CN112129610B - 一种细菌荚膜染色方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细菌荚膜染色方法及其用途，属于细菌染色技术领域，包括以下步骤：S1：先将1‑3滴A液滴加于洁净玻片上，后将细菌加入A液中涂匀；S2：将S1步骤得玻片自然干燥；S3：用B液涂抹S2步骤得玻片，染色3‑6min；S4：用水冲洗S3步骤得玻片后二次自然干燥；S5：将S4步骤得玻片置于光学显微镜下镜检；A液为：将刚果红溶于蒸馏水中形成；B液为：将品红、氯化铁、乙酸和液化苯酚混合均匀形成。本发明染色方法染色速度快，染色效果好，使荚膜和背景、荚膜和菌体之间的染色反差明显，利于观察荚膜的厚度及菌体和荚膜之间的关系，可用于肺炎克雷伯菌荚膜染色，可快速有效地区分肺炎克雷伯菌的高毒力菌株。
Description
技术领域
本发明属于细菌染色技术领域，具体涉及一种细菌荚膜染色方法及其用途。
背景技术
细菌为原核细胞型微生物的典型代表，具有单细胞、形体微小、结构简单、代谢活跃、繁殖迅速等特点。了解细菌的细胞形态结构等基本性状，对研究细菌的致病性和免疫性、鉴别细菌、诊断和防治细菌性感染等具有重要的理论和实际意义。荚膜属于细菌的特殊结构，它是某些细菌在其细胞壁外包绕的一层液性物质，其成分为多糖，糖蛋白或多肽。荚膜是细菌致病重要的毒力因子，也是鉴别细菌的重要标志，因此，细菌荚膜染色是一种重要的染色方法。荚膜的化学成分对染料结合力很弱，不容易着色，而且可溶于水，易在水洗时被除去。所以，一般采用衬托染色法(负染色法)使菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体周围形成一透明圈(即荚膜)。市面上的荚膜染色液主要是根据染液中的不同成分使菌体和背景呈现不同颜色来衬托出不着色的荚膜，目前市面成品的荚膜染液：
1.负染色法
成分：黑素(把背景染成灰色)，复红(把菌体染成红色)；
制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取少量菌体放入水滴中混匀并涂布；
干燥：将涂片放在空气中晾干，或用电吹风冷风吹干；
染色：在涂面上加复红染色液染色2-3min；
水洗：用水洗去复红染液；
干燥：将染色片放空气中晾干，或用电吹风冷风吹干；
涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使黑素沿玻片边缘散开，然后向右拖展，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干；
镜检：先低倍镜，再高倍镜观察；
结果：背影灰色，菌体红色，荚膜无色透明。
2.湿墨水法
成分：墨水(把背景染成灰色，菌体较暗)；
制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀；
加盖玻片：放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液；
镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察；
结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。
3.干墨水法
成分：墨水(把背景染成灰色)，甲基紫(把菌体染成紫色)；
制菌液：加1滴6％葡萄糖液于洁净载玻片一端，挑少量菌与其充分混合，再加1环墨水，充分混匀；
制片：左手执载玻片，右手拿一边缘光滑的盖玻片，使其一边与菌液接触、菌液沿玻片接触处散开，然后以30度角，迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端，使菌液铺成一薄膜；
干燥：空气中自然干燥；
固定：用甲醇浸没涂片，固定1min，立即倾去甲醇；
