CN111999275A - 一种快速定量测定pH值和/或尿酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种快速测定pH值和/或尿酸的方法。本发明首先采用生物质原料通过水热法合成碳量子点，利用所得碳量子点与pH和尿酸的特异性响应，从而实现pH和/或尿酸的定量检测。该方法涉及的原料来源广，且制备方法简单、成本低廉、对不同的pH值和尿酸的浓度敏感，选择性高、特异性强，有望在生物化学领域具有重要的应用价值。

Description

一种快速定量测定pH值和/或尿酸的方法

技术领域

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种快速定量测定pH值和/或尿酸的方法。

背景技术

pH值在化学反应和生物反应中起着关键性的作用，它与人类的细胞、组织液、酶的活性等息息相关，更是人体正常运转的关键性指标。在病理状态下，人体细胞内一般会发生酸碱失衡，细胞功能障碍也通常与细胞的pH值异常有关，即使pH值的微小变化也可能反映出身体的某些疾病，因此，检测人体细胞内pH值大小的变化有助于揭示细胞的代谢状态，有助于监测某些异常的病理过程，也有助于为疾病的早期诊断及治疗提供重要的信息。近年来检测细胞内pH值的方法不断得到发展和完善，目前主要有荧光探针法、核磁共振法、弱酸弱碱分布法、微电极法等。其中核磁共振法等为传统的方法，常用的探针为¹⁹F，但氟化物一般稳定性较差，且对人体具有一定的毒性，所以目前核磁共振法仅限于运用在动物实验或离体实验中，而且核磁共振法中所需的仪器设备较为庞大，不适用于实验室的常规简易操作。

尿酸(Uric acid)是嘌呤核苷酸分解代谢的终产物。尿酸异常可以反映出与嘌呤代谢有关的疾病，尿酸还会引起其他级联炎症反应，包括COX-2、PDGF等引起氧化应激反应、激活血小板-凝血系统级联反应、促进血管平滑肌细胞凋亡。目前测定人体血液中尿酸的方法主要有高效液相色谱法、磷钨酸还原法和尿酸传感器测试法，高效液相色谱法优点是检测精度高但该方法样品制备和提取十分繁琐，需大量时间和金钱成本，因此限制了高效液相色谱法的推广和使用。磷钨酸还原法性能良好，但是尿酸和蛋白质会产生共沉淀影响实验结果，而且实验结果容易受到其他还原剂的干扰。尿酸传感器测试法主要是基于尿酸氧化酶的检测，常用的两种检测器：利用全血测试尿酸含量的安培型传感器和碳纳米管和纳米氧化锌修饰的尿酸传感器，但传感器会受到环境中各种因素的干扰，使实验结果与真实值之间存在一定的误差，而且传感器检测的精密度与酶固定化技术密不可分。因此，目前仍然需要一种经济、快捷和安全的方法检测pH值和尿酸。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的主要目的在于，提供了一种绿色合成的碳量子点，用于快速检测pH值和尿酸，由于碳点良好的生物相容性及抗干扰能力，该方法有望用于人体细胞或体液中pH值和尿酸的快速检测；该方法涉及的检测材料绿色经济、易获取，检测步骤操作简单，结果快速准确，为pH值和尿酸的检测提供了新的思路。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种快速定量测定pH值和/或尿酸的方法，具体步骤如下：

(1)将干燥的生物质原料与乙醇水溶液混合，共同放入榨汁机中搅拌均匀并打成匀浆，静置；将所得混合物转移至反应釜中进行水热反应，过滤、微滤、透析、冷冻干燥，得碳量子点粉末，碳量子点粉末加水分散得碳量子点分散液；

然后进行步骤(2)和/或(3)；

(2)pH值的测定：将步骤(1)所得的碳量子点分散液分别加入到不同pH值的0.1mol/LPBS缓冲溶液中，进行混合反应，然后采用荧光分光光度计测量所得待检测溶液的荧光强度，构建所得荧光强度与pH的线性关系；

(3)尿酸的测定：将步骤(1)所得的碳量子点分散液分别加入到不同浓度的尿酸水溶液中，进行混合反应，然后采用荧光分光光度计测量所得待检测溶液出峰位置，构建所得碳量子点出峰位置与尿酸浓度的线性关系；

进一步，所述步骤(1)中生物质原料为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶，银杏叶的主要成分包括银杏内酯、黄酮类化合物、抗坏血酸、蛋白质、游离矿物质、糖类等物质，利用水相和乙醇相同时提取银杏叶中的成分，实现对pH和尿酸的特异性检测。

