CN101671722A - 一种二氧化硅纳米颗粒细胞生物学安全性的评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种二氧化硅纳米颗粒细胞生物学安全性的评价方法，具体步骤为：(1)MTT法检测细胞存活率，(2)细胞形态观察，(3)乳酸脱氢酶(LDH)释放含量测定，(4)细胞内ROS水平的测定，(5)细胞内GSH含量测定，(6)细胞内MDA含量的测定，(7)流式细胞仪分析细胞周期和凋亡，(8)透射电镜观察细胞超微结构。本发明的优点：通过监测生物体应激组分的变化，评价多尺度纳米材料对生物体的影响；采用毒理学和细胞生物学学科交叉技术，从细胞水平对多尺度纳米材料的生物学效应及其作用机制进行研究，创建完整的多尺度纳米材料的安全性评价体系。
Description
【技术领域】
本发明涉及纳米材料技术领域，具体地说，是一种二氧化硅纳米颗粒细胞生物学安全性的评价方法。
【背景技术】
纳米材料(nanoparticles)，是指结构单元的尺寸介于1纳米～100纳米范围之间的颗粒。它处在原子簇和宏观物体交界的过渡区域，从通常的关于微观和宏观的观点看，这样的系统既非典型的微观系统亦非典型的宏观系统，是一种典型的介观系统，它具有表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应。由于它的尺寸已经接近电子的相干长度，它的性质因为强相干所带来的自组织使得性质发生很大变化，即它的光学、热学、电学、磁学、力学以及化学方面的性质和大块固体时相比有显著的不同。
纳米SiO2是我国目前产量最大的纳米材料之一，它是极其重要的高科技超微细无机新材料，其粒径小，比表面积大，表面吸附力强，表面能大，化学纯度高、分散性能好、还有优越的稳定性、补强性、增稠性和触变性，是目前应用较广的纳米材料，在众多学科及领域都有应用。纳米SiO2俗称“超微细白炭黑”，广泛用于各行业各领域，并为相关工业领域的发展提供了新材料基础和技术保证。由于它在磁性、催化性、光吸收、热阻和熔点等方面与常规材料相比显示出特异功能，因而得到人们的极大重视，是目前研究较多的纳米材料，本发明即选取纳米SiO2作为研究对象。
自2000年以来已陆续有科学家针对纳米颗粒对人体健康的研究发表，指出纳米颗粒的确影响人体器宫，尤其是对肺脏及肝脏系统影响更为显著。国外流行病学的长期研究结果也表明，城市空气纳米粒子的浓度与城市人口的肝肺疾病的发病率与死亡率的关系更为密切。近来的研究也有发现纳米材料可以在动物的呼吸道各段和肺泡内沉积。然而，目前人们对纳米尺度物质的生物效应和毒理学效应的认识还十分有限，无论国际还是国内，纳米尺度物质对人体健康的影响研究刚刚起步，它需要生物技术、纳米技术、医学、化学和物理的研究手段进行真正的学科交叉，因此充满了科学创新的机遇。
现已证实10～50nm大小的颗粒可以通过呼吸道进入机体器官，包括人体最重要的中枢神经系统和心脏。1μm大小颗粒就可以通过皮肤角化层，颗粒越小越容易通过，因此人体任何部位暴露面(包括皮肤体表面)都可以有不同程度的吸收纳米颗粒。
研究表明，颗粒越小，其毒性和反应性越大。纳米颗粒引起健康危害主要来自颗粒本身的物理和化学作用：能穿透细胞组织、较强的氧化能力、表面积大可以增加化学反应和吸附有害物质。纳米颗粒比较容易地直接影响的器官可能是肺。由于超细颗粒在肺部的高沉积效果，每次呼吸超细颗粒在肺中滞留颗粒数量比大颗粒要多。因此颗粒越小沉积越多，呼吸越快沉积也越多，这样可以造成人体呼吸等功能损害，尤其是在慢性阻塞性肺部疾病患者中。影响纳米颗粒毒理的因素：纳米颗粒的特性、颗粒数目、颗粒的化学性质、颗粒表面包被情况等。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种二氧化硅纳米颗粒细胞尘物安全性的评价方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种二氧化硅纳米颗粒细胞生物安全性的评价方法，具体步骤为：