干燥：在酒精灯上方，用文火干燥；
染色：用甲基紫染1-2min；
水洗：用蒸馏水轻洗，自然干燥；
镜检：先用低倍镜再高倍镜观察；
结果：背景灰色，菌体紫色，荚膜呈一清晰透明圈。
4.Tyler法
成分：20％CuSO4水溶液(把背景染成蓝紫色)，结晶紫(把菌体染成紫色)
涂片：按常规法涂片，可多挑些菌体与水充分混合，并将粘稠的菌液尽量涂开，但涂布的面积不宜过大；
干燥：在空气中自然干燥；
染色：用Tyler染色液染5～7min；
脱色：用20％CuSO4水溶液洗去结晶紫，脱色要适度(冲洗2遍)→用吸水纸吸干→立即加1～2滴香柏油于涂片处，以防止CuSO4结晶的形成；
镜检：先用低倍镜再用高倍镜观察；
结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。
但是由于荚膜染料的相互作用不同，并非所有方法都能充分展示细菌荚膜，因此我们探索出新的荚膜染色方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种染色速度快，染色效果好，使荚膜和背景、荚膜和菌体之间的染色反差明显，利于观察荚膜的厚度以及菌体和荚膜之间的关系的细菌荚膜染色方法。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种细菌荚膜染色方法，包括以下步骤：
S1：先将1-3滴A液滴加于洁净玻片上，后将细菌加入A液中涂匀；
S2：将S1步骤得玻片自然干燥；
S3：用B液涂抹S2步骤得玻片，染色3-6min；
S4：用水冲洗S3步骤得玻片后二次自然干燥；
S5：将S4步骤得玻片置于光学显微镜下镜检；
A液为：将刚果红溶于蒸馏水中形成；B液为：将品红、氯化铁、乙酸和液化苯酚混合均匀形成。
本发明荚膜染色方法首先将细菌和A液混合，A液中碱性染料刚果红使背景呈现红色，不需要加热即能在玻片上形成红色背景且染色更佳均匀，减少了生物安全的隐患，以免荚膜受热失水皱缩变形；然后利用B液中酸性染料品红与细菌结合使其染成红色，同时B液中氯化铁、乙酸和液化苯酚能相互作用使荚膜稳定且保持透明，使荚膜区域不着色，呈白色透明状，从而使荚膜和背景、荚膜和菌体之间的染色反差明显，使荚膜更易于观察，容易辨认，利于观察荚膜的厚度以及菌体和荚膜之间的关系，大大提高了细菌鉴定的准确性；因此，本发明荚膜染色方法染色速度快，染色效果好，且简单易行，节约时间，易推广，适用于大量染片。此外，本发明荚膜染色方法用于肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)荚膜染色，能充分展示肺炎克雷伯菌荚膜，可以快速有效地区分肺炎克雷伯菌的高毒力菌株，且荚膜染色仅需10min就能迅速地对细菌地毒力进行初步判断，大大节约提高了鉴别该菌的高毒力菌株的效果。
优选地，A液中刚果红和蒸馏水的用量比为0.8-1.1g:100mL。
优选地，B液中品红、氯化铁、乙酸和液化苯酚的用量比为0.014-0.020g:1g:1.5-1.8mL:1.0-1.5mL。
优选地，液化苯酚中含苯酚不得少于88.0g/g。液化苯酚的制备方法为：取900g苯酚于广口瓶中，加水适量，置水浴上缓缓加热，液化后，放冷，添加适量的水，使成1000g，搅匀，即得。
优选地，染色方法的染色效果为：背景红色、菌体红色、荚膜白色。
本发明还公开了上述细菌荚膜染色方法在肺炎克雷伯菌染色中的用途。
本发明还公开了上述细菌荚膜染色方法在鉴别高毒力肺炎克雷伯菌中的用途。
本发明还公开了一种肺炎克雷伯菌荚膜染色液，包括：
-A液，将刚果红溶于蒸馏水中形成；
-B液，将品红、氯化铁、乙酸和液化苯酚混合均匀形成；
其中，A液中刚果红和蒸馏水的用量比为0.8-1.1g:100mL；
B液中品红、氯化铁、乙酸和液化苯酚的用量比为0.014-0.020g:1g:1.5-1.8mL:1.0-1.5mL。
