CN107033886A

CN107033886A - 具有催化和指示双功能的荧光碳点及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107033886A
Application number: CN201710273951.XA
Authority: CN
Inventors: 蔡方平; 朱丹; 朱昌青
Original assignee: Anhui Normal University
Current assignee: Anhui Normal University
Priority date: 2017-04-25
Filing date: 2017-04-25
Publication date: 2017-08-11
Anticipated expiration: 2037-04-25
Also published as: CN107033886B

Abstract

本发明公开了一种具有催化和指示双功能的荧光碳点及其制备方法和应用；该制备方法包括：先将顺磁性的酞菁材料与溶剂混合，接着进行水热处理，最后进行纯化得到具有催化和指示双功能的荧光碳点。该荧光碳点的荧光性能较好，光稳定好且量子产率较高，能够催化降解双氧水产生活性氧(·OH)，并能通过碳点的荧光变化监测产生活性氧水平，又因该荧光碳点低毒性，生物相容性等优点，使其能够应用于生物体系中检测细胞内活性氧水平及监控细胞凋亡过程。

Description

具有催化和指示双功能的荧光碳点及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及荧光纳米材料技术领域和催化领域，具体地，涉及具有催化和指示双功能的荧光碳点及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，碳点作为一种荧光纳米材料日益受到研究者们的广泛关注。由于碳点原料丰富易得、合成方法简单，尤其具有低毒性、抗光漂白性及生物相容性等优势，而被广泛用于生物传感及细胞成像等生物医学领域。最近，陆续有报道关于碳点的催化应用，主要是碳点作为一种碳质材料，具有很好的光生电子的性质，能够作为电子供体和受体，加快电子的转移，从而提高催化性能而被应用催化领域上，继而被应用在生物医学、环境学等领域。

另外，活性氧是体内有氧代谢的主要产物,主要包括羟基自由基(·OH)、单线氧(¹O₂)、超氧阴离子(O₂·^-)、过氧自由基(·OOH)。它可以参与脂质的过氧化、DNA链的断裂、蛋白质的修饰变性,也参与或影响细胞内的信号转导和基因表达。其中·OH既可以与氨基酸反应,又可直接作用于肽键,这些反应都能导致蛋白质肽链断裂,最终导致蛋白质特别是酶蛋白丧失活性,从而诱导细胞凋亡。另外，由于生物体内活性氧的活性非常高、寿命较短，导致通常情况下稳态浓度极低，测定活性氧的非常困难。且通常生物体内的活性氧的产生和水平监控需要外加两种不同试剂或材料，难以同时同步实现这两种功能，还会扰乱正常的生物体系，从而带来了诸多不便。目前，细胞凋亡已成为生物医学领域的研究热点。随着研究的日益深入，细胞凋亡的检测技术日渐成熟和完善，如形态学检查、DNA降解分析和流式细胞分析(FCA)。测定自由基的方法主要有电了自旋共振法(ESR)、高效液相色谱法(HPLC)、化学发光法(CL)等，相比于以上方法，荧光分析法结合共聚焦显微成像技术，具有灵敏度高、选择性好等优势，且能够有效实现实时观察活细胞和组织内的ROS水平。

因此，提供一种既能催化活性氧又能监控活性氧水平的荧光碳点是非常有必要的。但是目前在碳点制备过程中，大部分的碳源的水溶性很差，导致碳点制备的产率低，荧光性质差、荧光寿命短，不利于碳点的进一步分析应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有催化和指示双功能的荧光碳点及其制备方法和应用；该荧光碳点的荧光产率高，荧光寿命长且荧光强度高，该荧光碳点低毒害，且同时具有催化降解双氧水和检测活性氧的双功能作用，能够应用与检测细胞内活性氧水平的检测。

为了实现上述目的，本发明提供了一种具有催化和过程指示双功能的荧光碳点的制备方法，其中，所述制备方法包括：先将顺磁性的酞菁材料与溶剂混合，接着进行热处理，最后进行纯化得到具有催化和指示双功能的荧光碳点。

