能是由不卫生的包装材料造成的。此外，微生物也可在传送带、干燥区、地漏中出现，牢牢粘附在不容易发现的地方，并形成生物膜，进而污染农产品。
目前，各种致病细菌的耐药性问题越来越严重，严重威胁着人们的健康，尤其是细菌生物膜(biofilm)，比浮游细菌耐药性更强，危害更大。近年来，天然化合物的相关活性引起了人们的重视，不易形成耐药性，并且副作用较小，前景广阔。通过从天然植物中分离天然活性成分来清除细菌生物膜，将能够避免细菌的耐药性和药物的不良反应。随着人们生活水平的提高，绿色环保的健康理念日益深入人心，人们越来越重视寻找天然的细菌生物膜清除剂。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种细菌生物膜清除剂及其制备方法，以消除细菌生物膜的危害，保护人们的健康。
本发明的第一个目的是提供一种细菌生物膜清除剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
①制备桃醇提物；
②将步骤①制备得到的桃醇提物与佛手提取物进行复配，得到细菌生物膜清除剂。
在本发明的一种实施方式中，所述桃醇提物制备方法如下：
(1)将桃打浆，与水混合，微波辅助萃取，过滤，得到水提液，浓缩至无溶剂，得到浓缩物；
(2)将步骤(1)得到的浓缩物分散于水中，得到悬液，上柱进行层析，依次分别采用不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，得到系列洗脱溶液，再进行减压浓缩，干燥得到第一次柱层析乙醇溶液洗脱组分；
(3)反复重复步骤(2)，得到桃醇提物。
在本发明的一种实施方式中，所述细菌生物膜清除剂包括桃醇提物和佛手提取物。
在本发明的一种实施方式中，所述桃醇提物指的是采用乙醇从桃肉中提取的提取物。
在本发明的一种实施方式中，桃醇提物和佛手提取物的质量比为1：1-1：10。
在本发明的一种实施方式中，所述制备桃醇提物的方法包括以下步骤：
(1)将桃打浆制成桃浆，与水混合，微波辅助萃取，过滤，得到水提液，浓缩至无溶剂，得到浓缩物；
(2)将步骤(1)得到的浓缩物分散于水中，得到悬液，上柱进行层析，依次分别采用不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，得到系列洗脱溶液，再进行减压浓缩，干燥得到第一次柱层析乙醇溶液洗脱组分；
(3)反复重复步骤(2)，得到桃醇提物。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)具体条件为：桃浆与溶剂的质量比为1:5-1:80；微波功率为0.1-3500Kw,提取时间为0.2-1500min，30-90℃减压浓缩。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)重复1-3次。
在本发明的一种实施方式中，第一次步骤(2)的具体条件为：层析柱填料为大孔树脂或离子交换树脂，浓缩物与水的质量比为1:1-1:50，悬液与树脂的质量比为1:2-1:100，洗脱用的乙醇溶液质量浓度为0-70％，分2-8个梯度进行洗脱，每个梯度洗脱的体积为1-10个柱体积；和/或，第二次步骤(2)的具体条件为：层析柱填料为聚酰胺树脂或C18树脂，乙醇洗脱组分与水的质量比为1:1-1:50，悬液与树脂的质量比为1:2-1:100，洗脱用的乙醇溶液质量浓度为0-70％，分2-8个梯度进行洗脱，每个梯度洗脱的体积为1-10个柱体积；和/或，第三次步骤(2)的具体条件为：层析柱填料为sephadex LH-20，悬液与树脂的质量比为1:2-1:100，洗脱用的甲醇溶液质量浓度为0-90％，分1-8个梯度进行洗脱，每个梯度洗脱的体积为1-10个柱体积。
在本发明的一种实施方式中，一种制备细菌生物膜清除剂的方法包括以下步骤：
(1)制备桃醇提物：按照权利要求6-9任一项所述的方法从桃中分离桃醇提物；
(2)将步骤(1)制备得到的桃醇提物与佛手提取物进行复配，得到细菌生物膜清除剂。
在本发明的一种实施方式中，所述一种制备细菌生物膜清除剂的包括以下步骤：
(1)将桃打浆，与水混合，微波辅助萃取，过滤，得到水提液，浓缩至无溶剂，得到浓缩物；具体条件为：蜜桃浆与溶剂的质量比为1:5-1:80；微波功率为0.1-3500Kw,提取时间为0.2-1500min，30-90℃减压浓缩；
