CN111504956B - 一种碳量子点荧光探针的制备及其在选择性检测活性氧中的应用 - Google Patents
一种碳量子点荧光探针的制备及其在选择性检测活性氧中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于纳米材料学和分子生物学技术领域，涉及一种碳量子点荧光探针的制备及其在选择性检测活性氧中的应用，通过此方法可制备对不同活性氧具有特异性检测功能的碳量子点。本发明采用一系列不同的碳源作为前驱物，通过一步法水热反应合成不同碳量子点。XPS表征显示，不同碳源生成的碳量子点表面含氧基团及含氮基团的种类及含量各异，各类基团与超氧阴离子(O2 ·‑)、羟基自由基(·OH)等活性氧具有不同的结合能力，因而可用于相关活性氧的特异性检测。同时，我们通过MTT法证明了此方法合成的碳量子点具有良好的生物相容性，可用于体内细胞成像及在线检测，检测药物刺激活细胞产生的活性氧含量，并用于相关细胞计数。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料学和分子生物学技术领域，具体为一种快速制备碳量子点荧光探针并有效调控其表面官能团种类及含量的方法，以及所制备碳量子点在超氧阴离子、羟基自由基各类活性氧的特异性检测及细胞内成像中的应用。
背景技术
活性氧是生物体内氧气新陈代谢的副产物，过量活性氧可影响DNA的甲基化过程和细胞内信号传导，改变相关基因的表达，从而诱发癌症、心血管疾病等重大疾病。另一方面，相比于正常细胞，癌细胞释放的活性氧含量较高，因此各类活性氧的检测可作为癌症等相关疾病的检测手段，在生命医疗领域具有重大的应用价值。
活性氧主要包括超氧阴离子(O2 ·-)、羟基自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(O2 1)等，其共同特点为化学性质活泼，存在时间短，且体内含量较低，定量检测较为困难。同时，各类活性氧结构较为相似，在一定条件下可相互转换，因此特定活性氧的选择性检测难度较大。由于不同活性氧在体内各类病理学及生理学过程中扮演的角色不同，发展可用于选择性检测生物体内各类活性氧的方法对各类疾病的早期诊断、病理学研究及治疗具有重要的意义。
目前用于活性氧检测的方法主要包括高效液相色谱法、电子顺磁共振、电化学传感器及荧光探针等。其中，荧光探针具有响应时间短，检测过程简单，灵敏度高等优点，且可用于细胞内荧光成像，是生物体内活性氧检测的理想手段。常用的基于重金属的荧光探针制备方法复杂，成本较高且生物毒性较大，不适合用于体内检测。碳量子点为直径小于10nm的球形/半球形纳米颗粒，具有优异的光学性能、良好的生物相容性，是一种环境友好的荧光探针材料。因此本发明采用碳量子点为研究对象，制备一系列对不同活性氧具有特异性的碳量子点荧光探针，用于细胞内荧光成像。
目前基于碳量子点的活性氧荧光探针主要通过表面修饰的不同分子实现其与不同活性氧的结合，从而间接引发量子点的猝灭。用于量子点表面修饰的分子主要包括2[6(4`-羟基)苯氧基-3H-黄烷-3-对-9-基]苯甲酸、1,8-萘酰亚胺、氢乙啶等。这些有机分子对生物体具有潜在的危害，且修饰过程较为繁琐。另一种常见的活性氧荧光探针为比率型荧光探针，即基于不同激发波长下量子点的荧光强度比，从而检测相关活性氧含量。因此本发明提出了一种基于碳量子点自身直接猝灭机理的荧光探针，省略了其表面修饰过程，通过改变碳源、反应时间等有效控制其表面基团种类及含量，从而实现对不同活性氧的选择性检测。该方法制备简单，材料生物相容性好，选择性强，可用于体内荧光成像且可视性较强。
发明内容
