CN105241727A - 过碘酸-雪夫(pas)染色液(化学染色法) - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种过碘酸-雪夫化学染色试剂盒。本发明所述试剂盒包括PAS固定液、PAS？Ⅰ液、PAS？Ⅱ液和PAS复染液；其中，所述PAS固定液由高锰酸钾、甲醇和甲醛组成；所述PAS？Ⅰ液为过碘酸溶液；所述PAS？Ⅱ液为Schiff试剂。本发明调整固定液组成，由此缩短了样品固定时间，提高了样品固定染色效果。在此基础上，本发明进一步改进Schiff试剂的配制方式，达到灵敏度提高的效果，进一步缩短了整个PAS检测时间。同时本发明提供的试剂盒检测结果更加准确，有效降低了假阴性率结果的出现。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及过碘酸-雪夫(PAS)染色液(化学染色法)，即一种过碘酸-雪夫化学染色试剂盒。
背景技术
过碘酸-雪夫(PAS)染色是血细胞常用的化学染色方法之一，对于红细胞系、白细胞系、淋巴系统等某些血液病的诊断、鉴别诊断及疗效观察有着重要作用。其染色原理是：细胞内含乙二醇的糖类物质能被过碘酸氧化，形成双醛类物质，后者与Schiff试剂中的无色品红结合，形成紫红色沉淀物，沉淀物的显色深浅与乙二醇的含量成正比。随着医学实验技术的发展，PAS应用的范围更加广泛，如用以证明与鉴别细胞内空泡状的性质，心肌病变及其他心血管疾病的诊断，糖原累积病诊断和研究，糖尿病的诊断和研究，用于某些肿瘤的诊断等。
随着PAS的广泛应用，市面上有许多商品化的PAS试剂盒出售，除用于糖原的鉴定和糖类的显示外，还可以观察肾小球基底膜、结肠杯状细胞中性黏液物质、阿米巴滋养体和霉菌的着色，为临床诊断、分类和治疗提供了重要的依据。市场上的PAS试剂盒主要有两种：a)PAS染色试剂盒：只含品红染色剂的试剂盒，如sigma公司的PAS试剂盒；b)PAS联合染色试剂盒：此类试剂盒中含品红和其他染料，如AB-PAS试剂盒，该试剂盒采用阿尔辛蓝和PAS技术联合使用鉴别同一组织切片中的黏蛋白。
PAS染色是利用细胞化学显示细胞内糖类的技术，染色过程中细胞内糖类物质的固定、糖类的氧化程度和Schiff试剂在染色过程中起到至关重要的作用。
固定液不同，细胞染色效果会有差异，因此选择合适的固定液至关重要。目前，血片和骨髓涂片常用的固定液成分简单，如95％乙醇和甲醇，固定过程会对细胞、组织结构产生影响，固定效果一般，固定时间较长，一般需要固定5-8min左右或更长。而固定效果相对较好的Carnoy液和Rossman液等需要几种试剂临时配制，且操作程序繁琐，而且两者固定时间更长，前者需要在15-20min或更长，后者则在室温下需要24-36h，操作时间较长，不利于检测。
Schiff试剂为品红醛试剂，由碱性品红在酸性环境下与亚硫酸盐作用，生成无色品红，是PAS染色的关键。目前，其主要配制方法为将碱性品红用蒸馏水搅拌或加热溶解，盐酸调节pH值后，再加入偏重亚硫酸钠待红色褪去，活性炭过滤，避光保存，如文献《Lyon’sPAS标准化染色方法与传统PAS法的比较研究》(王正义，汪维伟，重庆医科大学学报2005年第30卷第5期)以及专利CN102243226A。市售PAS染色试剂盒中Schiff试剂主要采用上述方法配制，在用于PAS染色时，对于含糖量低的细胞，灵敏度不高并且染色效果不太理想，且与血细胞中糖原显色常需要反应1小时以上，检测颇为耗时。此外，现有的PAS方法或者是市售的PAS试剂盒还存在假阴性高的缺陷。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供过碘酸-雪夫(PAS)染色液(化学染色法)，即过碘酸-雪夫化学染色试剂盒，使所述试剂盒应用于检测时能够缩短检测时间，提高固定染色效果，可用于血细胞内糖类物质染色。
本发明的另一个目的在于提供一种过碘酸-雪夫染色试剂盒，使所述试剂盒应用于检测时能够提高检测灵敏度。