本发明染色液的A液中碱性染料刚果红使背景呈现红色，B液中酸性染料品红与细菌结合使其染成红色，同时B液中氯化铁、乙酸和液化苯酚能相互作用使荚膜稳定且保持透明，使荚膜区域不着色，呈白色透明状，从而使荚膜和背景、荚膜和菌体之间的染色反差明显，使荚膜更易于观察，利于观察荚膜的厚度以及菌体和荚膜之间的关系；本发明荚膜染色液染色速率快，大大节约时间，提高效率；本发明染色液用于肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)荚膜染色，能充分展示肺炎克雷伯菌荚膜，可以快速有效地区分肺炎克雷伯菌的高毒力菌株，且荚膜染色仅需10min就能迅速地对细菌地毒力进行初步判断，大大节约提高了鉴别该菌的高毒力菌株的效果。
本发明还公开了一种快速鉴别高毒力肺炎克雷伯菌的方法，包括以下步骤：
S1：先将1-3滴A液滴加于洁净玻片上，后将细菌加入A液中涂匀；
S2：将S1步骤得玻片自然干燥；
S3：用B液涂抹S2步骤得玻片，染色3-6min；
S4：用水冲洗S3步骤得玻片后二次自然干燥；
S5：将S4步骤得玻片置于油镜下镜检。
与经典型肺炎克雷伯菌相比，高毒力肺炎克雷伯菌往往表现出更强的毒力特征，包括产生大量的荚膜多糖，抵抗中性粒细胞吞噬，引起严重侵袭性感染并发生远处转移等。而荚膜多糖是荚膜的主要成分，同时荚膜是细菌的一个重要毒力因子，因此荚膜是一种潜在的用于衡量肺炎克雷伯菌毒力的检测指标。本发明鉴别方法依据改进的荚膜染色方法，充分展示肺炎克雷伯菌荚膜，可以快速有效地区分肺炎克雷伯菌的高毒力菌株，仅需10min就能迅速地对细菌地毒力进行初步判断，可以较好的为一线临床有效区分肺炎克雷伯菌的高毒力菌株，以弥补现有技术中高毒力肺炎克雷伯菌的鉴别方法中存在的问题。此外，与确诊的高毒力菌株进行比较，本发明鉴别方法的检测效能高。
优选地，肺炎克雷伯菌鉴别前在哥伦比亚血琼脂上培养。更优选地，培养方法为：将肺炎克雷伯菌划线接种于哥伦比亚血琼脂上，在35-40℃、5％CO2的孵箱中培育培养18-32h。
优选地，高毒力株菌的荚膜厚度大于经典型株菌。
本发明由于采用了改进的荚膜染色液，因而具有如下有益效果：本发明荚膜染色方法避免了荚膜受热失水皱缩变形，使荚膜稳定且保持透明呈白色透明状，使荚膜和背景、荚膜和菌体之间的染色反差明显，利于观察荚膜的厚度以及菌体和荚膜之间的关系，大大提高了细菌鉴定的准确性；本发明荚膜染色方法染色速度快，染色效果好，且简单易行，节约时间，易推广，适用于大量染片；本发明荚膜染色方法用于肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)荚膜染色，能充分展示肺炎克雷伯菌荚膜，可以快速有效地区分肺炎克雷伯菌的高毒力菌株，且荚膜染色仅需10min就能迅速地对细菌地毒力进行初步判断，大大节约提高了鉴别该菌的高毒力菌株的效果。因此，本发明提供一种染色速度快，染色效果好，使荚膜和背景、荚膜和菌体之间的染色反差明显，利于观察荚膜的厚度以及菌体和荚膜之间的关系的细菌荚膜染色方法。
附图说明
图1为一种细菌荚膜染色方法的流程图；
图2为高毒力组肺炎克雷伯菌荚膜染色结果；
图3为高毒力组肺炎克雷伯菌荚膜染色结果；
图4为高毒力组肺炎克雷伯菌荚膜染色结果；
图5为高毒力组肺炎克雷伯菌荚膜染色结果；
图6为低毒力组肺炎克雷伯菌荚膜染色结果；
图7为B液的吸收光谱。
具体实施方式
本公开一种细菌荚膜染色方法及其用途，该染色方法染色速度快，染色效果好，使荚膜和背景、荚膜和菌体之间的染色反差明显，利于观察荚膜的厚度以及菌体和荚膜之间的关系。下面结合附图，对本公开的一种细菌荚膜染色方法及其用途进行详细介绍。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施方式中的特征可以相互组合。
参见图1所示，本公开实施例提供一种细菌荚膜染色方法，包括：
S1：先将1-3滴A液滴加于洁净玻片上，后将细菌加入A液中涂匀；