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供了一种基于碳量子点直接猝灭的活性氧荧光探针，并通过改变碳源调节其表面基团种类及含量，用于超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢、单线态氧等各类活性氧的选择性检测。
本发明的目的可通过以下技术方法来实现：
一种碳量子点荧光探针在选择性检测活性氧中的应用,其特征在于，
(1)通过改变碳源种类有效改变碳量子点表面官能团的种类及含量；所述碳源包括葡萄糖、柠檬酸、乙二醇、尿素、抗坏血酸、离子液体等；
(2)合成的碳量子点溶液经冷冻干燥后得到碳量子点固体粉末，对其表面官能团的种类及含量进行表征；
(3)不同碳源合成的各类碳量子点用于不同种类的活性氧的选择性检测，并通过表征其反应前后表面官能团的变化研究其反应机理。
本发明提供的一种碳量子点荧光探针在选择性检测活性氧中的应用,具体步骤为：
(1)碳量子点的合成
碳源超声溶解于一定量的超纯水中，接着加入乙二胺；反应体系中碳源质量分数为10％-25％，乙二胺质量分数为2.5％-6.25％，超纯水质量分数为87.5％-68.75％；然后将上述溶液转移至玻璃高压反应釜中，密封后在烘箱中加热至120-300℃，并保持5-24小时；反应结束后冷却至室温，用盐酸水溶液或氢氧化钠水溶液调节pH至中性，进一步进行透析及过滤处理；
所述透析采用分子截留量500Da的透析袋，在超纯水中透析7-24小时，透析后产物用直径为0.22μm滤膜进行抽滤，滤液经冷冻干燥后得到粉末状量子点固体，放置于干燥器中保存备用；
所述碳源为葡萄糖、柠檬酸、抗坏血酸、聚乙二醇、尿素或离子液体；
(2)与活性氧反应前后碳量子点表面基团种类及含量表征
步骤(1)中制备的碳量子点经冻干后通过X射线光电子能谱(XPS)表征其元素种类，通过XPS分峰软件对各主要元素进行分峰分析，得到反应前碳量子点表面各元素成键情况及官能团含量；
在步骤(1)中的碳量子点溶液中加入过量活性氧自由基，充分反应后用步骤(1)中方法进行透析、过滤并冷冻干燥，所得碳量子点粉末通过X射线光电子能谱(XPS)表征其元素种类，通过XPS分峰软件对各主要元素进行分峰分析，得到反应后碳量子点表面各元素成键情况及官能团含量；
(3)碳量子点荧光探针用于活性氧的检测
用UV-vis光谱确定碳量子点水溶液的最大吸收波长，作为荧光扫描测试中对应的激发波长；在碳量子点水溶液中依次加入一定浓度的不同活性氧，在对应的激发波长下，用荧光扫描仪记录其荧光强度；以对应的荧光强度为纵坐标，加入活性氧的浓度为横坐标，得到线性拟合曲线，曲线斜率为该线性范围内荧光探针的灵敏度。
进一步，碳量子点表面官能团的表征方法，使用X射线光电子能谱(XPS)对碳量子点粉末进行表征，并对氮元素及氧元素进行分峰拟合分析；碳量子点表面官能团主要包括C＝O、C-OH/C-O-C、(C)3-N、C-N-C等。
进一步，活性氧种类包括超氧阴离子、羟基自由基、单线态氧、过氧化氢等。其检测原理是基于活性氧与碳量子点表面基团的结合，造成碳量子点的直接猝灭。
根据本发明所述一种碳量子点荧光探针在选择性检测活性氧中的应用,在碳量子点溶液中加入过量活性氧，猝灭后的碳量子点经冷冻干燥得到固体粉末，用X射线光电子能谱(XPS)对碳量子点粉末进行表征，并对氮元素及氧元素进行分峰拟合分析，观察量子点猝灭前后C＝O、C-OH/C-O-C、(C)3-N、C-N-C等不同基团含量的变化；此研究方法不仅限于碳量子点，其他含碳量子点，如石墨烯量子点、碳纳米管负载金属化合物量子点、石墨烯负载金属化合物量子点等，均可用于活性氧的选择性检测及相关机理研究。
根据本发明所述一种碳量子点荧光探针在选择性检测活性氧中的应用,所述碳量子点荧光探针用于细胞间活性氧的检测：