(2)将浓缩物分散于水中，得到悬液，上柱进行层析，依次分别采用不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，得到系列洗脱溶液；具体条件为：层析柱填料为大孔树脂或离子交换树脂，浓缩物与水的质量比为1:1-1:50，悬液与树脂的质量比为1:2-1:100，洗脱用的乙醇溶液质量浓度为0-70％，分2-8个梯度进行洗脱，每个梯度洗脱的体积为1-10个柱体积(BV)；
(3)将某些梯度的乙醇溶液洗脱液30-90℃减压浓缩，20-100℃真空干燥或80-130℃喷雾干燥或0.5-200Kw微波辅助干燥；得到第一次柱层析乙醇溶液洗脱组分；
(4)将得到的乙醇洗脱组分分散在水中，上柱进行第二次柱层析，依次分别采用不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，得到系列洗脱溶液；层析柱填料为聚酰胺树脂或C18树脂，乙醇洗脱组分与水的质量比为1:1-1:50，悬液与树脂的质量比为1:2-1:100，洗脱用的乙醇溶液质量浓度为0-70％，分2-8个梯度进行洗脱，每个梯度洗脱的体积为1-10个柱体积(BV)；
(5)将某些梯度的乙醇溶液洗脱液30-90℃减压浓缩，20-100℃真空干燥或80-130℃喷雾干燥或0.5-200Kw微波辅助干燥，得到柱层析乙醇溶液洗脱组分；
(6)将得到的乙醇洗脱组分分散在水中，上柱进行第三次柱层析，依次分别采用不同浓度的甲醇水溶液进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，得到系列洗脱溶液；层析柱填料为sephadex LH-20，悬液与树脂的质量比为1:2-1:100，洗脱用的甲醇溶液质量浓度为0-90％，分1-8个梯度进行洗脱，每个梯度洗脱的体积为1-10个柱体积(BV)；
(7)将某些梯度的甲醇溶液洗脱液30-90℃减压浓缩，20-100℃真空干燥或80-130℃喷雾干燥；得到第三次柱层析甲醇溶液洗脱组分，称之为桃分离组分；
(8)将金佛手打浆，与水混合，微波辅助萃取，过滤，得到水提液，减压浓缩，喷雾干燥得到佛手提取物；具体条件为：金佛手与溶剂的质量比为1:3-1:80；微波功率为0.5-4000Kw,提取时间为1-1500min，30-90℃减压浓缩；
(9)取桃分离组分1份，加入佛手提取物1-10份，加入，混合均匀，得到所述的一种细菌生物膜清除剂。
本发明利用上述方法制备得到的一种细菌生物膜清除剂。
本发明还利用上述细菌生物膜清除剂应用到化妆品、食品和药品领域。
本发明的第二个目的是提供一种上述细菌生物膜清除剂在食品加工设备、化妆品加工设备、自来水管道、工业管道、通风设备和医疗器械清洁方面的应用。
本发明的第三个目的是提供一种食品加工设备的抑菌清洁方法，将上述生物膜清除剂喷洒于经过清洁后的食品加工设备上。
本发明的第四个目的是提供一种食品保鲜的方法，将上述生物膜抑制剂喷洒于待保鲜处理的食品表面。
有益效果：
本发明抑制剂采用了可食用、安全性高的桃分离组分作为主要活性成分，佛手提取物作为辅助组分，能够协同配合，影响细菌生物膜的生理功能，显著增强了这一清除剂的清除生物膜效果，生物膜的清除效果达96％。本发明的生物膜清除剂全部采用天然原料，显著改善了安全性，副作用显著降低。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
下列实施例中，桃子使用源东蜜桃，佛手使用金佛手。
生物膜清除实验参考国内外通用的实验方法进行。取1克生物膜清除剂样品，加入1000mL水混匀，备用。在96孔板中先加入金黄色葡萄球菌悬液，37℃培养24h后，弃去浮游菌，并用磷酸盐缓冲液洗涤3次；然后加入培养基，加入清除剂溶液，空白组为不加入清除剂，然后37℃下恒温培养4h。
采用结晶紫染色法对生物膜进行分析。恒温培养完成后，弃去浮游菌，洗涤3次，60℃干燥固定。然后每孔加入0.1％(w/v)结晶紫溶液200μL，染色5min后，洗涤冲去多余结晶紫染色液，37℃下进行干燥，再加入200μL 95％的乙醇进行溶解，30min后于595nm处测OD值，计算生物膜清除率。
生物膜清除率＝(未加入清除剂溶液的样品的OD-加入清除剂溶液的样品的OD)/未加入清除剂溶液的样品的OD。
实施例1：