本发明的另一个目的在于提供一种过碘酸-雪夫染色试剂盒，使所述试剂盒应用于检测时能够降低结果的假阴性率。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种过碘酸-雪夫化学染色试剂盒，包括PAS固定液、PASⅠ液、PASⅡ液和PAS复染液；
其中，所述PAS固定液由高锰酸钾、甲醇和甲醛组成；所述PASⅠ液为过碘酸溶液；所述PASⅡ液为Schiff试剂。
针对现有PAS染色法中固定液时间过长、固定染色效果不佳的缺陷，本发明选择高锰酸钾、甲醇和甲醛三种试剂共同作为固定液，本发明PAS固定液具有强穿透力、固定时间快，细胞收缩小，对脂类、糖类、蛋白质类等物质都有很好的固定作用，能增强膜结构反差，可保存DNA和糖原，该固定液用于细胞固定，染色后颜色均匀鲜艳，结构清晰。
作为优选，所述PAS固定液由0.25％高锰酸钾、甲醇和40％甲醛组成。更优选地，所述0.25％高锰酸钾、甲醇和40％甲醛的体积比为0.25％高锰酸钾：甲醇：40％甲醛＝1:4:1。
作为优选，试剂盒中所述过碘酸溶液的质量百分比浓度为0.5％-1.5％。
本发明试剂盒中的PAS复染液可根据实际复染需要选择恰当的染液，其作用仅为突出染色效果，如常用的苏木素染液，故本发明试剂盒优选苏木素染液，更优选地，苏木素染液为Mayer’s苏木素染液，染液按常规方法配制或通过市售购买即可。
在现有的Schiff试剂配制过程中均是采用1N的HCl进行pH值调节，而经过本发明研究发现，在Schiff试剂配制过程中采用有机弱酸替代常规方法使用的盐酸，制备的碱性品红溶液与糖被过碘酸氧化后形成的醛类物质反应产生颜色的平衡时间只需要10min左右，显色时间短；同时在醛类物质浓度较低时也能显色，检测灵敏度较高。因此本发明优选在Schiff试剂配制中采用有机弱酸调节pH值；更优选地，所述Schiff试剂由以下方法制备获得：
步骤1：称取碱性品红加入煮沸的蒸馏水中，搅拌至品红彻底溶化，溶液冷却到50℃过滤，滤液加入有机弱酸，冷却过夜；
步骤2：用有机弱酸调pH，搅拌，持续滴加有机弱酸直至pH稳定至2.00±0.20，然后加入偏重亚硫酸钠，搅拌溶解，于暗处静置，加入活性炭搅拌，过滤，滤液置于冰箱密闭保存，获得Schiff试剂。
在上述配制方法中，所述有机弱酸优选为甲酸、乙酸、乙二酸、枸橼酸中的一种或两种以上。
对于碱性品红、蒸馏水、偏重亚硫酸钠、活性炭的使用量可参照常规方法中的使用量即可，例如称取1g碱性品红，加入200mL的煮沸的蒸馏水，加入偏重亚硫酸钠时为1-1.5g，活性炭用量为1-1.5g。
以本发明提供的试剂盒进行PAS染色时的步骤可参照如下：
步骤1：取干燥的新鲜血涂片标本，滴加PAS固定液5～8滴，盖满血膜即可，1分钟，水洗2-3次，待干。
步骤2：滴加PASⅠ液10分钟，水洗2-3次，待干。
步骤3：置入PASⅡ液内室温暗处放置10分钟，然后流水冲洗数分钟。
步骤4：PAS复染液复染1-2分钟，水洗待干，镜检。
本发明以所述PAS固定液和常规的甲醇、95％乙醇、Carnoy液、Rossman液等为测试对象，分别按照Lyon’sPAS标准化染色方法和本发明的染色方法进行固定染色，结果显示，使用本发明固定液按照Lyon’sPAS标准化染色方法染色，固定染色效果较优；完全按照本发明试剂盒进行PAS染色，效果在所有测试对象中最好。
同时，和按照常规HCl配制而成的Schiff试剂进行对比测试时，本发明改用有机弱酸配制的Schiff试剂检测糖类物质的灵敏度更高，最低浓度小于0.1mg/L。此外，本发明试剂盒还同市售的PAS试剂盒进行整体对比，结果显示，本发明固定液固定时间仅需1min，整体耗时22min左右，而市售PAS试剂盒固定时间需要5-8min，整体耗时80min左右，并且本发明检测结果的阳性率更加贴近真实结果，而现有PAS试剂盒假阴性率较高，准确率差。