Hela细胞培养至对数生长期后，离心除去培养液，并分散在碳量子点水溶液中进行荧光测试；在细胞及量子点分散液中加入不同量的ZymosanA刺激细胞产生活性氧，通过加入刺激药物前后荧光强度的变化检测细胞释放的活性氧含量。
根据本发明所述一种碳量子点荧光探针在选择性检测活性氧中的应用,碳量子点荧光探针用于细胞内成像：
Hela细胞分散在皮氏培养皿中，每个培养皿加入1.5mLDMEM培养液；培养二十四小时后，培养液中加入0.1mg/mL碳量子点，并再培养二十四小时确保碳量子点进入细胞内。接着，在实验组的培养液中加入一定量的ZymosanA以刺激细胞产生活性氧，对照组中不加入刺激药物，所有细胞均在培养箱中继续培养30min；最后，倒空培养皿中培养液，用磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH 7.4)清洗三次，加入4％多聚甲醛固定细胞；固定后的细胞用激光扫描共聚焦显微镜获取荧光图像。
本发明还提供一种碳量子点荧光探针的制备方法,具体步骤为：碳源超声溶解于超纯水中，接着加入乙二胺，然后将上述溶液转移至玻璃高压反应釜中，密封后在烘箱中加热至120℃并保持5小时；反应结束后冷却至室温，用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH至中性，进一步进行透析及过滤处理；
所述透析采用分子截留量500Da的透析袋，在超纯水中透析12小时，透析后产物用直径为0.22μm滤膜进行抽滤，滤液经冷冻干燥后得到粉末状量子点固体，放置于干燥器中保存备用；
所述碳源为葡萄糖、柠檬酸、抗坏血酸、聚乙二醇、尿素或离子液体。
发明详述：
一种碳量子点荧光探针的制备及其在选择性检测活性氧中的应用：
(1)碳量子点的合成
各类碳量子点均通过一步法水热反应获得。具体地，0.67g碳源超声溶解于5mL超纯水，接着加入0.185mL乙二胺。上述溶液转移至容量为25mL的玻璃高压反应釜中，密封后在烘箱中加热至120℃并保持5小时。反应结束后冷却至室温，用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH至中性，进一步进行透析及过滤处理。
透析过程采用分子截留量500Da的透析袋，在超纯水中透析12小时去除小分子杂质。透析后产物用直径为0.22μm滤膜进行抽滤，去除大分子杂质。滤液经冷冻干燥后得到粉末状量子点固体，放置于干燥器中保存备用。
上述合成过程中碳源为各类含碳水溶性物质，包括葡萄糖、柠檬酸、抗坏血酸、聚乙二醇、尿素、离子液体等。
(2)与活性氧反应前后碳量子点表面基团种类及含量表征
步骤(1)中制备的碳量子点经冻干后通过X射线光电子能谱(XPS)表征其元素种类，通过XPS分峰软件对各主要元素进行分峰分析，得到反应前碳量子点表面各元素成键情况及官能团含量。
在步骤(1)中的碳量子点溶液中加入过量特定种类活性氧自由基，充分反应后用步骤(1)中方法进行透析、过滤并冷冻干燥，所得碳量子点粉末通过X射线光电子能谱(XPS)表征其元素种类，通过XPS分峰软件对各主要元素进行分峰分析，得到反应后碳量子点表面各元素成键情况及官能团含量。
(3)碳量子点荧光探针用于活性氧的检测
用UV-vis光谱确定碳量子点水溶液的最大吸收波长，作为荧光扫描测试中对应的激发波长。在碳量子点水溶液中依次加入一定浓度的不同活性氧，在对应的激发波长下，用荧光扫描仪记录其荧光强度。以对应的荧光强度为纵坐标，加入活性氧的浓度为横坐标，得到线性拟合曲线(曲线斜率为该线性范围内荧光探针的灵敏度)。