将10公斤源东蜜桃打浆，与80公斤水混合，3000W微波辅助萃取50min，过滤，得到水提液，60℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物；将浓缩物分散于水中，得到悬液，上大孔树脂柱进行层析，上样量为10％，依次分别采用水，10％，20％，30％，50％，60％，70％的乙醇溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱的体积为5个柱体积(BV)；将50％梯度的乙醇溶液洗脱液50℃减压浓缩，70℃真空干燥；得到第一次柱层析乙醇溶液洗脱组分；
将得到的乙醇洗脱组分分散在水中，上聚酰胺柱进行第二次柱层析，上样量为6％，依次分别采用水、10％，20％，50％，60％，70％的乙醇溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱的体积为5个柱体积(BV)；
将60％的乙醇溶液洗脱液60℃减压浓缩，60℃真空干燥，得到柱层析乙醇溶液洗脱组分；
将得到的乙醇洗脱组分分散在水中，上sephadex LH-20柱进行第三次柱层析，上样量为5％，依次分别采用水、10％，15％，30％，40％，50％，60％甲醇水溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱的体积为5个柱体积(BV)，分别收集洗脱液；
将50％甲醇溶液洗脱液50℃减压浓缩，60℃喷雾干燥；得到第三次柱层析甲醇溶液洗脱组分，称之为桃醇提物。
实施例2：一种细菌生物膜清除剂
取1公斤金佛手打浆，加入10升水，1000W微波辅助萃取30min，过滤，得到水提液，50℃减压浓缩，100℃喷雾干燥得到佛手提取物。
取实施例1制备的桃醇提物10份，加入佛手提取物5份，混合均匀，得到细菌生物膜清除剂。
实施例3：一种细菌生物膜清除剂的制备方法
将10公斤源东蜜桃打浆，与80公斤水混合，3000W微波辅助萃取50min，过滤，得到水提液，60℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物；将浓缩物分散于水中，得到悬液，上大孔树脂柱进行层析，上样量为10％，依次分别采用水，10％，20％，30％，50％，60％，70％的乙醇溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱的体积为5个柱体积(BV)；将50％梯度的乙醇溶液洗脱液50℃减压浓缩，70℃真空干燥；得到第一次柱层析乙醇溶液洗脱组分；
将得到的乙醇洗脱组分分散在水中，上聚酰胺柱进行第二次柱层析，上样量为6％，依次分别采用水、10％，20％，50％，60％，70％的乙醇溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱的体积为5个柱体积(BV)；
将60％的乙醇溶液洗脱液60℃减压浓缩，60℃真空干燥，得到柱层析乙醇溶液洗脱组分，即桃分离组分；
将得到的乙醇洗脱组分分散在水中，上sephadex LH-20柱进行第三次柱层析，上样量为5％，依次分别采用水、10％，15％，30％，40％，50％，60％甲醇水溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱的体积为5个柱体积(BV)，分别收集洗脱液；
将50％甲醇溶液洗脱液50℃减压浓缩，60℃喷雾干燥；得到第三次柱层析甲醇溶液洗脱组分，称之为桃醇提物；
取1公斤金佛手打浆，加入10升水，1000W微波辅助萃取30min，过滤，得到水提液，50℃减压浓缩，100℃喷雾干燥得到佛手提取物；
取佛手提取物10份，加入桃醇提物2份，混合均匀，得到所述的可用于化妆品和食品药品的细菌生物膜清除剂。
实施例4：一种细菌生物膜清除剂的制备方法
将100公斤源东蜜桃打浆，与1000公斤水混合，微波辅助萃取，过滤，得到水提液，60℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物；将浓缩物分散于水中，得到悬液，上大孔树脂柱进行层析，上样量为20％，依次分别采用水，5％，23％，30％，50％，70％的乙醇溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱的体积为5个柱体积(BV)；将50％梯度的乙醇溶液洗脱液60℃减压浓缩，50℃真空干燥；得到第一次柱层析乙醇溶液洗脱组分；