与现有技术相比，本发明试剂盒细胞固定时间短、糖原颗粒保存好，染色后颜色更均匀鲜艳，结构更清晰；检测灵敏度高，显色时间缩短，假阴性率低；整个检测过程从固定、氧化、Schiff反应到苏木素染色可在半小时内完成，具有快捷、便利的优点。
由以上技术方案可知，本发明调整固定液组成，由此缩短了样品固定时间，提高了样品固定染色效果。在此基础上，本发明进一步改进Schiff试剂的配制方式，达到灵敏度提高的效果，进一步缩短了整个PAS检测时间。同时本发明提供的试剂盒检测结果更加准确，有效降低了假阴性率结果的出现。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种过碘酸-雪夫染色试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品和制备方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种过碘酸-雪夫染色试剂盒进行详细说明。
实施例1：本发明试剂盒的组成及制备方法
PAS固定液：0.25％高锰酸钾：甲醇：40％甲醛＝1:4:1(v/v/v)；
PASⅠ液：1％过碘酸溶液；
PASⅡ液：称取1g碱性品红加入煮沸的200mL蒸馏水中，搅拌至品红彻底溶化，溶液冷却到50℃过滤。加入1mol/L乙酸20ml，冷却过夜。用乙酸将溶液pH调至2.00±0.20，搅拌1h，持续滴加乙酸直至pH稳定至2.00±0.20，往上述溶液中加入1-1.5g偏重亚硫酸钠，搅拌溶解，于暗处静置24h，加入1.0-1.5g活性炭搅拌2min，过滤，置于冰箱密闭保存；
PAS复染液：Mayer’s苏木素染液。
实施例2：本发明试剂盒的组成及制备方法
PAS固定液：0.25％高锰酸钾：甲醇：40％甲醛＝1:4:1(v/v/v)；
PASⅠ液：1％过碘酸溶液；
PASⅡ液：称取1g碱性品红加入煮沸的200mL蒸馏水中，搅拌至品红彻底溶化，溶液冷却到50℃过滤。加入1mol/L甲酸20ml，冷却过夜。用甲酸将溶液pH调至2.00±0.20，搅拌1h，持续滴加甲酸直至pH稳定至2.00±0.20，往上述溶液中加入1-1.5g偏重亚硫酸钠，搅拌溶解，于暗处静置24h，加入1.0-1.5g活性炭搅拌2min，过滤，置于冰箱密闭保存；
PAS复染液：Mayer’s苏木素染液。
实施例3：本发明试剂盒的组成及制备方法
PAS固定液：0.25％高锰酸钾：甲醇：40％甲醛＝1:4:1(v/v/v)；
PASⅠ液：1％过碘酸溶液；
PASⅡ液：称取1g碱性品红加入煮沸的200mL蒸馏水中，搅拌至品红彻底溶化，溶液冷却到50℃过滤。加入0.5mol/L乙二酸20ml，冷却过夜。用乙二酸将溶液pH调至2.00±0.20，搅拌1h，持续滴加乙二酸直至pH稳定至2.00±0.20，往上述溶液中加入1-1.5g偏重亚硫酸钠，搅拌溶解，于暗处静置24h，加入1.0-1.5g活性炭搅拌2min，过滤，置于冰箱密闭保存；
PAS复染液：Mayer’s苏木素染液。
实施例4：本发明试剂盒的染色方法
1、取干燥的新鲜血涂片标本，滴加PAS固定液5～8滴，盖满血膜即可，1分钟，水洗2-3次，待干。
2、滴加PASⅠ液10分钟，水洗2-3次，待干。
3、置入PASⅡ液内室温暗处放置10分钟，然后流水冲洗数分钟。
4、PAS复染液复染1-2分钟，水洗待干，镜检。
实施例5：不同固定液染色结果的比较
分别采用本发明实施例1中PAS固定液与95％乙醇、甲醇、Carnoy固定液、Rossman固定液等常用固定液对同一来源新鲜血片进行固定1min，同时分别用Lyon’sPAS方法和本发明试剂盒染色方法染色，检查其染色结果。为了得到更直观印象，以“+”来表示显色的强弱。固定后染色结果如下：
表1不同固定液、染色方法染色结果比较
| PAS固定液 | 95％乙醇 | 甲醇 | Carnoy | Rossman | |
| Lyon’s PAS | +++ | ++ | ++ | +++ | ++ |