(1)MTT法检测细胞存活率
细胞线粒体内琥珀酸脱氢酶能将四氮唑化物MTT由黄色还原为蓝紫色的甲赞，后者溶于有机溶剂DMSO，甲赞的产量与细胞数成正比，在490nm处用酶标仪进行检测吸光度，即可反映细胞存活率和线粒体功能；(1)剂量-效应研究：6种不同尺度的SiO2颗粒，设置2～1000μg/ml浓度组暴露细胞24h，空白对照组加等量体积培养基；实验终止前4h每孔加500μg/ml MTT 10μl；培养结束后，4℃，3000rpm离心5min，小心吸弃上清，每孔加100μlDMSO，震荡10min，待MTT还原产物完全溶解，用酶标仪，以492nm为实验波长，630nm为参照波长，测定吸收度OD；按公式(1-1)计算细胞的存活率，并以纳米SiO2的不同浓度和细胞的存活率作图，确定纳米SiO2的半数致死剂量(LD50)；实验重复三次；(2)时间-效应研究：选不同尺度纳米SiO2分别处理细胞12，24，36，48h；在各时间终点加入MTT，测定方法如上，由吸光度计算细胞存活率，并作时间-存活率曲线；
(2)细胞形态观察
24孔板接种细胞，每孔1ml，细胞浓度105/ml；细胞贴壁后，加入不同浓度纳米SiO2，暴露24h后进行苏木素-伊红(HE)染色处理；染色步骤：(1)4％多聚甲醛固定30min；(2)蒸馏水冲洗5min；(3)苏木素染色10min(20μl苏木素+800μl冰醋酸，现配现用)；(4)冲洗多余的染色液；(5)95％乙醇分化10s；(6)伊红染色液染色2min；然后在光学显微镜下观察，拍照细胞核成蓝黑色，胞浆呈淡红色，凋亡细胞常单个分布，表现为核染色质致密浓缩，核碎裂等；
(3)乳酸脱氢酶(LDH)释放含量测定
LDH是细胞能量代谢(糖酵解)中的一个重要的酶，可以催化乳酸尘成丙酮酸，同时产生ATP；如果细胞死亡，胞膜破裂，那么LDH也就从胞浆中释放出来，LDH是质膜完整性的标志，也是检测细胞死亡的指标，LDH升得越高就说明细胞损伤得越严重；纳米SiO2处理细胞24h后，去培养基上清，按照LDH试剂盒说明书操作，440nm比色测定OD值，并计算LDH活力；
(4)细胞内ROS水平的测定
使用荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS水平，DCFH-DA本身没有荧光，细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF；检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平；细胞用不同浓度纳米SiO2暴露24h后，去除细胞培养液，加入适当体积10μmol/LDCFH-DA；37℃细胞培养箱内孵育20min；用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，充分去除未进入细胞内的DCFH-DA；用多功能酶标仪检测细胞内ROS水平，激发光为488nm，发射光为530nm；
(5)细胞内GSH含量测定
GSH是一种普遍存在于细胞中的含巯基的小分子，对维持细胞中氧化-抗氧化体系平衡具有重要作用，GSH水平的改变是细胞功能损伤的一个重要标志；纳米SiO2处理24h后，离心收集细胞，冰PBS缓冲液洗涤细胞2次，冰PBS缓冲液收集细胞，冰浴中用超声法破碎细胞(20kHz，2min)，显微镜下观察无细胞后，收集细胞匀浆，12000rpm 4℃离心10min；分别取100μl按GSH测定试剂盒说明书操作，405nm比色测定OD，并计算其活性，细胞匀浆中GSH含量用下列公式1-2计算，结果计为空白对照组的GSH含量的百分比，作图；
式中，ODT为测定管吸光度，OD0为空白管吸光度，ODS为标准管吸光度，CS为标准管浓度(20μmol/L)，MGSH为GSH分子量(307)；
(6)细胞内MDA含量的测定