本发明还提供了一种由上述制备方法制得的具有催化和过程指示双功能的荧光碳点。

本发明还提供了一种上述的具有催化和过程指示双功能的荧光碳点的应用。

通过上述技术方案，本发明通过选择水溶性好的顺磁性金属酞菁材料作为碳源制备荧光碳点，并根据酞菁原料中间空穴螯合了金属离子活性中心，使得制备的荧光碳点掺杂金属元素，从而提高荧光碳点的量子产率，能够在催化降解过氧化氢的同时监测分解H₂O₂过程中产生活性氧的水平。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是检测例1中的透射表征图；

图2是检测例2中的光谱表征图；

图3是检测例3中的荧光光谱图；

图4是检测例4中的红外光谱图；

图5是检测例5中的X光电子能谱图；

图6是检测例6中的光稳定性测试图；

图7是检测例7中的光稳定性测试图；

图8是检测例8中的光稳定性测试图；

图9是检测例9中的荧光寿命表征图；

图10是对B1进行检测例3表征的荧光光谱图；

图11是对B2进行检测例3表征的荧光光谱图；

图12是应用例1的测试结果图；

图13是应用例2的测试结果图；

图14是应用例3的毒性测试表征图；

图15是应用例3的细胞存活率测试结果图；

图16是应用例4的测试结果图；

图17是应用例5的测试结果图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明中，提供了一种具有催化和过程指示双功能的荧光碳点的制备方法，制备方法包括：先将水溶性极好的顺磁性的酞菁材料与溶剂混合，接着进行热处理，最后进行纯化得到具有催化和过程指示双功能的荧光碳点。

在上述的制备方法中，所选用的顺磁性的酞菁材料，本身无荧光性质，且均具有过氧化物模拟酶性质。其种类可以在宽的范围内选择，但是为了选择具有水溶性极好的碳源以及能够大幅地提高碳点荧光的量子产率，优选地，所述顺磁性的酞菁材料为钴酞菁、铁酞菁、锰酞菁或磺化钴酞菁。

但是为了更进一步地提高碳点荧光的量子产率和荧光性质，优选地，所述水溶性好的顺磁性酞菁材料为磺化钴酞菁。

在具体的实施方式中，所用的溶剂可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高碳源的溶解性且提高荧光碳点的荧光性质和量子产率，优选地，所述溶剂选自水、乙醇、甲醇或丙酮。

为了更进一步地提高碳点荧光的量子产率和荧光性质，优选地，所述溶剂为水。

另外，在制备过程中，热处理的条件可以在宽的范围内进行选择，但是为了提高碳点的制备产率，并进一步提高荧光碳点的荧光强度，优选地，所述热处理的温度为140-250℃，时间为2-36h。

本发明中，制备碳点时所用的顺磁性的酞菁材料与所述溶剂的重量配比可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高碳点的制备产率，优选地，所述顺磁性的酞菁材料与所述溶剂的重量配比为0.01-0.05：40。

此外，为了提高荧光碳点的荧光强度和寿命，对碳点进行纯化，所用的透析袋的规格可以在宽的范围内进行选择，但是为了进一步地提高荧光碳点的纯度，优选地，所述透析过程中采用的透析袋规格为：截留分子量500-1000。

本发明中还提供了一种由上述的制备方法制得具有催化和过程指示双功能的荧光碳点。

同时，还提供了一种上述具有催化和过程指示双功能的荧光碳点在催化分解H₂O₂并同时监测分解H₂O₂过程中产生活性氧的水平、以及检测细胞凋亡方面的应用。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，高分辨透射是通过日本电子株式会社型号为JEOL-2010型的透射仪器测得；傅里叶变换红外光谱图是通过日本岛津牌型号为IRPrestige-21的红外仪测得；紫外吸收是通过日本日立公司型号为U-3010的紫外吸收仪测得；荧光光谱是通过日本日立公司F-4500型号的荧光光谱仪测得；XPS数据结果是通过美国赛默飞的ESCALAB250型号的X射线光电子能谱测试仪测得；毒性测试是在Bio Tek Instruments,Inc.,美国的EPOCH型号的全波长酶标仪仪器中测得；细胞成像是在德国Leica TCS-SP2LSM710型号的激光共聚焦荧光显微镜仪器中测得；荧光碳点的荧光寿命是通过英国爱丁堡公司型号为FLS920的稳态瞬态荧光光谱仪进行测定的。