| 本发明试剂盒 | ++++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
通过以上结果显示：本发明方法的PAS固定液的固定效果优于其它常用的固定液固定效果；另外，采用本试剂盒染色方法结果要优于Lyon’sPAS标准染色方法。
实施例6：不同Schiff试剂灵敏度测试
以实施例1中试剂盒PASⅡ液为Schiff1试剂；将Schiff1试剂配制方法中的乙酸改为常规的1N盐酸，按相同方法配制Schiff2试剂。
分别取这两个试剂同时检测常温下各种浓度的葡萄糖溶液，葡萄糖溶液与等体积1％过碘酸溶液反应10min，该反应液再与Schiff试剂1:1混合，用分光光度计检测溶液变色至稳定后的OD540nm值。具体结果如下表所示：
表2Schiff1和Schiff2检测不同浓度葡萄糖结果
从以上结果可以看出：对于不同浓度的葡萄糖溶液，Schiff1试剂检测OD值均高于Schiff2试剂，且Schiff1试剂显色的葡萄糖最低浓度小于0.1mg/L,同样地，以实施例2和实施例3中的甲酸和乙二酸调节pH值制成的Schiff试剂也具有上述相同程度的效果，这说明用有机弱酸配制的Schiff试剂灵敏度明显高于传统盐酸配制的Schiff试剂。
实施例7：本试剂盒与某市售试剂盒PAS染色血细胞涂片比较
本实施例对50例流式细胞术(FCM)已确诊的急性淋巴细胞白血病患者血细胞涂片进行了本发明试剂盒和市售试剂盒PAS的染色，比较两个PAS染色的效果，试剂盒PAS染色具体操作步骤及结果如下：
表3本发明试剂盒与市售试剂盒比较
结果显示：采用本发明试剂盒染色方法阳性检出率结果要优于市售试剂盒，具有有效降低假阴性率、操作时间短等特点。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (9)
1.一种过碘酸-雪夫化学染色试剂盒，其特征在于，包括PAS固定液、PASⅠ液、PASⅡ液和PAS复染液；
其中，所述PAS固定液由高锰酸钾、甲醇和甲醛组成；所述PASⅠ液为过碘酸溶液；所述PASⅡ液为Schiff试剂。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述PAS固定液由0.25％高锰酸钾、甲醇和40％甲醛组成。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述0.25％高锰酸钾、甲醇和40％甲醛的体积比为0.25％高锰酸钾：甲醇：40％甲醛＝1:4:1。
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述过碘酸溶液的质量百分比浓度为0.5％-1.5％。
5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述PAS复染液为苏木素染液。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述苏木素染液为Mayer’s苏木素染液。
7.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述Schiff试剂在配制中采用有机弱酸调节pH值。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述Schiff试剂由以下方法制备获得：
步骤1：称取碱性品红加入煮沸的蒸馏水中，搅拌至品红彻底溶化，溶液冷却到50℃过滤，滤液加入有机弱酸，冷却过夜；
步骤2：用有机弱酸调pH，搅拌，持续滴加有机弱酸直至pH稳定至2.00±0.20，然后加入偏重亚硫酸钠，搅拌溶解，于暗处静置，加入活性炭搅拌，过滤，滤液置于冰箱密闭保存，获得Schiff试剂。
9.根据权利要求7或8所述试剂盒，其特征在于，所述有机弱酸为甲酸、乙酸、乙二酸、枸橼酸中的一种或两种以上。
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