纳米SiO2暴露细胞24h后，离心收集细胞，冰PBS缓冲液洗涤细胞2次，冰PBS缓冲液收集细胞，冰浴中用超声法破碎细胞，显微镜下观察无细胞后，4℃12000rpm离心10min，分别取100μl按MDA测定试剂盒(TAB法)说明书操作，532nm比色测定，并计算其活性，细胞匀浆中MDA含量用下列公式1-3计算，结果计为空白对照组的MDA含量的百分比，作图；
式中，ODT为测定管吸光度，OD0为空白管吸光度，ODS为标准管吸光度，CS为标准管浓度(10nmol/L)；
(7)流式细胞仪分析细胞周期和凋亡
细胞用不同浓度纳米SiO2处到24h后，消化、离心收集细胞(1500rpm，5min)，用PBS缓冲液洗细胞两次，离心收集(1500rpm，5min)，加入预冷的70％乙醇1ml，4℃固定细胞过夜；离心(1500rpm，5min)，去固定液，用PBS缓冲液洗细胞一次，离心收集(1500rpm，5min)；用终浓度为50μg/ml PI染色，室温30min；使用FACSCalibur流式细胞仪检测，CELLQUEST软件分析数据并作图，分析细胞亚G1峰含量变化；
(8)透射电镜观察细胞超微结构
纳米SiO2暴露细胞24h后，离心收集细胞，冷PBS洗2次，3％戊二醛固定30min以上，锇酸固定，经梯度脱水后包埋；超薄切片，透射电镜下观察其超微结构并拍片。
纳米颗粒摄入人体主要通过喉鼻(呼吸)、眼睛、皮肤几个重要的器官，进入人体后，主要作用于肺、肝脏、脾脏等器官，因此为系统全面的在体外用细胞尘物学方法评价纳米颗粒的安全性，本发明所针对的细胞来源于上述器官，所述的细胞选自PC12神经细胞、MRC-5正常人胚胎肺细胞、HEK293肾细胞中的一种；
所述的二氧化硅纳米颗粒的粒径为20～800nm，优选为20～50nm；
所述的二氧化硅纳米颗粒的剂量为2～1000μg/ml；
在此评价方法下得到的安全性指标为：
(1)细胞存活率：
剂量-效应评价
| SiO2粒径(nm) | LD50(μg/ml) |
| 20 | 70-150 |
| 50 | 150-280 |
| 80 | 190-320 |
| 140 | ＞2000 |
| 280 | ＞2000 |
| 800 | ＞2000 |
时间-效应评价
注：-为不明显；±为稍明显；+为明显。
(2)细胞形态：在LD50浓度下，纳米SiO2暴露24h后，细胞发生明显改变，开始皱缩变形碎裂，可见核染色质致密浓缩、凋亡小体；高浓度下大量细胞死亡，变圆，呈单个分布；同时显示在相同剂量下，粒径小比粒径大的颗粒细胞毒性更强；小于100nm的SiO2剂量大于LD50/2起不安全，140nm、280nm、800nm的SiO2剂量小于2000μg/ml时安全；
(3)乳酸脱氢酶(LDH)释放含量：在LD50浓度下，纳米SiO2暴露24h后，不同剂量、不同尺度SiO2暴露细胞24h后，细胞培养液中的LDH含量较对照组均有有意的增加，提示纳米SiO2引起细胞膜损伤；纳米尺度越小，细胞膜损伤越大；小于100nm的SiO2剂量大于LD50/2起不安全，140nm、280nm、800nm的SiO2剂量小于2000μg/ml时安全；
(4)细胞内ROS水平：不同剂量、不同尺度SiO2暴露细胞24h后，细胞内生成ROS水平与对照组比较有有意增加；20nm、50nm、80nm的SiO2剂量大于LD50/2起不安全，140nm、280nm、800nm的SiO2剂量小于2000μg/ml时安全；
(5)细胞内GSH含量：不同剂量、不同尺度SiO2暴露细胞24h后，细胞内GSH耗损与对照组比较有有意减少；小于100nm的SiO2剂量大于LD50/2起不安全，140nm、280nm、800nm的SiO2剂量小于2000μg/ml时安全；
(6)细胞内MDA含量：不同剂量、不同尺度SiO2暴露细胞24h后，细胞内MDA水平与对照组比较有有意增加；小于100nm的SiO2剂量大于LD50/2起不安全，140nm、280nm、800nm的SiO2剂量小于2000μg/ml时安全；