药品：磺化钴酞菁为上海笛柏化学品技术有限公司牌号为纯度≧98％分析纯市售品；透析袋为上海源叶生物有限公司公司牌号为截留分子量为1000的市售品。

实施例1

将0.01g磺化钴酞菁加入到40ml水中，在140℃℃,反应36h，接着进行过滤、离心、在截留分量为1000的透析袋中进行透析24h即得具有催化和指示双功能的荧光碳点，记作A1。

实施例2

将0.03g磺化钴酞菁加入到40ml水中，在200℃,反应20h，接着进行过滤、离心、在截留分量为1000的透析袋中进行透析24h即得具有催化和指示双功能的荧光碳点，记作A2。

实施例3

将0.05g磺化钴酞菁加入到40ml水中，在250℃,反应5h，接着进行过滤、离心、在截留分量为1000的透析袋中进行透析24h即得具有催化和指示双功能的荧光碳点，记作A3。

对比例1

将0.01g粉末空壳酞菁(水溶性差)加入到40ml水中，在250℃,反应5h，接着进行过滤、离心、在截留分量为1000的透析袋中进行透析24h得到荧光碳点，记作B1。

对比例2

根据文献(Y.X.Ci,F.Wang,Fresenius J.Anal.Chem.,1991,339,46.)所报道的，以反磁性的铝酞菁材料为碳源：将0.01g铝酞菁加入到40ml水中，在250℃，反应5h，接着进行过滤、离心、在截留分量为1000的透析袋中进行透析24h得到产物，记作B2。

检测例1

通过日本电子株式会社JEOL-2010型号的透射仪器，对实施例1制备的A1的形貌和粒径进行表征，其结果见图1。图1中，A表示对A1的透射表征图，B表示的A1的粒径分布图。

检测例2

通过日本日立公司F-4500型号的荧光光谱仪和日本日立公司型号为U-3010的紫外吸收仪对A1进行荧光发射光谱表征及紫外吸收光谱表征，具体结果见图2。

检测例3

通过日本日立公司F-4500型号的荧光光谱仪表征A1的发射激发依赖性质，具体结果见图3。其中，图3中左图为A1的荧光激发和发射光谱的表征结果图，右图是对左图荧光强度进行的归一化处理后图谱。

检测例4

通过日本岛津牌型号为IRPrestige-21的红外仪表征A1表面的基团类型，具体结果见图4。

检测例5

通过美国赛默飞的ESCALAB250型号的X射线光电子能谱测试仪表征A1的元素分布情况，具体结果见图5。

检测例6

测试实施例1制备的荧光碳点A1，在不同盐浓度下光稳定性，具体结果见图6。

检测例7

测试实施例1制备的荧光碳点A1，在自然光曝光下的光稳定性，具体结果见图7。

检测例8

测试实施例1制备的荧光碳点A1，在不同浓度的过氧化氢溶液中的光稳定性，具体结果见图8。

检测例9

利用英国爱丁堡公司型号为FLS920的稳态瞬态荧光光谱仪对制得的荧光碳点A1的荧光寿命进行考察，具体结果见图9。

对实施例2-3所制得的荧光碳点也进行上述的检测例1-10的检测，其结果与实施例1的检测结果基本一致。

将对比例1和2所制得的碳点B1和B2进行检测例3的检测，其检测结果分别见图11(B1)和图12(B2)。

通过上述检测例1-9的检测结果可知：

根据图1可知，荧光碳点A1的粒径尺寸在4.5-7.0nm之间，平均粒径尺寸约在在5.3nm左右，属于纳米级尺寸，该粒径尺寸有利于荧光碳点通过内吞作用进入细胞。碳点作为一种碳质材料，且有明显晶格条纹结构，晶格间距为0.22nm，接近石墨结构(100)面，表明碳点中主要为sp²型碳原子。