S2：将S1步骤得玻片自然干燥；
S3：用B液涂抹S2步骤得玻片，染色3-6min；
S4：用水冲洗S3步骤得玻片后二次自然干燥；
S5：将S4步骤得玻片置于光学显微镜下镜检；
A液为：将刚果红溶于蒸馏水中形成；B液为：将品红、氯化铁、乙酸和液化苯酚混合均匀形成。
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
实施例1：
一种细菌荚膜染色方法，参见图1所示，包括：
S1：先将2滴A液滴加于洁净玻片上，后将细菌加入A液中轻轻涂匀；
S2：将玻片自然干燥，在玻片上形成红色背景，不要加热；
S3：用B液轻轻涂抹玻片，染色5min；
S4：用水冲洗玻片后二次自然干燥；
S5：将玻片置于光学显微镜下镜检；
上述A液为：将1.0g刚果红溶于100mL蒸馏水中形成；B液为：将0.5g品红、30g氯化铁、50mL乙酸和39mL液化苯酚混合均匀形成。
实施例2：
一种细菌荚膜染色方法，参见图1所示，包括：
S1：先将1滴A液滴加于洁净玻片上，后将细菌加入A液中轻轻涂匀；
S2：将玻片自然干燥，在玻片上形成红色背景，不要加热；
S3：用B液轻轻涂抹玻片，染色3min；
S4：用水冲洗玻片后二次自然干燥；
S5：将玻片置于光学显微镜下镜检。
上述A液为：将0.8g刚果红溶于100mL蒸馏水中形成；B液为：将0.54g品红、30g氯化铁、45mL乙酸和33mL液化苯酚混合均匀形成。
实施例3：
一种细菌荚膜染色方法，参见图1所示，包括：
S1：先将3滴A液滴加于洁净玻片上，后将细菌加入A液中轻轻涂匀；
S2：将玻片自然干燥，在玻片上形成红色背景，不要加热；
S3：用B液轻轻涂抹玻片，染色6min；
S4：用水冲洗玻片后二次自然干燥；
S5：将玻片置于光学显微镜下镜检。
上述A液为：将1.1g刚果红溶于100mL蒸馏水中形成；B液为：将0.6g品红、30g氯化铁、54mL乙酸和43mL液化苯酚混合均匀形成。
实施例4：
一种快速鉴别高毒力肺炎克雷伯菌的方法，将36株血清型肺炎克雷伯菌(其中高毒力组16株，经典组20株)划线接种于哥伦比亚血琼脂基础培养基(购自北京科展生物科技有限公司)，在37℃、5％CO2的孵箱中培育培养24h，采用如下方法进行染色：
S1：先将2滴A液滴加于洁净玻片上，后将细菌加入A液中轻轻涂匀；
S2：将玻片自然干燥，在玻片上形成红色背景，不要加热；
S3：用B液轻轻涂抹玻片，染色5min；
S4：用水冲洗玻片后二次自然干燥；
S5：将玻片置于油镜下1000倍放大镜检。
上述A液为：将1.0g刚果红溶于100mL蒸馏水中形成；B液为：将0.5g品红、30g氯化铁、50mL乙酸和39mL液化苯酚混合均匀形成。
荚膜染色仅需10min就能迅速地对细菌地毒力进行初步判断，高毒力组和经典组差异显著，高毒力组16株菌在显微镜下可见清晰的荚膜，荚膜较厚；经典组20株菌的荚膜厚度较小，与高毒力组有显著差异。其中，部分肺炎克雷伯菌荚膜染色结果如图2-6，图2-5是高毒力组肺炎克雷伯菌菌株，图6是经典组肺炎克雷伯菌菌株。
实施例5：
为了提高染色液B液中的稳定性，在B液中加入甜菊糖苷和曲酸，用该B液对细菌进行染色，能够延长染色液B液的储存时间以及提高染色后玻片的保存持久性。优选的，B液中甜菊糖苷、曲酸和品红的质量比为0.1-0.2:1.3-1.6:1。本实施例中，一种快速鉴别高毒力肺炎克雷伯菌的方法，采用如下方法进行染色：
S1：先将2滴A液滴加于洁净玻片上，后将图3所示肺炎克雷伯菌菌株加入A液中轻轻涂匀；
S2：将玻片自然干燥，在玻片上形成红色背景，不要加热；
S3：用B液轻轻涂抹玻片，染色5min；
S4：用水冲洗玻片后二次自然干燥；
S5：将玻片置于油镜下1000倍放大镜检，其染色结果与图3，无明显差别。
上述A液为：将1.0g刚果红溶于100mL蒸馏水中形成；B液为：将0.5g品红、0.055g甜菊糖苷、0.7g曲酸、30g氯化铁、50mL乙酸和39mL液化苯酚混合均匀形成。
