CN107815486A - 快速筛选产生沙门氏菌生物膜的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明快速筛选产生沙门氏菌生物膜的方法，是在无菌条件下用接种环取出低温保存的沙门氏菌，划线接种于无菌琼脂培养基；将BHI培养物在无菌条件下放置，吸取刚果红染液，加入培养皿内对菌落及菌苔染色；产生沙门氏菌生物膜菌落及菌苔外圈颜色变红，菌落及菌苔表面呈现粗糙状；不产膜沙门氏菌菌落及菌苔无明显变化；结晶紫染色确定包括：液体培养，生物膜固定，染色。本发明将刚果红与结晶紫染色法有机结合，既可保证检测特异性，又能确保结果的准确性，达到产生沙门氏菌生物膜特异性筛选之目标。筛选效率高，成本低，具有较高的科研与实践价值。

Description

快速筛选产生沙门氏菌生物膜的方法
技术领域
本发明涉及一种筛选产生沙门氏菌生物膜方法，具体是一种快速筛选产生沙门氏菌生物膜的方法，属于微生物领域。
背景技术
沙门氏菌（Salmonella）是一种公共卫生学上有重要意义的人畜共患病病原菌，沙门氏菌产生的生物膜会赋予其对pH值、干燥度、渗透压、温度、抗菌素及消毒剂等不利条件的抵抗能力，使得沙门氏菌可在酸性胃液环境、含水量较低、含糖或含盐量较高的食品中存活，增加了沙门氏菌到达人体肠道引起感染的机率，可能导致食物中毒。此外，生物膜一旦形成还可削弱抗菌药物对细菌的杀灭作用，导致抗生素治疗无效。与此同时，生物膜可使沙门氏菌在食品加工过程中非常容易的黏附在操作台面、器械、管道或传输带表面，不能被正常的清洗去除，存在极大的食品安全隐患。
目前针对产生细菌生物膜研究的菌种主要集中于葡萄球菌，其检测的方法主要有刚果红培养基检测法、半定量粘附法、银染法、扫描电镜或激光共聚焦扫描显微镜、PCR扩增icaA基因等多种方法。而关于产生沙门氏菌生物膜的研究报道较少，尚未见有关产生沙门氏菌生物膜特异性快速筛选和方法。虽然微孔板-结晶紫染色法可筛选产生沙门氏菌生物膜，但因存在结果不稳定、重复间差异较大、操作复杂且对筛选条件要求高等因素，筛选效率低，不能作为快速高效的筛选方法。建立一种快速、高效且特异性强的产生沙门氏菌生物膜筛选方法具有重要的理论和实践意义。
发明内容
本发明为解决目前产生沙门氏菌生物膜筛选过程中特异性差、筛选效率低等问题，而公开一种快速筛选产生沙门氏菌生物膜的方法。
本发明是通过以下操作步骤实施完成:
a.菌种活化与接种：用接种环取出保存在-75℃~-80℃的沙门氏菌，划线接种到无菌Luria-Bertani（LB）琼脂培养基表面，35℃~37℃培养18h~20h；无菌条件下用接种环取单菌落，划线接种于无菌Brian Heart Infusion（BHI）琼脂培养基，35℃~37℃培养18h~24h；
b.培养与刚果红染色：将BHI培养物在无菌条件下22℃~25℃放置20h~24h，吸取3mL~5mL 0.08%的刚果红染液，加入培养皿内对菌落及菌苔染色30s~45s；
c.结果判定：产生沙门氏菌生物膜菌落及菌苔外圈颜色变红，菌落及菌苔表面呈现粗糙状；不产膜沙门氏菌菌落及菌苔无明显变化；
d.结晶紫染色确定：
d.1液体培养：取玻璃试管3支，分别向其中加入5mL~8mL BHI肉汤培养基；121℃~126℃灭菌15min~20min；无菌条件下，取一个经刚果红染色后初步确定为可以产生生物膜的菌株的单菌落，将其均匀分散于冷却至室温的BHI肉汤，35℃~37℃静置培养40h~48h；
d.2生物膜固定：培养结束后弃去管内培养物，用无菌水轻轻冲洗试管壁，去除浮游菌及培养基残留，向试管中加入6mL~10mL甲醇，静置5min~8min后弃去甲醇，晾干试管；
d.3染色：向试管中加入100μL~150μL0.1%结晶紫，轻轻转动试管，使结晶紫与管内生物膜附着面充分接触，染色5min~8min后弃去染液，如在沙门氏菌培养液面与试管接触处形成粗糙的紫色圈，则表明该菌产生生物膜，生物膜产生能力越强，紫色圈越粗、越明显。
本发明将刚果红与结晶紫染色法有机结合，建立的新方法既可保证检测特异性，又能确保结果的准确性，达到产生沙门氏菌生物膜特异性筛选之目标。筛选效率高，成本低，具有较高的科研与实践价值。
具体实施方式
本发明具体通过以下操作实施:
a.菌种活化与接种：用接种环取出保存在-80℃的沙门氏菌，无菌条件下划线接种到无菌Luria-Bertani（LB）琼脂培养基表面，37℃培养18h；无菌条件下用接种环在LB琼脂培养基上取单菌落，划线于无菌BHI琼脂培养基，37℃培养24h；
b.培养与刚果红染色：将BHI培养物在无菌条件下22℃静置24h，吸取5mL 0.08%的刚果红溶液，加入BHI培养皿内对菌落及菌苔染色40s；
c.结果判定：产生沙门氏菌生物膜菌落及菌苔外圈颜色变红，菌落及菌苔表面呈现粗糙状；不产生物膜沙门氏菌菌落及菌苔无明显变化；
d.结晶紫染色确定：
d.1液体培养：取15mm×100mm玻璃试管3支，分别向其中加入5 mL BHI肉汤培养基，121℃灭菌15min；无菌条件下，取一个经刚果红染色后初步确定为可以产生生物膜的菌株的单菌落，将其均匀分散于冷却至室温的BHI肉汤，37℃静置培养48h；
d.2生物膜固定：培养结束后弃去试管内培养物，用无菌水轻轻冲洗试管壁，去除浮游菌及培养基残留；向试管中加入8mL甲醇，静置6min后弃去甲醇，晾干试管；
d.3染色：向试管中加入120μL0.1%结晶紫溶液，轻轻转动试管，使结晶紫与管内生物膜附着面充分接触，染色6min后弃去染液；如在沙门氏菌培养液面与试管接触处形成粗糙的紫色圈，则表明该沙门氏菌菌株产生生物膜；生物膜产生能力越强，紫色圈越粗、越明显。