(7)细胞周期和凋亡：不同剂量、不同尺度SiO2暴露SiO2颗粒导致了G2期和S期细胞的增加，同时伴随着G1期细胞的减少；在SiO2暴露浓度大于LD50趋势明显，并且在该浓度下凋亡细胞的比例为20％～30％之间；140nm以下的SiO2颗粒容易引起细胞凋亡，不安全，200nm以上的SiO2颗粒不易进入细胞内，比较安全；20nm、50nm、80nm的SiO2剂量大于LD50/2起不安全，大于150nm的SiO2剂量小于2000μg/ml时安全；
(8)细胞超微结构：透射电镜观察细胞超微结构，观察纳米颗粒进入细胞的过程；140nm以下的SiO2颗粒进入细胞内，不安全，150nm以上的SiO2颗粒不易进入细胞内，比较安全。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
(1)本发明基于纳米颗粒引起生物体应激组分的分析检测方法的创建，通过监测生物体应激组分的变化，评价多尺度纳米材料对生物体的影响；
(2)本发明采用毒理学和细胞生物学学科交叉技术，从细胞水平对多尺度纳米材料的生物学效应及其作用机制进行研究，创建完整的多尺度纳米材料的安全性评价体系。
【具体实施方式】
以下提供本发明一种二氧化硅纳米颗粒细胞生物学安全性的评价方法的具体实施方式。
实施例1
一种二氧化硅纳米颗粒PC12神经细胞尘物学安全性的评价方法，具体步骤为：
一、常用试剂的配制
(1)DMEM培养基
配制1000ml培养基：取DMEM高糖粉13.48g，倒入含750ml双蒸水的烧杯中，充分搅拌溶解；加入1.5g NaHCO3，搅拌溶解后，按比例加入已灭活血清，青、链霉素(最终浓度为100U/ml培养基)，混匀定容至1000ml；0.22μm微孔滤膜无菌过滤后于4℃保存。
(2)磷酸盐缓冲液(PBS)
在800ml蒸馏水中溶解：NaCl 8g，KCl 0.2g，NaH2PO31.44g，KH2PO30.24g，用盐酸调节溶液的pH值至7.4加水定容至1L，高压蒸气灭菌20min，保存于室温。
(3)MTT溶液(5mg/ml)
精密称取50mg MTT，加10ml PBS溶解，磁力搅拌30min，以0.22μm滤膜过滤除菌。于4℃避光保存，可用2周，若暂不用，可冻存。
(4)PI染液(50μg/ml)
50μg/ml PI染液配方如下：
5％ TritonX-100 20μl
100mM EDTA 10μl
500μg/ml PI 1ml
4mg/ml RNaseA 12.5μl
PBS 8.958ml
(5)考马斯亮蓝试剂(蛋白定量用)
精确称取100mg考马斯亮蓝G-250溶解在50ml 95％乙醇中，加入100ml 85％的磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤后除去不溶物；所得0.01％的考马斯亮蓝G-250溶液室温保存。
(7)细胞裂解液
细胞裂解液配方如下：
50mmol/L Tris-HCl 100ml
NaCl 0.08775g
叠氮钠 0.002g
SDS 0.01g
Aprotinin 0.001g
NP-40 0.1g
去氧胆酸钠 0.05g
PMSF 0.001g
二、细胞培养及药物处理
未分化PC12细胞购自中国科学研究院上海细胞生物研究所；培养液选用DMEM培养基，内含5％小牛血清、10％马血清，在5％CO2、37℃条件下培养。
纳米材料预处理：将SiO2纳米颗粒悬浮液置60℃水浴中10h，然后37℃水浴过夜；如此反复3次，灭菌处理；小瓶分装，4℃保存。
未分化PC12为悬浮细胞，待细胞进入对数生长期，吹散，800rpm离心细胞悬液，调节细胞浓度，接种于不同的细胞培养板或培养皿中；12h后，培养基更换为含1％小牛血清DMEM培养基，用不同浓度的纳米SiO2进行处理，同时设对照孔。
三、MTT法检测细胞存活率