进一步，所述步骤(1)中乙醇水溶液的体积分数为35％～60％，优选为45％～55％，更优选为50％，生物质原料与乙醇水溶液的用量比为1g：(8-20)mL，优选为1g：(8-15)mL；

优选的，所述步骤(1)中乙醇水溶液的体积分数为50％，生物质原料与乙醇水溶液的用量比为1g：(8-12)mL；

进一步，所述步骤(1)中静置时间为25～35min。

进一步，所述步骤(1)中水热反应温度为170℃～190℃，时间为3～5h。

进一步，所述步骤(1)中过滤步骤为用双圈定性滤纸(7cm-中速)过滤，微滤步骤为用0.22μm滤膜过滤；透析步骤为用3000Da分子量的透析袋透析12～24h。

进一步，所述步骤(1)中碳量子点：直径为2～4nm，晶格间距约为0.31nm。

进一步，所述步骤(1)中碳量子点分散液浓度为60～160μg/mL，存储于4℃冰箱中备用。

上述方案中，碳点荧光探针检测pH的发射波长为305.0～500.0nm。

上述方案中，碳点荧光探针检测尿酸的发射波长为380.0～550.0nm。

进一步，所述步骤(2)中PBS缓冲溶液的pH范围为8.0～11.0。

更进一步，所述步骤(2)pH值的测定：取步骤(1)所得的碳量子点分散液100μL，再加入900μL pH为8.0～11.0的0.1mol/L PBS缓冲溶液，进行混合反应，设置激发波长为285.0nm，在305.0～500.0nm处进行荧光光谱测定。

进一步，所述步骤(2)，可应用于人体细胞或体液中pH值的检测。

进一步，所述步骤(3)中所述尿酸浓度的范围为2～8μmol/L。

更进一步，所述步骤(3)尿酸的测定：取步骤(1)所得的碳量子点分散液100μL，100μL(2～8)×10^-5mol/L尿酸水溶液，再加入800μL水，进行混合反应，设置激发波长为360.0nm，在380.0～550.0nm处进行荧光光谱测定。

进一步，所述步骤(3)，可应用于生物基质中人血清中尿酸的检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)针对现有检测方法中存在的成本高昂、操作复杂、检测时间长等问题，本发明首次提供利用碳量子点快速检测pH值和尿酸，对pH值的响应表现为碳点荧光强度的改变，对尿酸的响应表现为出峰位置的改变，利用所得碳量子点与pH值和尿酸之间的特异性响应，能快速检测生物基质中的pH值和尿酸含量。

2)应用的碳量子点采用生物质原料银杏叶并结合简单的水热法形成，涉及的原料来源广，且制备方法简单、成本低，环境友好，适合推广应用。

3)本发明涉及的检测方法操作简单，可实现pH值和尿酸的检测，在检测pH值方面具有良好的可逆性和耐用性，有希望应用于人体中pH值和尿酸的快速检测。

附图说明

图1为本发明绿色合成碳量子点快速测定pH值和尿酸的方法示意图；

图2为本发明实施例1所得碳量子点透射电镜表征图(左)及粒径分布图(右)；

图3为本发明实施例1所得银杏叶碳点的中红外表征图；

图4为本发明实施例2碳点荧光强度随溶液pH值的变化图(左)及线性关系图(右)；

图5为本发明实施例2银杏叶碳点检测pH值的可逆性图；

图6为本发明实施例3碳点荧光出峰位置随尿酸浓度的变化图(左)及线性关系图(右)；

图7为本发明实施例3中碳点与尿酸反应前后的荧光寿命图。

具体实施方式

下面申请人将结合具体的实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。但以下内容不应理解为是对本发明的权利要求书请求保护范围的限制。