用步骤(3)评估碳量子点荧光探针的抗干扰性和对该活性氧的选择性：在上述碳量子点水溶液中依次加入一定浓度的干扰物及其他种类的活性氧，在同一激发波长及检测条件下，用荧光扫描仪记录其荧光强度变化。
用上述步骤评估碳量子点荧光探针的长期稳定性：在上述激发波长及检测条件下，用荧光扫描仪记录一个月前后同一碳量子点水溶液的荧光强度，根据其强度变化评估其稳定性。
(4)细胞体外培养及MTT法毒性研究
Hela细胞培养在含10％胎牛血清与1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中。细胞培养皿放置于37℃潮湿的培养箱中，箱内流通气体为含5％CO2的空气。
碳量子点对细胞的毒性分析采用MTT法进行研究。具体地，在上述条件下于96孔板中培养Hela细胞。二十四小时后，上述孔板中实验组的培养液被替换成相同体积含有10mg/mL、1mg/mL、0.1mg/mL、0.01mg/mL和0.001mg/mL碳量子点的培养液，而对照组中的培养液未加入碳量子点。培养二十四或四十八小时后，实验组及对照组孔板中均加入MTT，再培养4小时。之后，孔板内液体被清空，每个孔内加入等量DMSO，用酶标仪检测细胞存活率。细胞存活率计算公式为：细胞存活率＝(实验组荧光强度平均值/空白组荧光强度平均值)×100％。
(5)碳量子点荧光探针用于细胞间活性氧的检测
利用上述碳量子点检测细胞释放的活性氧，具体过程如下：Hela细胞培养至对数生长期后，离心除去培养液，并分散在碳量子点水溶液中进行荧光测试。在细胞及量子点分散液中加入不同量的ZymosanA刺激细胞产生活性氧，通过加入刺激药物前后荧光强度的变化检测细胞释放的活性氧含量。
(6)碳量子点荧光探针用于细胞内成像
Hela细胞分散在皮氏培养皿中，每个培养皿加入1.5mLDMEM培养液。培养二十四小时后，培养液中加入0.1mg/mL碳量子点，并再培养二十四小时确保碳量子点进入细胞内。接着，在实验组的培养液中加入一定量的ZymosanA以刺激细胞产生活性氧，对照组中不加入刺激药物，所有细胞均在培养箱中继续培养30min。最后，倒空培养皿中培养液，用磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH 7.4)清洗三次，加入4％多聚甲醛固定细胞。固定后的细胞用激光扫描共聚焦显微镜获取荧光图像。
附图说明
图1由实施例1制备的碳量子点的高分辨透射电子显微镜表征图。
图2由实施例1制备的碳量子点与超氧阴离子反应前后XPS表征结果图。
图3由实施例1制备的碳量子点用于超氧阴离子检测的荧光扫描图。
图4由实施例1制备的碳量子点选择性评估。
图5由实施例1制备的碳量子点用于细胞内成像结果图及细胞间活性氧检测的荧光扫描图。
图6由实施例2制备的碳量子点的高分辨透射电子显微镜表征图。
图7由实施例2制备的碳量子点与羟基自由基反应前后XPS表征结果图。
图8由实施例2制备的碳量子点用于羟基自由基检测的荧光扫描图。
图9由实施例2制备的碳量子点选择性评估。
图10由实施例2制备的碳量子点用于细胞内成像结果图及细胞间活性氧检测的荧光扫描图。
图11为实施例1、2种量子点的制备方法及其用于检测细胞释放活性氧的过程示意图。
具体实施方式
以下提供根据本发明所制备的用于O2 ·-或·OH选择性检测的基于碳量子点直接猝灭的荧光探针的制备及应用的具体实施方法。
实施例1
步骤(1)以葡萄糖为碳源合成碳量子点(G-CQDs)：
0.67g葡萄糖超声溶解于5mL超纯水，接着加入0.185mL乙二胺。上述溶液转移至容量为25mL的玻璃高压反应釜中，密封后在烘箱中加热至120℃并保持5小时。反应结束后冷却至室温，随后进一步进行透析及过滤处理。