细胞线粒体内琥珀酸脱氢酶能将四氮唑化物MTT由黄色还原为蓝紫色的甲赞，后者溶于有机溶剂DMSO，甲赞的产量与细胞数成正比，在490nm处用酶标仪进行检测吸光度，即可反映细胞存活率和线粒体功能；(1)剂量-效应研究：6种不同尺度的SiO2颗粒，设置2，20，100，200，500，1000μg/ml浓度组暴露细胞24h，空白对照组加等量体积培养基。实验终止前4h每孔加500μg/ml MTT 10μl；培养结束后，4℃，3000rpm离心5min，小心吸弃上清，每孔加100μl DMSO，震荡10min，待MTT还原产物完全溶解，用酶标仪，以492nm为实验波长，630nm为参照波长，测定吸收度OD；按公式(2-1)计算细胞的存活率，并以纳米SiO2的不同浓度和细胞的存活率作图，确定纳米SiO2的半数致死剂量(LD50)；实验重复三次；(2)时间-效应研究：选两种小尺度纳米SiO2(20，50nm)分别处理细胞12，24，36，48h；在各时间终点加入MTT，测定方法如上，由吸光度计算细胞存活率，并作时间-存活率曲线。
式中，ODT为纳米SiO2暴露组吸光度，ODC为空白对照组吸光度。
四、未分化PC12细胞形态观察
PC12细胞经纳米SiO2暴露24h后，倒置显微镜下观察，拍照。
五、透射电镜观察细胞超微结构
纳米SiO2暴露PC12细胞24h后，离心收集细胞，冷PBS洗2次，3％戊二醛固定30min以上，锇酸固定，经梯度脱水后包埋；超薄切片，透射电镜下观察其超微结构并拍片。
六、乳酸脱氢酶释放实验
乳酸脱氢酶(LDH)是细胞能量代谢中的一个重要的酶，催化丙酮酸和乳酸的相互转化；如果细胞死亡，胞膜破裂，那么LDH也就从胞浆中释放出来，LDH是质膜完整性的标志，也是检测细胞死亡的指标，LDH升得越高就说明细胞损伤得越严重；纳米SiO2处理细胞24h后，去培养基上清，按照LDH试剂盒说明书操作，440nm比色测定OD值，并计算LDH活力。
七、细胞内ROS水平的测定
荧光探针DCFHDA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，被细胞内的酯酶水解尘成DCFH；而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内；细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF；检测DCF的荧光就可以知道细胞内ROS的水平；细胞用SiO2处理24h后，去除细胞培养液，加入适当体积10μmol/L DCFH-DA；在37℃细胞培养箱内孵育20min；用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA；用多功能酶标仪检测细胞内ROS水平，激发光为488nm，发射光为530nm。
九、细胞内GSH含量测定
纳米SiO2暴露PC12细胞24h后，离心收集细胞，冰PBS缓冲液洗涤细胞2次，冰PBS缓冲液收集细胞，冰浴中用超声法破碎细胞(20kHz，2min)，显微镜下观察无细胞后，显微镜下观察无细胞后，收集细胞匀浆，12000rpm 4℃离心10min；分别取100μl按GSH测定试剂盒说明书操作，405nm比色测定OD，并计算其活性，细胞匀浆中GSH含量用下列公式计算，结果计为空白对照组的GSH含量的百分比，作图，
式中，ODT为测定管吸光度，OD0为空白管吸光度，ODS为标准管吸光度，CS为标准管浓度(20μmol/L)，MGSH为GSH分子量(307)。
八、细胞内MDA含量的测定
MDA是一种生物毒性很强的脂质过氧化的代表产物，因而MDA的含量可反映机体或细胞脂质过氧化程度；MDA可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰；纳米SiO2暴露细胞24h后，离心收集细胞，冰PBS缓冲液洗涤细胞2次，冰PBS缓冲液收集细胞，冰浴中用超声法破碎细胞(20kHz，2min)，显微镜下观察无细胞后，12000rpm 4℃离心10min，分别取100μl按MDA测定试剂盒(TBA法)说明书操作，532nm比色测定，并计算其活性，细胞匀浆中MDA含量用下列公式计算，结果计为空白对照组的MDA含量的百分比，作图，