根据图2可知，荧光碳点A1的紫外吸收以及其荧光激发和发射光谱归一化处理得到的组合图谱：可以看到A1的紫外吸收曲线在220～250nm之间有一吸收峰，这归结于碳元素的π-π*跃迁。从图2中的插图可以看到，荧光碳点A1溶液在自然光下均呈透明无色，而在紫外灯365nm波长激发下，碳点溶液发蓝色荧光。且从激发和发射光谱可以看出，荧光碳点A1的激发波长范围约在300～400nm左右，发射波长范围在400～500nm左右，属于蓝色荧光范围。

根据图3可知，荧光碳点A1的最佳激发波长为λ_Ex＝310nm，最佳发射的最佳激发波长λ_Em＝436nm，同时也体现了荧光碳点A1的荧光激发依赖性质，即随着激发光源波长的红移，荧光碳点的发射波长也在红移，且具有较大斯托克斯位移△λ＝126nm，这一趋势说明了本发明提供的荧光碳点有利于在生物成像分析中区分耙信号与背景信号。

图4为荧光碳点A1的红外光谱表征图，可以看到3435cm^-1是磺酸基上游离-OH的伸缩振动峰，3195cm^-1是游离的N-H伸缩振动峰，2834cm^-1是季碳上C-H伸缩振动峰；1568cm^-1是C＝N伸缩振动峰；1400cm^-1是苯环骨架振动吸收峰；1190cm^-1，1117cm^-1是磺酸的游离酸特征吸收峰，1033cm^-1是芳香基团特征吸收峰。由此看来合成的荧光碳点A1的表面带有-OH、-NH₂官能团，水溶性很好的磺化钴酞菁在水热反应过程中溶剂水参与反应。同时，这些官能团可以给碳点表面带来更多的发光陷阱或空穴，从而使其具有强的光致发光特性,提高碳点的发光性质。

图5为荧光碳点A1的XPS表征图谱，可以看到荧光碳点A1主要含C、N、O元素，其中还含较少的Co元素。这说明了制备荧光碳点A1的原料磺化钴酞菁中钴粒子催化活性中心在经过水热反应处理后少量被保留了，这一表征结果说了了本发明提供的制备方法中选择磺化钴酞菁作为碳源是有利于提高碳点催化活性的；另外，由图5得知荧光碳点A1中钴元素的含量不高，即毒性低，这进一步说明本发明提供的荧光碳点对细胞的无毒害作用。

图6表示的是以磺化钴酞菁为碳源制备的荧光碳点溶液A1在一定浓度盐溶液(0～2000mmol/Lol/L)具有相对光稳定性，即碳点的荧光强度受盐浓度的变化影响较小，基本保持不变，比较适合荧光分析。

图7表示的是以磺化钴酞菁为碳源制备的荧光碳点溶液A1在一定时间(0～14h)曝光下具有较好的光稳定性，荧光强度几乎不变，说明本发明提供的荧光碳点比较适合用于荧光分析领域的应用。

图8表示的是以磺化钴酞菁为碳源制备的荧光碳点溶液在一定浓度双氧水溶液(10^-1～10^-9mol/L)具有相对光稳定性，碳点的荧光强度受双氧水浓度影响较小，基本保持不变，比较适合用于后续的催化研究。

图9为荧光碳点A1的荧光寿命图，其中衰减测量是采用时间相关单光子计数(TCSPC)技术，通过稳态/瞬态荧光光谱仪测得碳点的荧光寿命为6.29ns，相对较长，有利于荧光碳点A1作后续的荧光分析研究。