透析过程采用分子截留量500Da的透析袋，在超纯水中透析12小时去除小分子杂质。透析后产物用直径为0.22μm滤膜进行抽滤，去除大分子杂质。滤液经冷冻干燥后得到G-CQDs粉末状量子点固体，放置于干燥器中保存备用。
称取一定量上述G-CQDs粉末溶于超纯水，配制0.1mg/mL碳量子点溶液，并用于下一步O2 ·-的检测。该G-CQDs荧光探针的激发波长为357nm，发射波长为454nm。
步骤(2)G-CQDs与O2 ·-反应前后表面官能团的变化表征
在步骤(1)中的碳量子点溶液中加入过量KO2粉末，充分反应后用步骤(1)中方法进行透析、过滤并冷冻干燥，所得碳量子点粉末通过X射线光电子能谱(XPS)表征其元素种类，通过XPS分峰软件对氮元素及氧元素进行分峰分析。结果表明G-CQDs中大多数氧元素成键状态为C＝O。G-CQDs与O2 ·-反应后，其C＝O含量明显下降，而含氮官能团及碳氧单键含量基本不变，证明O2 ·-可与G-CQDs表面C＝O结合，造成G-CQDs的直接猝灭。
步骤(3)O2 ·-的体外产生及检测：
称取0.264g 18-冠醚-6溶解于10mLDMSO中并超声分散，称取0.0355g KO2粉末，超声溶解于上述混合溶液，得到O2 ·-储备液。其O2 ·-浓度由紫外可见光谱确定，O2 ·-浓度为40mM。
取1mL步骤(1)中制备的0.1mg/mL G-CQDs，与不同体积的O2 ·-储备液混合，在357nm激发波长下检测其荧光强度。荧光发射波长范围为380～580nm。
步骤(4)G-CQDs的选择性及稳定性评估：
选择性评估：取1mL步骤(1)中制备的0.1mg/mL G-CQDs，加入40μM O2 ·-、40μM·OH、100μM H2O2、100μM葡萄糖(Glu)、100μM多巴胺(DA)、100μM抗坏血酸(AA)、100μM 4-乙酰氨基酚(AP)和100μM尿酸(UA)，检测其荧光强度变化。
长期稳定性评估：取1mL步骤(1)中制备的0.1mg/mL G-CQDs检测其荧光强度，一个月后取同一溶液检测其荧光强度，考察前后荧光强度变化。
步骤(5)G-CQDs的细胞毒性评估：
Hela细胞培养在含10％胎牛血清与1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中。细胞培养皿放置于37℃潮湿的培养箱中，箱内流通气体为含5％CO2的空气。
在上述条件下于96孔板中培养Hela细胞。实验组的培养液中加入10mg/mL、1mg/mL、0.1mg/mL、0.01mg/mL和0.001mg/mL的G-CQDs，而对照组中的培养液未加入G-CQDs。培养二十四或四十八小时后，实验组及对照组孔板中均加入等量MTT(体积比为10％)，再培养4小时。之后，孔板内液体被清空，每个孔内加入150μLDMSO，用酶标仪检测细胞存活率。细胞存活率计算公式为：细胞存活率＝(实验组荧光强度平均值/空白组荧光强度平均值)×100％。
步骤(6)G-CQDs用于细胞间活性氧的检测：
Hela细胞培养至对数生长期后，离心除去培养液，并分散在5mL 0.1mg/mL G-CQDs水溶液中进行荧光测试。未加入细胞的同浓度G-CQDs水溶液用于对照。在细胞及量子点分散液中加入0.01mg/mLZymosanA刺激细胞产生活性氧，通过加入刺激药物前后荧光强度的变化检测细胞释放的活性氧含量。
步骤(7)G-CQDs用于细胞内成像：
Hela细胞培养在皮氏培养皿中，培养液中加入0.1mg/mL G-CQDs。在实验组的培养液中加入0.01mg/mLZymosanA以刺激细胞产生活性氧，对照组中不加入刺激药物。培养结束后固定细胞，用激光扫描共聚焦显微镜获取荧光图像。共聚焦扫描条件：425-475nm通道，激发波长为405nm。
实施例2