式中，ODT为测定管吸光度，OD0为空白管吸光度，ODS为标准管吸光度，CS为标准管浓度(10nmol/L)。
十、Bradford比色法测定细胞蛋白含量
在小试管中加入1.0mg/ml牛血清白蛋白1、2、4、6、8μl，用0.015MNaCl补足300μl，每管加入3ml考马斯亮蓝染液，混匀，用1cm光径比色皿测595nm处吸光度OD，根据吸光度绘制标准曲线。
细胞经纳米SiO2暴露后，将平皿置于冰浴上，加人冰浴PBS，洗两遍；加入细胞裂解液，冰浴上处理30min；收集细胞裂解液，12000rpm离心15min，取上清用Bradford比色法测定细胞蛋白含量。
十一、流式细胞仪分析PC12细胞周期和凋亡
细胞周期(cell cycle)是指细胞从上一次分裂结束开始生长到下一次分裂终了所经历的过程，所需的时间则称细胞周期时间；细胞周期分为G1，S，G2和M四期；G1期是DNA合成前期，是细胞周期的关键步骤，细胞周期长短决定于G1期长度；S期是DNA合成期；G2期是DNA合成后期；M期指有丝分裂期；M期一结束，2个子代细胞就形成了；PI是一种溴化乙啶的类似物，它在嵌入双链DNA后释放红色荧光，用流式细胞仪可检测其荧光强度从而反映细胞周期；凋亡细胞DNA发生断裂，导致大量的DNA含量丢失，因此可在流式细胞仪检测出一个不同的亚G1峰。
PC12细胞用不同浓度纳米SiO2暴露24h后，离心收集细胞(1500rpm，5min)，用PBS缓冲液洗细胞两次，离心收集(1500rpm，5min)，加入预冷的70％乙醇1ml，4℃固定细胞过夜；离心(1500rpm，5min)，去固定液，用PBS缓冲液洗细胞一次，离心收集(1500rpm，5min)；用终浓度为50μg/ml的PI染色，室温30min；使用FACSCalibur流式细胞仪检测，CELLQUEST软件分析数据并作图，分析细胞亚G1峰含量变化。
十二、PC12细胞分化实验
取处于对数尘长期的PC12细胞，离心收集细胞(800rpm，5min)，用1％小牛血清的DMEM培养液悬浮细胞，无菌吸管轻轻吹打数次，使PC12细胞分散成单细胞悬液，在倒置显微镜下计数，用培养液稀释细胞，最后将稀释的细胞悬液加到24孔塑料培养板中，每孔500μl，细胞密度为5×104cells/ml；在37℃，5％CO2孵箱中培养1天，建立NGF培养组和对照组：(1)对照组：不加入NGF；(2)NGF组：向1％小牛血清的DMEM培养液中加入NGF，使终浓度分别为50ng/ml；隔天更换新鲜NGF-DMEM培养基；在倒置显微镜下连续观察细胞的形态学变化；第7天，NGF组用不同浓度纳米SiO2暴露24h，纳米SiO2终浓度为25，50和100μg/ml；纳米SiO2暴露24h后，再倒置显微镜下观察细胞形态变化，拍照；统计不同浓度SiO2处理后PC12细胞轴突生长情况，包括每个细胞的轴突数，轴突长度以及细胞间连接的轴突数。
十三、PC12细胞分化实验，其具体步骤为
取处于对数生长期的PC12细胞，离心收集细胞(800rpm，5min)，用1％小牛血清的DMEM培养液悬浮细胞，无菌吸管轻轻吹打数次，使PC12细胞分散成单细胞悬液，在倒置显微镜下计数，用培养液稀释细胞，最后将稀释的细胞悬液加到24孔塑料培养板中，每孔500μl，细胞密度为5×104cells/ml；在37℃，5％CO2孵箱中培养1天，建立NGF培养组和对照组：(1)对照组：不加入NGF；(2)NGF组：向1％小牛血清的DMEM培养液中加入NGF，使终浓度分别为50ng/ml；隔天更换新鲜NGF-DMEM培养基；在倒置显微镜下连续观察细胞的形态学变化；第7天，NGF组用不同浓度纳米SiO2暴露24h，纳米SiO2终浓度为25，50和100μg/ml；纳米SiO2暴露24h后，再倒置显微镜下观察细胞形态变化，拍照；统计不同浓度SiO2处理后PC12细胞轴突生长情况，包括每个细胞的轴突数，轴突长度以及细胞间连接的轴突数。