图10是对比例1中制得的碳点B1的荧光光谱图，B1使用了水溶性很差的空壳酞菁为碳源，采用同样的合成操作方法得到的非均相水溶液，得到上清溶液的荧光效果如图10所示，荧光强度较弱。

图11是对比例2中制得的碳点B2的荧光光谱图，图11是使用了反磁性的铝酞菁为碳源，水溶性也较差，以同样的合成方法得到的上清液水溶液的荧光效果如图3所示，荧光强度也较弱。

根据对比例1和2的荧光光谱表征结果来看，本发明提供的荧光碳点的制备方法中使用的是顺磁性酞菁材料为碳源所制得的荧光碳点具有最佳的荧光性质。

应用例1

准确量取1.4mL醋酸-醋酸钠缓冲液(0.01mol/L,pH＝3.80),200μLTMB溶液(5mmol/L)和800μL H₂O₂溶液(1mmol/L)，1mL纯化的实施例1制得的荧光碳点A1依次加入4mL试管中，振荡混合溶液。随后，在35℃条件下恒温静置5min后，计时开始。通过紫外光谱仪监测碳点A1催化降解H₂O₂过程引起TMB的显色反应过程，每隔2min记录一次吸光度，一直记录到吸光度值不再改变(基本维持不变)，终止计时，反应结束。测试结果如图12所示。

根据图12，在醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝3.80)条件下，以过氧化物酶底物TMB为显色底物，H₂O₂为氧化底物，碳点A1为催化剂，通过监测体系中TMB氧化物TMB⁺在652nm处的吸光度，考察碳点A1的过氧化物模拟酶的催化特性；同时，考察碳点A1的催化特性，此时H₂O₂浓度：0.5mmol/L；碳点A1的浓度：250μg/mL。从图12可以看到无色透明的TMB溶液被氧化成蓝色的溶液，在紫外吸收光谱表现为370nm、652nm处吸收值随着催化的进行(时间推移)逐渐上升，直至不变。由此证明C碳点A1具有过氧化物模拟酶催化性质。

应用例2

依次量取1mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.01mmol/L，pH＝6.0),1mL实施例1制得的荧光碳点A1的溶液，200μL DCFH-DA溶液(1mmol/L)，200μLH₂O₂溶液(10mmol/L)依次加入4mL离心管中摇晃混匀，大约5min后将溶液转移至荧光比色皿中，通过荧光光谱仪来监测催化过程中碳点的荧光光谱和2',7'-二氯荧光素双乙酸盐(DCFH-DA)荧光光谱变化趋势,每间隔1.5min记录一次光谱变化，结果如图13所示。

即为了验证碳点A1催化分解H₂O₂过程产生了·OH这种活性氧，于是引入·OH的特征荧光探针2',7'-二氯荧光素双乙酸盐(DCFH-DA)，DCFH-DA本身无荧光，当有·OH作用时，会生成荧光物质DCF-DA。实验结果图13中可以看到，随时间推移，碳点催化H₂O₂分解的进行，DCF-DA的荧光在增强，即证明催化过程不断产生了·OH，此时还伴随着碳点的荧光在猝灭，从而证明碳点A1的荧光可以同时实现监测催化H₂O₂的过程和检测·OH水平。

应用例3

细胞毒性实验(MTT法)：

MTT法是用来评估钴掺杂碳点、低浓度H₂O₂以及一些外加物质的毒性。取一定量的人体宫颈癌细胞悬液(HeLa细胞)接种于96孔板(每孔约8000个细胞)再加入新鲜的含10％FBS为高糖的DMEM培养基定容到100uL，放在培养箱孵育4h后待悬浮细胞贴壁。之后取出96孔板，对96孔板进行处理，除了最外圈36个孔各加入100uL pH＝7.40PBS溶液(保证培养环境水分充足)，剩下60个孔板依次控制空白组、实验组；其中空白组是不加入碳点和H₂O₂，只加100uL培养基定容，则实验组依次为100μL的不同浓度钴掺杂碳点、H₂O₂溶液以及俩者的混合溶液，碳点溶液浓度为0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.375mg/mL、0.5mg/mL、0.625mg/mL，双氧水溶液为0.1mmol/L、0.2mmol/L以及俩者不同比例混合液。每纵向6孔为一组，即每个样品有6个平行样，保证每孔最终体积均为200uL。之后轻轻摇匀孔板将其放在恒温培养箱(37℃、5％CO₂)中培养20小时，再向每孔加入含有10μlMTT溶液(5mg/mL)，继续培养4个小时，之后，将全部的培养基吸完，再加入150μL的DMSO，摇匀10分钟。最后，使用酶标仪(Bio TekInstruments,Inc.,美国)来测试490nm波长处吸收值。其中以DMSO作为空白对照，计算细胞存活率为Abs_sample/Abs_control×100％。实验结果如图14和图15所示。