Claims (2)

1.快速筛选产生沙门氏菌生物膜的方法，其特征在于是通过以下操作步骤实施完成:
a.菌种活化与接种：用接种环取出保存在-75℃~-80℃的沙门氏菌，划线接种到无菌Luria-Bertani（LB）琼脂培养基表面，35℃~37℃培养18h~20h；无菌条件下用接种环取单菌落，划线接种于无菌Brian Heart Infusion（BHI）琼脂培养基，35℃~37℃培养18h~24h；
b.培养与刚果红染色：将BHI培养物在无菌条件下22℃~25℃放置20h~24h，吸取3mL~5mL 0.08%的刚果红染液，加入培养皿内对菌落及菌苔染色30s~45s；
c.结果判定：产生沙门氏菌生物膜菌落及菌苔外圈颜色变红，菌落及菌苔表面呈现粗糙状；不产膜沙门氏菌菌落及菌苔无明显变化；
d.结晶紫染色确定：
d.1液体培养：取玻璃试管3支，分别向其中加入5mL~8mL BHI肉汤培养基；121℃~126℃灭菌15min~20min；无菌条件下，取一个经刚果红染色后初步确定为可以产生生物膜的菌株的单菌落，将其均匀分散于冷却至室温的BHI肉汤，35℃~37℃静置培养40h~48h；
d.2生物膜固定：培养结束后弃去管内培养物，用无菌水轻轻冲洗试管壁，去除浮游菌及培养基残留，向试管中加入6mL~10mL甲醇，静置5min~8min后弃去甲醇，晾干试管；
d.3染色：向试管中加入100μL~150μL0.1%结晶紫，轻轻转动试管，使结晶紫与管内生物膜附着面充分接触，染色5min~8min后弃去染液，如在沙门氏菌培养液面与试管接触处形成粗糙的紫色圈，则表明该菌产生生物膜，生物膜产生能力越强，紫色圈越粗、越明显。
2.根据权利要求1所述的快速筛选产生沙门氏菌生物膜的方法，其特征在于是通过以下操作步骤实施完成:
a.菌种活化与接种：用接种环取出保存在-80℃的沙门氏菌，无菌条件下划线接种到无菌Luria-Bertani（LB）琼脂培养基表面，37℃培养18h；无菌条件下用接种环在LB琼脂培养基上取单菌落，划线于无菌BHI琼脂培养基，37℃培养24h；
b.培养与刚果红染色：将BHI培养物在无菌条件下22℃静置24h，吸取5mL 0.08%的刚果红溶液，加入BHI培养皿内对菌落及菌苔染色40s；
c.结果判定：产生沙门氏菌生物膜菌落及菌苔外圈颜色变红，菌落及菌苔表面呈现粗糙状；不产生物膜沙门氏菌菌落及菌苔无明显变化；
d.结晶紫染色确定：
d.1液体培养：取15mm×100mm玻璃试管3支，分别向其中加入5 mL BHI肉汤培养基，121℃灭菌15min；无菌条件下，取一个经刚果红染色后初步确定为可以产生生物膜的菌株的单菌落，将其均匀分散于冷却至室温的BHI肉汤，37℃静置培养48h；
d.2生物膜固定：培养结束后弃去试管内培养物，用无菌水轻轻冲洗试管壁，去除浮游菌及培养基残留；向试管中加入8mL甲醇，静置6min后弃去甲醇，晾干试管；
d.3染色：向试管中加入120μL0.1%结晶紫溶液，轻轻转动试管，使结晶紫与管内生物膜附着面充分接触，染色6min后弃去染液；如在沙门氏菌培养液面与试管接触处形成粗糙的紫色圈，则表明该沙门氏菌菌株产生生物膜；生物膜产生能力越强，紫色圈越粗、越明显。
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