实施例1

银杏叶碳点荧光探针的合成

将银杏叶(银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶)洗净，放入鼓风干燥箱60℃烘干，冷却，备用。称取5g干燥的银杏叶，加入无水乙醇(分析纯，25mL)与水(25mL)的混合物，放入榨汁机(九阳；JYL-CO22)中打成匀浆，静置30min。将混合物转移至高温高压反应釜中，于180℃烘箱中加热4h。将混合物取出，用双圈定性滤纸(7cm-中速)滤过固体残渣，将滤液过0.22μm的微孔滤膜，除去大颗粒杂质。将初步制得的碳量子点溶液通过3000D透析袋在超纯水中透析24h，除去小分子杂质，得到纯净的碳量子点溶液。将得到的碳量子点溶液放入冷冻干燥机中冷冻干燥24h，得到碳量子点粉末(碳量子点的TEM图及粒径分布见图2)，从透射电镜图中可以发现银杏碳量子点的粒径较小，有一定的晶体形态，直径为2-4nm，晶格间距约为0.31nm。将碳量子点粉末精确称取0.0012g溶于10mL水中，得到均匀的碳量子点分散液，浓度为120μg/mL，即得到银杏叶碳点荧光探针，存储于4℃冰箱中备用。

实施例2

一种定量测定pH的方法，具体步骤包括如下：

1)银杏叶碳点检测pH值标准曲线的构建

仿照人体体液环境配制磷酸缓冲盐溶液(PBS)。首先配制pH为7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)：称取8.00gNaCl、0.20g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于800mL超纯水中，加浓盐酸调节溶液的pH值至7.4，最后加超纯水定容至1000mL即可。向pH值为7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)中缓慢滴加1.0mol/L氢氧化钠溶液，依次调节pH值至8.0、9.0、9.5、10.0、11.0。

把已配制好的pH值为8.0、9.0、9.5、10.0、11.0的PBS缓冲溶液按浓度梯度各取900μL，与100μL实施例1制备的银杏叶碳点混合均匀。使用F-7000荧光分光光度计设置参数：激发波长为285.0nm；发射起始波长为305.0nm；发射终止波长为500.0nm；激发狭缝宽度为10.0nm；发射狭缝宽度为10.0nm；电压为400V；扫描速度为1200nm/min。将参数设置好后检测体系的荧光强度，用以确定体系中荧光强度与pH值之间的关系。图4(左)是银杏叶碳点荧光强度与PBS缓冲溶液pH值变化的关系图，图中表明在pH值为8～11的范围内，银杏叶碳点在357nm处的荧光强度随着pH值的增加而增加，变化较为明显，且发射波长基本不变，维持在较稳定和良好的发射状态。这可以进一步表明pH值的增加对银杏叶碳点的核并没有影响。银杏叶碳点的荧光强度与PBS缓冲溶液pH值关系的线性图如图4(右)所示，所得到的线性方程为y＝306.70x-1995.54，R2＝0.9959。由图可知，在一定的pH值范围内，银杏叶碳点的荧光强度与pH之间拥有很好的线性关系。结合中红外表征图3可知，碳点表面存在丰富的羧基基团，在碱性条件下，由于羧基的去质子化作用，导致了离域π键的形成以及n电子数的增加，因此造成碳点荧光强度的增加。

2)银杏叶碳点检测pH值的可逆性

可逆性对于pH荧光探针是十分重要的，对pH响应具有良好可逆性的pH荧光探针可以在长时间内反复应用。图5为银杏叶荧光探针在pH值为4和pH值为11的环境下循环切换7次测定的结果，图中表明随着pH值的增加，银杏叶碳点的荧光强度也会增加，但通过降低pH值，银杏叶碳点的荧光强度又可以成功地恢复至原来的水平。即使每两次测定的pH值之间有较大突跃，银杏叶碳点的荧光强度仍然具有一定的可逆性，且每一pH值所对应的荧光强度都较为稳定。本实验所合成的银杏叶碳点已被成功地证明在检测pH值方面具有良好的可逆性和耐用性。

实施例3

人血清中定量测定尿酸的方法，具体步骤包括如下：

1)银杏叶碳点检测尿酸标准曲线的构建

取100μL实施例1制备的碳量子点分散液、100μL不同浓度的尿酸水溶液(1×10^-4、2×10^-5、3×10^-5、4×10^-5、5×10^-5、6×10^-5、7×10^-5、8×10^-5mol/L)，加入800μL水中(尿酸浓度指这三者混合后所得溶液中的尿酸终浓度)，检测其荧光强度并观察结果，由图6(左)可知，随着浓度的增加，碳点的出峰位置随之红移，以碳点的出峰位置(单位：nm)作为纵坐标，尿酸浓度作为横坐标，尿酸浓度与出峰位置呈良好的线性关系，见图6(右)，线性方程为y＝3.89x+418.12，R²＝0.9827，检测限为1.212×10^-6mol/L(S/N＝3)。银杏叶碳点在与1×10^{- 4}mol/L尿酸水溶液(UA)反应前后拟合的荧光寿命分别为3.15349ns、2.93171ns，检测反应前后银杏叶碳点的荧光寿命(见图7，其中横坐标为衰减时间)未发现明显的改变，推测反应机理为待测物与碳点形成了复合物造成出峰位置的改变，反应物与碳点之间为静态结合，荧光猝灭过程中没有明显的电子传递。