将得到的乙醇洗脱组分分散在水中，上C18柱进行第二次柱层析，上样量为8％，依次分别采用水、15％，30％，40％，70％的乙醇溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱的体积为3个柱体积(BV)；
将40％的乙醇溶液洗脱液60℃减压浓缩，60℃真空干燥，得到柱层析乙醇溶液洗脱组分；
将得到的乙醇洗脱组分分散在水中，上sephadex LH-20柱进行第三次柱层析，上样量为6％，依次分别采用水、15％，20％，35％，40％，50％，60％甲醇水溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱的体积为4个柱体积(BV)，分别收集洗脱液；
将50％甲醇溶液洗脱液60℃减压浓缩，70℃喷雾干燥；得到第三次柱层析甲醇溶液洗脱组分，称之为桃醇提物；
取5公斤金佛手打浆，加入30升水，3000W微波辅助萃取50min，过滤，得到水提液，60℃减压浓缩，105℃喷雾干燥得到佛手提取物；
取佛手提取物20份，加入桃分离组分3份，混合均匀，得到所述的可用于化妆品和食品药品的细菌生物膜清除剂。
实施例5：一种细菌生物膜清除剂的制备方法
将1公斤源东蜜桃打浆，与10公斤水混合，3000W微波辅助萃取50min，过滤，得到水提液，60℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物；将浓缩物分散于水中，得到悬液，上大孔树脂柱进行层析，上样量为18％，依次分别采用水，15％，25％，30％，55％，70％的乙醇溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱的体积为5个柱体积(BV)；将55％梯度的乙醇溶液洗脱液60℃减压浓缩，50℃真空干燥；得到第一次柱层析乙醇溶液洗脱组分；
将得到的乙醇洗脱组分分散在水中，上C18柱进行第二次柱层析，上样量为10％，依次分别采用水，10％，30％，50％，70％的乙醇溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱的体积为3个柱体积(BV)；
将50％的乙醇溶液洗脱液50℃减压浓缩，60℃真空干燥，得到柱层析乙醇溶液洗脱组分；
将得到的乙醇洗脱组分分散在水中，上sephadex LH-20柱进行第三次柱层析，上样量为7％，依次分别采用水、5％，20％，35％，40％，50％，60％甲醇水溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱的体积为5个柱体积(BV)，分别收集洗脱液；
将50％甲醇溶液洗脱液60℃减压浓缩，60℃喷雾干燥；得到第三次柱层析甲醇溶液洗脱组分，称之为桃醇提物；
取2公斤金佛手打浆，加入16升水，1000W微波辅助萃取30min，过滤，得到水提液，60℃减压浓缩，100℃喷雾干燥得到佛手提取物；
取佛手提取物30份，加入桃分离组分16份，混合均匀，得到所述的可用于化妆品和食品药品的细菌生物膜清除剂。
实施例6：一种食品加工设备材料-不锈钢表面生物膜的清除方法
一种食品加工设备材料-不锈钢表面生物膜的清除方法，向96孔酶标板中添加100μL白假丝酵母菌悬液，并在35℃下培养24h以预先形成生物膜。培养后，使用PBS洗涤以弃去浮游菌，并将含有不同浓度的前述的生物膜清除剂的RPMI-1640培养基添加到孔板中，其中生物膜清除剂的终浓度分别为0.062、0.125、0.25和0.5mg/mL。将清洁且无菌的不锈钢片分别加入到孔板的每个孔中，将孔板盖上盖子，并在35℃下再孵育4h。然后采用结晶紫染色法进行测定。在96孔板孵育适当时间后将不锈钢片取出，洗涤后，60℃下干燥固定。然后将不锈钢片分别加入到另一块干净的96孔板的孔中，每孔加入0.1％(w/v)结晶紫溶液200μL，染色5min后，洗涤冲去多余结晶紫染色液，37℃下进行干燥，再加入200μL0 33％冰乙酸进行溶解，10min后于595nm处测定吸光值。将得到的结果根据以下公式计算生物膜清除率：清除率(％)＝(OD对照组-OD实验组)/OD对照组×100。