B液稳定性测试：将实施例1和本实施例B液放置3月后分别使用紫外光谱于200-900nm下进行扫描，测得其紫外扫描曲线，观察其稳定性。其吸收光谱如图7，图中S1-0为0d时实施例1用B液在545nm的吸光度；图中S5-0为0d时实施例5用B液在545nm的吸光度；图中S1-3为放置3月后实施例1用B液在545nm的吸光度；图中S5-3为3月后时实施例1用B液在545nm的吸光度。可以看出，0d时，实施例1和实施例5用B液中酸性品红在546nm的吸光度一样；3月后，实施例1用B液中酸性品红在545nm的吸光度明显降低实施例5，这说明甜菊糖苷和曲酸的加入能够延长染色液B液的储存时间。
染色后玻片的稳定性：将放置3月后染色后玻片置于油镜下1000倍放大镜检，镜检结果与刚制备的样品无明显差别。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种高毒力肺炎克雷伯菌荚膜染色方法，包括以下步骤：
S1：先将1-3滴A液滴加于洁净玻片上，后将细菌加入所述A液中涂匀；
S2：将所述步骤S1得玻片自然干燥；
S3：用B液涂抹所述步骤S2得玻片，染色3-6min；
S4：用水冲洗所述步骤S3得玻片后二次自然干燥；
S5：将步骤S4得玻片置于光学显微镜下镜检；
所述A液为：将碱性刚果红溶于蒸馏水中形成，刚果红和蒸馏水的用量比为0.8-1.1g:100mL；所述B液为：将酸性品红、氯化铁、乙酸和液化苯酚混合均匀形成，品红、氯化铁、乙酸和液化苯酚的用量比为0.014-0.020g:1g:1.5-1.8mL:1.0-1.5mL；
所述染色方法的染色效果为：背景红色、菌体红色、荚膜白色。
2.根据权利要求1所述的一种高毒力肺炎克雷伯菌荚膜染色方法，其特征是：所述液化苯酚的制备方法为：取900g苯酚于广口瓶中，加水适量，置水浴上缓缓加热，液化后，放冷，添加适量的水，使成1000g，搅匀，即得。
3.权利要求1或2所述的荚膜染色方法在鉴别高毒力肺炎克雷伯菌中的用途。
4.一种高毒力肺炎克雷伯菌荚膜染色液，包括：
-A液，将碱性刚果红溶于蒸馏水中形成；
-B液，将酸性品红、氯化铁、乙酸和液化苯酚混合均匀形成；
其中，所述A液中刚果红和蒸馏水的用量比为0.8-1.1g:100mL；
所述B液中品红、氯化铁、乙酸和液化苯酚的用量比为0.014-0.020g:1g:1.5-1.8mL:1.0-1.5mL。
5.根据权利要求4所述的一种高毒力肺炎克雷伯菌荚膜染色液，其特征是：所述B液中加入甜菊糖苷和曲酸。
6.根据权利要求5所述的一种高毒力肺炎克雷伯菌荚膜染色液，其特征是：所述B液中甜菊糖苷、曲酸和品红的质量比为0.1-0.2:1.3-1.6:1。
7.一种快速鉴别高毒力肺炎克雷伯菌的方法，包括以下步骤：
S1：先将1-3滴权利要求1或2中所述A液滴加于洁净玻片上，后将细菌加入所述A液中涂匀；
S2：将所述S1步骤得玻片自然干燥；
S3：用权利要求1或2中所述B液涂抹所述S2步骤得玻片，染色3-6min；
S4：用水冲洗所述S3步骤得玻片后二次自然干燥；
S5：将S4步骤得玻片置于油镜下镜检。
8.根据权利要求7所述的一种快速鉴别高毒力肺炎克雷伯菌的方法，其特征是：所述肺炎克雷伯菌鉴别前在哥伦比亚血琼脂上，在35-40℃、5％CO2的孵箱中培育培养18-32h。
9.根据权利要求7所述的一种快速鉴别高毒力肺炎克雷伯菌的方法，其特征是：所述B液中加入甜菊糖苷和曲酸。
10.根据权利要求9所述的一种快速鉴别高毒力肺炎克雷伯菌的方法，其特征是：所述B液中甜菊糖苷、曲酸和品红的质量比为0.1-0.2:1.3-1.6:1。
11.根据权利要求7所述的一种快速鉴别高毒力肺炎克雷伯菌的方法，其特征是：所述高毒力株菌的荚膜厚度大于经典型株菌。
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