2)人血清中尿酸的检测

将本发明所述检测方法应用于验证实际样品人血清中尿酸的检测效果，具体步骤包括：将血浆样品用离心机以10000rpm/min转速离心10分钟，取其上清液。将尿酸加入至人血清中进行实际样品中的加标回收。将尿酸加入人血清中分别得到2.00μmol·L^-1、5.00μmol·L^-1、8.00μmol·L^-1的低中高三个浓度的尿酸溶液，作为加标样品，随后将100μL的实施例1制备的碳量子点分散液与900μL的加标样品混合，放入分光光度计中检测，实现对人血清中尿酸的检测。使用F-7000荧光分光光度计设置参数：激发波长为360.0nm；发射起始波长为380.0nm；发射终止波长为550.0nm；激发狭缝宽度为10.0nm；发射狭缝宽度为10.0nm；电压为400V；扫描速度为1200nm/min。实验结果如表1所示，该探针均表现出了满意的回收结果，回收率分别为101.4％、104.0％、104.2％，均在95％-105％之间。说明人血清中的其他物质如多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等对于尿酸的测定没有干扰。该探针可用于实际样品中尿酸的检测。

表1.银杏叶碳点检测尿酸在人血清中的回收结果

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种快速定量测定pH值和/或尿酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将干燥的生物质原料与乙醇水溶液混合，共同放入榨汁机中搅拌均匀并打成匀浆，静置；将所得混合物转移至反应釜中进行水热反应，过滤、微滤、透析、冷冻干燥，得碳量子点粉末，碳量子点粉末加水分散得碳量子点分散液；

然后进行步骤（2）和/或（3）；

（2）pH值的测定及建立其与荧光强度的线性关系：将步骤（1）所得的碳量子点分散液分别加入到不同pH值的PBS缓冲溶液中，进行混合反应，然后采用荧光分光光度计测量所得待检测溶液的荧光强度，构建所得荧光强度与pH的线性关系；

（3）尿酸的测定及建立其与出峰位置的线性关系：将步骤（1）所得的碳量子点分散液分别加入到不同浓度的尿酸水溶液中，进行混合反应，然后采用荧光分光光度计测量所得待检测溶液出峰位置，构建所得碳量子点出峰位置与尿酸浓度的线性关系；

所述步骤（1）中水热反应温度为170 ℃~190 ℃，时间为3~5 h；

所述步骤（2）中PBS缓冲溶液的pH范围为8.0~11.0；

所述步骤（3）中尿酸浓度范围为2~8 μmol/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括如下步骤A和/或B：

A、测定实际样品pH时，将步骤（1）所得的碳量子点分散液加入到实际样品中，进行混合反应，然后采用荧光分光光度计测量所得待检测溶液的荧光强度，利用所构建的荧光强度与pH的线性关系来计算pH；

B、测定实际样品尿酸浓度时，将步骤（1）所得的碳量子点分散液加入到实际样品中，进行混合反应，然后采用荧光分光光度计测量所得待检测溶液的出峰位置，利用所构建的碳量子点出峰位置与尿酸浓度的线性关系来计算尿酸浓度。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中生物质原料为银杏叶。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中乙醇水溶液中乙醇的体积分数为35%~60%，生物质原料与乙醇水溶液的用量比为1 g：(8-20) mL。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中乙醇水溶液中乙醇的体积分数为45%~55%，生物质原料与乙醇水溶液的用量比为1g：(8-15) mL。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中过滤步骤用7cm-中速双圈定性滤纸过滤，微滤步骤用0.22 μm滤膜过滤；透析步骤用3000 Da分子量的透析袋透析12~24 h。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中碳量子点：直径为2~4nm，晶格间距约为0.31 nm；碳量子点分散液浓度为60~160 μg/mL。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）在305.0~500.0 nm处进行荧光光谱测定。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）在380.0~550.0 nm处进行荧光光谱测定。

10.权利要求1-9任一所述的方法应用于人体细胞或体液中pH值和/或尿酸的定量检测。

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