成熟的生物被膜结构紧实稳定，不易破坏，一般抑菌剂很难减少或清除成熟的生物被膜。结果表明，本生物膜清除剂对白假丝酵母预形成的生物膜具有显著的清除作用，并具有浓度依赖性，这意味着浓度越高，其清除作用就越强。当浓度为0.5mg/mL时，清除率为83.14％.结果表明本发明的生物膜清除剂能够将食品加工设备材料-不锈钢表面的白假丝酵母生物膜有效清除。
实施例7：一种食品保鲜的方法
一种鸡肉保鲜的方法，用无菌刀具在超微工作台中将鸡胸肉切为70g左右的肉块，同时将肉块分为生物膜抑制剂组、对照组(蒸馏水处理)两组，待用。本实验采用浸泡法处理样品，将切好的肉块置于不同的保鲜液以及无菌水中2min，沥干水后并用无菌保鲜膜包裹，尽量使肉块隔绝空气，最后置于4℃冰箱中保存。分别在0、3、6、9、12、15d测定肉块的pH、挥发性盐基氮(Total volatile base nitrogen，TVB-N)、表面菌落总数等指标，以综合评价肉块在贮存过程中的质量。其中pH的测定方法参考国标GB 5009.237-2016所述方法，挥发性盐基氮(Total volatile base nitrogen，TVB-N)的测定按照国标GB 5009.228-2016所述方法进行。表面菌落总数的测定参照国标GB/T 4789.17-2003中规定的方法进行。
肉类样品储藏期间pH的变化非常重要，因为它影响着肉制品的诸多质量因素，包括颜色、质地、风味等。结果表明，不同处理组的鸡胸肉的pH是在5.86～6.83之间，且随着贮藏时间的延长，pH值逐渐升高，腐败程度逐渐增加。在整个贮藏过程中，与生物膜抑制剂组相比，对照组肉样的pH值上升速度最快，且在第9d时，其pH值为6.75，超出鲜肉的pH标准6.7，成为变质肉；在0～6d内，生物膜抑制剂组的pH值显著性低于对照组(p<0.05)，这说明处理组对蛋白质分解的抑制效果明显强于对照组，从而能够更好地延缓肉制品的腐败。随着储藏时间的延长，在第12d时，生物膜抑制剂组的肉样的pH值为6.52，依然处于次冷鲜肉的范畴。因此，综合肉类样品的pH变化分析，与对照组相比，处理组可以将鸡胸肉样品的储藏期延长6d，这说明生物膜抑制剂可以对肉类样品的品质起到一定的改善作用。
TVB-N值是评价肉类变质最常用的指标之一。由于在食品腐败微生物的作用下，蛋白质和含氮非蛋白质降解产生一些挥发性的碱性含氮物质，如氨，以及一级、二级和三级胺(二甲胺、三甲胺)从而导致肉类变质。结果表明随着贮藏时间的延长，对照组、处理组中肉类样品的TVB-N值均呈现明显上升的趋势。在整个贮藏时间内，空白组肉样的TVB-N值的变化趋势最明显，其值明显高于处理组肉样的TVB-N值，这说明添加本发明的抑制剂对抑制鸡胸肉样品的腐败起到了一定的延缓作用。在第9d时，空白组肉样的TVB-N值为25.1，已达到变质肉的水平，而生物膜抑制剂组在第15d时还未达到变质肉的水平，
在整个15d的贮藏时间内，所有组的菌落总数都有所增加，且贮藏时间在0～12d内，与对照组相比，生物膜抑制剂的处理能够显著性地抑制细菌的生长(p<0.05)。同时，当贮藏时间为9d时，对照组肉样的菌落总数大于6，达到变质肉的水平，而生物膜抑制剂组的菌落总数为5.33，依然处于次鲜肉的水平。第15d时，生物膜抑制剂组的肉样菌落总数仍低于变质肉的水平。综上可知，与对照组相比，生物膜抑制剂组可以更好地抑制细菌的生长，而且将鸡肉的保质期延长6天以上。
对比例1：
取实施例1佛手提取物10份，实施例1桃醇提取物0份，混合均匀，得到细菌生物膜清除剂。
对比例2：
取实施例1佛手提取物0份，实施例1桃醇提取物5份，混合均匀，得到细菌生物膜清除剂。
对比例3：
取实施例1佛手提取物10份，实施例1桃醇提取物0.1份，混合均匀，得到细菌生物膜清除剂。
对比例4：
取5公斤苹果打浆，加入30升水，3000W微波辅助萃取50min，过滤，得到水提液，60℃减压浓缩，105℃喷雾干燥得到苹果提取物
取实施例1佛手提取物10份，加入苹果提取物5份，混合均匀，得到细菌生物膜清除剂。
将实施例和对比例1-2的细菌生物膜清除剂进行测试，结果见表1。
表1不同实验组的清除剂对生物膜的清除结果
| 生物膜清除率 | |
| 实施例2 | 96％ |
| 实施例3 | 87％ |
| 实施例4 | 81％ |
| 对比例1 | 7％ |