步骤(1)以柠檬酸为碳源合成碳量子点(C-CQDs)：
以0.67g柠檬酸为碳源，按照实例(1)中的步骤(1)合成及纯化C-CQDs碳量子点。该C-CQDs荧光探针的激发波长为347nm，发射波长为440nm。
步骤(2)C-CQDs与·OH反应前后表面官能团的变化表征
在步骤(1)中的碳量子点溶液中加入过量Fe2+与H2O2产生·OH，充分反应后用步骤(1)中方法进行透析、过滤并冷冻干燥，所得碳量子点粉末通过X射线光电子能谱(XPS)表征其元素种类，通过XPS分峰软件对氮元素及氧元素进行分峰分析。结果表明C-CQDs中大多数氧元素成键状态为C-OH/C-O-C,大多数氮元素成键状态为(C)3-N。C-CQDs与·OH反应后，C-OH/C-O-C与(C)3-N含量明显下降，而碳氧双键含量基本不变，证明·OH可与C-CQDs表面C-OH/C-O-C与(C)3-N结合，造成C-CQDs的直接猝灭。
步骤(3)·OH的体外产生及检测：
·OH通过Fenton反应生成：Fe2++H2O2＝Fe3++OH-+·OH。
取1mL步骤(1)中制备的0.1mg/mL C-CQDs，加入不同体积的Fe2+与H2O2，在347nm激发波长下检测其荧光强度。荧光发射波长范围为380～580nm。
步骤(4)G-CQDs的选择性及稳定性评估：
选择性评估：取1mL步骤(1)中制备的0.1mg/mL C-CQDs，加入25μM·OH、40μM O2 ·-、100μM H2O2、100μM葡萄糖(Glu)、100μM多巴胺(DA)、100μM抗坏血酸(AA)、100μM 4-乙酰氨基酚(AP)和100μM尿酸(UA)，检测其荧光强度变化。
长期稳定性评估：取1mL步骤(1)中制备的0.1mg/mL C-CQDs检测其荧光强度，一个月后取同一溶液检测其荧光强度，考察前后荧光强度变化。
步骤(5)C-CQDs的细胞毒性评估：
使用C-CQDs进行细胞毒性评估，具体过程及其他药物用量与实例(1)中步骤(5)相同。
步骤(6)C-CQDs用于细胞间活性氧的检测：
使用C-CQDs水溶液进行细胞间活性氧的检测，具体过程、药物用量与实例(1)中步骤(6)相同。在347nm激发波长下检测其荧光强度。荧光发射波长范围为380～580nm。
步骤(7)C-CQDs用于细胞内成像：
使用C-CQDs水溶液进行细胞间活性氧的检测，具体过程、药物用量及共聚焦荧光扫描参数与实例(1)中步骤(7)相同。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一种碳量子点荧光探针在选择性检测活性氧中的应用,其特征在于，
（1）通过改变碳源种类有效改变碳量子点表面官能团的种类及含量；所述碳源包括葡萄糖、柠檬酸、尿素、抗坏血酸、离子液体；
（2）合成的碳量子点溶液经冷冻干燥后得到碳量子点固体粉末，对其表面官能团的种类及含量进行表征；
（3）不同碳源合成的各类碳量子点用于不同种类的活性氧的选择性检测，并通过表征其反应前后表面官能团的变化研究其反应机理；
具体步骤为：
（1）碳量子点的合成
碳源超声溶解于超纯水中，接着加入乙二胺；反应体系中碳源质量分数为10%-25%，乙二胺质量分数为2.5%-6.25%，超纯水质量分数为87.5%-68.75%；然后将上述溶液转移至玻璃高压反应釜中，密封后在烘箱中加热至120-300°C，并保持5-24小时；反应结束后冷却至室温，用盐酸水溶液或氢氧化钠水溶液调节 pH 至中性，进一步进行透析及过滤处理；
所述透析采用分子截留量500 Da的透析袋，在超纯水中透析7-24小时，透析后产物用直径为0.22 µm滤膜进行抽滤，滤液经冷冻干燥后得到粉末状量子点固体，放置于干燥器中保存备用；