为了验证外加低浓度H₂O₂以及同时加入H₂O₂和碳点时的毒性和生物相容性，于是采用上述MTT法考查碳点A1对细胞存活率的影响。

图14表示不同浓度的碳点(0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.375mg/mL、0.5mg/mL、0.625mg/mL)与HeLa细胞共同孵育4h和24h后的存活率，可以看到碳点具有较低的毒性和生物相容性，细胞存活率基本维持80％以上,可以用于细胞成像研究。

图15中a，e为空白组，b，f分别为0.1mmol/L H₂O₂和0.2mmol/L H₂O₂与细胞培养6h的情况，细胞存活率基本维持80％以上，具有较低毒性，适于在细胞内实验分析。c为0.1mmol/L H₂O₂和0.25mg/ml碳点A1溶液混合与细胞培养6h的细胞存活情况；d为0.1mmol/LH₂O₂和0.375mg/ml碳点A1溶液混合与细胞培养6h的细胞存活情况；g为0.2mmol/L H₂O₂和0.375mg/ml碳点A1溶液混合与细胞培养6h的细胞存活情况；h为0.2mmol/LH₂O₂和0.25mg/ml碳点A1溶液混合与细胞培养6h的细胞存活情况。)

证明了碳点A1促进了H₂O₂分解，单位时间内产生活性氧量变多，过多的活性氧从而加速了细胞凋亡的进程，所以表现出图15中c、d、g和h中活细胞数量大大地减少。

应用例4

碳点荧光成像实验:

取一定数量的HeLa细胞悬液，用细胞计数板计数(平均每皿5000个细胞)，接种在35×12mmol/L共聚焦培养皿中，加入新鲜含10％血清的高糖DMEM培养基定容到2mL，同时设置若干个平行组，按顺序编依次号，孵育24小时。之后依次向每皿中加入1mL不同浓度的荧光碳点A1，依次为0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.375mg/mL、0.5mg/mL、0.625mg/mL荧光碳点A1。与此同时，设置一组空白控制组(不加碳点溶液，用不含血清的DMEM培养基定容)，放在培养箱再孵育6小时。最后，将培养皿中的所有培养基吸尽，用PBS溶液冲洗两到三遍，再往皿中加入0.5mL PBS溶液，之后在荧光显微镜下，分别用紫外光、蓝光、绿光激发光源激发，观察此时HeLa细胞的荧光成像情况，结果如图16所示。

图16其中第一排(图a、b、c、)是碳点A1与细胞培养时的荧光成像图，图a、b、c是在暗场下激光共聚焦荧光显微镜依次分别用405nm、488nm、560nm激发光源得到的，可以看到碳点A1依次呈现蓝色、绿色、红色荧光，且荧光强度依次变弱，因为碳点A1最佳发射波长是蓝光范围，这证明了碳点A1的激发依赖性，随着激发波长延长，发射波长也向长波方向移动(红移)，与图3结果一致，其中d图表示的是碳点A1与细胞培养时的明场图；第二排中图e、f、h表示的是，往碳点A1溶液加入双氧水溶液后，在激光共聚焦荧光显微镜同样依次用405nm、488nm、560nm激发光源下观察到此时碳点A1的荧光强度均出现猝灭，i图为此时明场图。说明了随着催化的进行，碳点A1的荧光在猝灭，主要原因是碳点A1在催化分解双氧水时产生·OH，·OH的强氧化性破坏了碳点的发光位点，导致荧光猝灭。