| 对比例2 | 53％ |
| 对比例3 | 16％ |
| 对比例4 | 8％ |
测定结果表明，实施例1制得的含有佛手提取物10份和桃分离组分5份的清除剂能够显著清除细菌生物膜，清除率达96％。实施例2和实施例3含有的佛手提取物和桃分离组分的比例都在权利要求书的范围之内，所以都具有很好的清除生物膜能力，清除率为81％和87％。
而对于单纯的含有佛手提取物的清除剂，在同等使用浓度下，并没有表现出显著的生物膜清除能力。而对于单纯的含有桃分离组分清除剂样品，在同等使用浓度下，对生物膜清除能力达到53％，表明本发明制得的桃分离组分在低浓度下即具有较强的生物膜清除活性，并且桃分离组分和佛手提取物会发生协同作用，从而能够非常显著的加强细菌生物膜清除能力，两者协同作用形成本发明所述的生物膜清除剂后(实施例1)，对生物膜的清除活性高达96％。
另外，如果桃分离组分的比例过小将无法起到对生物膜的清除效果，例如对比例3，其对生母的清除率只有16％。另外，桃分离组分是非常关键的，如果将桃分离组分用苹果提取物来代替，则该生膜清除剂对生物膜的清除率将非常低，仅有8％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种细菌生物膜清除剂的制备方法，其特征在于，制备方法具体如下：
①制备桃醇提物；
②将步骤①制备得到的桃醇提物与佛手提取物进行复配，得到细菌生物膜清除剂。
2.根据权利要求1所述的细菌生物膜清除剂的制备方法，其特征在于，桃醇提物和佛手提取物的质量比为1：1-1：10。
3.根据权利要求1所述的细菌生物膜清除剂的制备方法，其特征在于，所述桃醇提物的制备包括以下步骤：
(1)将桃打浆，与水混合，微波辅助萃取，过滤，得到水提液，浓缩至无溶剂，得到浓缩物；
(2)将步骤(1)得到的浓缩物分散于水中，得到悬液，上柱进行层析，依次分别采用不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，得到系列洗脱溶液，再进行减压浓缩，干燥得到第一次柱层析乙醇溶液洗脱组分；
(3)反复重复步骤(2)，得到桃醇提物。
4.根据权利要求3所述的细菌生物膜清除剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体条件为：蜜桃浆与溶剂的质量比为1:5-1:80；微波功率为0.1-3500Kw,提取时间为0.2-1500min，30-90℃减压浓缩。
5.根据权利要求3所述的细菌生物膜清除剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)重复1-3次。
6.根据权利要求3所述的细菌生物膜清除剂的制备方法，其特征在于，第一次步骤(2)的具体条件为：层析柱填料为大孔树脂或离子交换树脂，浓缩物与水的质量比为1:1-1:50，悬液与树脂的质量比为1:2-1:100，洗脱用的乙醇溶液质量浓度为0-70％，分2-8个梯度进行洗脱，每个梯度洗脱的体积为1-10个柱体积；和/或，第二次步骤(2)的具体条件为：层析柱填料为聚酰胺树脂或C18树脂，乙醇洗脱组分与水的质量比为1:1-1:50，悬液与树脂的质量比为1:2-1:100，洗脱用的乙醇溶液质量浓度为0-70％，分2-8个梯度进行洗脱，每个梯度洗脱的体积为1-10个柱体积；和/或，第三次步骤(2)的具体条件为：层析柱填料为sephadexLH-20，悬液与树脂的质量比为1:2-1:100，洗脱用的甲醇溶液质量浓度为0-90％，分1-8个梯度进行洗脱，每个梯度洗脱的体积为1-10个柱体积。
7.权利要求1～6任一项所述方法制备得到的细菌生物膜清除剂。
8.权利要求7所述的细菌生物膜清除剂在食品加工设备、化妆品加工设备、自来水管道、工业管道、通风设备和医疗器械清洁方面的应用。
9.一种食品加工设备的抑菌清洁方法，其特征在于，将权利要求7所述的生物膜清除剂喷洒于经过清洁后的食品加工设备上。
10.一种食品保鲜的方法，其特征在于，将权利要求7所述的生物膜抑制剂喷洒于待保鲜处理的食品表面。
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| GR01 | Patent grant | ||
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