所述碳源为葡萄糖、柠檬酸、抗坏血酸、尿素或离子液体；
（2）与活性氧反应前后碳量子点表面官能团种类及含量表征
步骤（1）中制备的碳量子点经冻干后通过X射线光电子能谱XPS表征其元素种类，通过XPS分峰软件对各元素进行分峰分析，得到反应前碳量子点表面各元素成键情况及官能团含量；
在步骤（1）中的碳量子点溶液中加入过量活性氧，充分反应后用步骤（1）中方法进行透析、过滤并冷冻干燥，所得碳量子点粉末通过X射线光电子能谱XPS表征其元素种类，通过XPS分峰软件对各元素进行分峰分析，得到反应后碳量子点表面各元素成键情况及官能团含量；
（3）碳量子点荧光探针用于活性氧的检测
用UV-vis光谱确定碳量子点水溶液的最大吸收波长，作为荧光扫描测试中对应的激发波长；在碳量子点水溶液中依次加入一定浓度的不同活性氧，在对应的激发波长下，用荧光扫描仪记录其荧光强度；以对应的荧光强度为纵坐标，加入活性氧的浓度为横坐标，得到线性拟合曲线，曲线斜率为线性范围内荧光探针的灵敏度。
2.根据权利要求1所述一种碳量子点荧光探针在选择性检测活性氧中的应用,其特征在于，碳量子点表面官能团的表征方法，使用X射线光电子能谱XPS对碳量子点粉末进行表征，并对氮元素及氧元素进行分峰拟合分析；碳量子点表面官能团包括C=O、C-OH/C-O-C、(C)3-N、C-N-C。
3.根据权利要求1所述一种碳量子点荧光探针在选择性检测活性氧中的应用,其特征在于，活性氧种类包括超氧阴离子、羟基自由基、单线态氧、过氧化氢。
4.根据权利要求1所述一种碳量子点荧光探针在选择性检测活性氧中的应用,其特征在于，在碳量子点溶液中加入过量活性氧，猝灭后的碳量子点经冷冻干燥得到固体粉末，用X射线光电子能谱对碳量子点粉末进行表征，并对氮元素及氧元素进行分峰拟合分析，观察量子点猝灭前后C=O、C-OH/C-O-C、(C)3-N、C-N-C不同官能团含量的变化。
5.根据权利要求1所述一种碳量子点荧光探针在选择性检测活性氧中的应用,其特征在于，所述碳量子点荧光探针用于细胞间活性氧的检测：
Hela细胞培养至对数生长期后，离心除去培养液，并分散在碳量子点水溶液中进行荧光测试；在细胞及量子点分散液中加入不同量的Zymosan A刺激细胞产生活性氧，通过加入刺激药物前后荧光强度的变化检测细胞释放的活性氧含量。
6.根据权利要求1所述一种碳量子点荧光探针在选择性检测活性氧中的应用,其特征在于，碳量子点荧光探针用于细胞内成像：
Hela细胞分散在皮氏培养皿中，每个培养皿加入1.5 mL DMEM培养液；培养二十四小时后，培养液中加入0.1 mg/mL 碳量子点，并再培养二十四小时确保碳量子点进入细胞内；接着，在实验组的培养液中加入一定量的Zymosan A以刺激细胞产生活性氧，对照组中不加入刺激药物，所有细胞均在培养箱中继续培养30 min；最后，倒空培养皿中培养液，用磷酸盐缓冲溶液清洗三次，加入4% 多聚甲醛固定细胞；固定后的细胞用激光扫描共聚焦显微镜获取荧光图像。
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| 冯晓婷.用于LED的单一基质碳量子点荧光粉的合成与发光性能.《中国博士学位论文全文数据库 信息科技辑》.2016,(第08期),第55-70页. * |
| 用于LED的单一基质碳量子点荧光粉的合成与发光性能;冯晓婷;《中国博士学位论文全文数据库 信息科技辑》;20160815(第08期);第55-70页 * |
| 硫掺杂炭材料的制备与应用;曹伟然 等;《化工进展》;20161231;第35卷(第12期);第3727-3734页 * |
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