应用例5

监测细胞内活性氧水平荧光成像实验：

将HeLa细胞悬液(细胞密度10⁵/每孔)均匀接种在若干个接种在35×12mmol/L规格共聚焦显微镜的专用培养皿上，用新鲜含10％FBS高糖的DMEM培养基孵育培养24h后，之后按设计控制实验，分别往各皿加入荧光强度最佳浓度下的碳点溶液以及浓度较低的H₂O₂溶液和碳点混合溶液，空白组不加任何样品。保证其他条件相同下，在恒温培养箱(37℃，5％CO₂)孵育6h后，取出培养皿。其中往一组培养皿加入50uL DCFH-DA(1mmol/L)溶液，之后再放入培养箱孵育30min。等30min后吸掉所有的培养基和试剂，用PBS溶液冲洗三遍，再往各皿中加入0.5mL PBS溶液，之后在激光共聚焦荧光显微镜下，用405nm、488nm、560nm波长处光源激发，观察此时不同情况下HeLa细胞的荧光成像情况并进行图像采集。

为了验证催化过程不断产生·OH，特引入·OH的特征荧光探针-2',7'-二氯荧光素双乙酸盐(DCFH-DA)，DCFH-DA本身无荧光，当有·OH作用时，会生成荧光物质DCF-DA。设置三个对照组如图17所示：a为碳点A1溶液与荧光探针混合后与细胞共同培养6h的暗场荧光图；b为双氧水溶液与荧光探针混合后与细胞共同培养6h的暗场荧光图；c为双氧水溶液、荧光探针与碳点A1混合后与细胞共同培养6h的暗场荧光图。控制所有物质加入量以及最终溶液体积一致，且每一组中荧光探针溶液与细胞孵育30min，可以看到a中只加入碳点A1和荧光探针时的荧光最弱；b中只加双氧水和荧光探针的荧光次之；而同时加入碳点A1、双氧水和荧光探针时细胞成像的荧光最强，这一现象说明了碳点催化了双氧水的分解，此时产生的·OH(活性氧)最多，使得此时与荧光探针(DCFH-DA)作用产生的荧光最强。

将实施例2-3制得的荧光碳点A2和A3同样进行应用例1-5的测试，其检测结果与实施例1的检果基本一致。

本发明提供的荧光碳点的荧光产率高，荧光寿命长且荧光强度高，该荧光碳点低毒害，且该荧光碳点具有催化降解双氧水并同时监测双氧水降解过程中活性氧水平的双功能作用；另外，根据对细胞内活性氧水平的监测进而实现对细胞凋亡进程的指示。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种具有催化和指示双功能的荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：先将顺磁性的酞菁材料与溶剂混合，接着进行热处理，最后进行纯化得到具有催化和指示双功能的荧光碳点。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述顺磁性的酞菁材料为铁酞菁、钴酞菁、锰酞菁或磺化钴酞菁。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述顺磁性的酞菁材料为磺化钴酞菁。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述溶剂选自水、乙醇、甲醇或丙酮。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述溶剂为水。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的制备方法，其中，所述热处理的温度为140-250℃，时间为2-36h。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，所述顺磁性的酞菁材料与所述溶剂的重量配比为0.01-0.05：40。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其中，所述纯化的方式为透析；所述透析过程中采用的透析袋规格为：截留分子量500-1000。

9.一种具有催化和指示双功能的荧光碳点，其特征在于，所述具有催化和指示双功能的荧光碳点由权利要求1-8中任意一项所述的制备方法制得。

10.一种如权利要求9所述的具有催化和过程指示双功能的荧光碳点在催化分解H₂O₂并同时监测分解H₂O₂过程中产生活性氧的水平、以及监测细胞凋亡方面的应用。