十四、统计方法
结果以均值±标准差(MEAN±SD)表示，并以t检验进行统计学分析。
对于本实施例，得到的结论为：
(1)通过对六种不同尺度纳米SiO2细胞毒性的研究，发现纳米SiO2对未分化PC12细胞的毒性呈尺度依赖性，纳米颗粒尺度越小，对细胞的毒性越明显，尺度大于100nm的SiO2颗粒对PC12细胞明显小于100nm的SiO2颗粒。
(2)纳米SiO2对PC12细胞的毒性呈剂量和时间依赖性。100nm以内的三种纳米SiO2，在20-500μg/ml浓度范围内，随着纳米颗粒浓度的提高，作用时间的延长，细胞死亡率显著增加，纳米SiO2对PC12细胞的毒性呈剂量和时间相关性；20-nm，50-nm SiO2对未分化PC12细胞的半数致死量LD50分别为150±10.5μg/ml，300±12.5μg/ml。
(3)通过形态学观察发现，未分化PC12细胞在纳米SiO2的作用下发尘明显的形态改变，细胞收缩变形，呈单个分布，细胞内颗粒物增多，透明度下降，表明纳米SiO2能够明显抑制细胞的生长；透射电镜切片表明纳米SiO2可穿过细胞膜进入细胞。
(4)对细胞氧化应激水平的测定显示，随着SiO2剂量的增大，细胞内ROS水平升高，而GSH含量降低，脂质过氧化物MDA含量升高；提示纳米SiO2引起细胞的氧化应激效应，细胞内氧化-抗氧化平衡被打破，细胞氧化应激损伤程度加大，引起脂质过氧化反应。氧化损伤在纳米SiO2诱导的细胞毒性的中起重要作用。
(5)纳米SiO2造成PC12细胞膜损伤，导致LDH外漏；同时，纳米SiO2还导致剂量依赖性的细胞凋亡细胞坏死。
(6)PC12细胞分化试验表明，NGF有效诱导PC12细胞向神经元分化。纳米SiO2暴露分化PC12细胞后，导致细胞分化能力退化，细胞生成轴突数量减少，轴突缩短，细胞间建立的通信减少或消失。
实施例2
一种二氧化硅纳米颗粒HEK293人胚肾细胞生物学安全性的评价方法，具体步骤为：
一、常用试剂的配制
胰蛋白酶(trypsin)液(0.25％)
精密称取胰蛋白酶0.25g，EDTA 0.0185g，溶于100ml PBS液中，用0.22μm膜过滤灭菌，小瓶分装，-20℃保存备用。
DMEM培养基，PBS缓冲液及其他常用试剂的配置同实施例1。
二、细胞培养及药物处理
HEK293细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所，培养液选用10％小牛血清DMEM，在5％CO2、37℃条件下培养；待细胞进入对数生长期，用0.25％胰蛋白酶消化传代。
实验前对纳米材料先进行预处理：将SiO2纳米颗粒悬浮液置60℃水浴中10h，然后37℃水浴过夜，如此反复3次，灭菌处理；小瓶分装，4℃保存。
待细胞进入对数生长期，用0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调节细胞浓度，接种于不同的孔板中；待12h细胞贴壁后，培养基更换为1％血清培养基，用不同浓度的纳米SiO2(20，50nm)进行处理，同时设对照孔。
三、MTT法检测细胞存活率
依据活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化物(MTT)由黄色还原为蓝紫色的甲赞，后者溶于有机溶剂DMSO，甲赞的产量与细胞数成正比，在490nm处用酶标仪进行检测吸光度，即可反映细胞存活率和线粒体功能；(1)剂量-效应研究：20-nm，50-nmSiO2分别设0，2，20，100，200，500，1000μg/ml浓度组处理24h；(2)时间-效应研究：以不同浓度两种纳米SiO2分别处理细胞0，12，24，36，48h；实验终止前4h每孔加500μg/ml MTT 10μl；培养结束后，小心吸弃上清，每孔加100μl DMSO，震荡10min，待MTT还原产物完全溶解，用MK3酶标仪，以492nm为实验波长，630nm为参照波长，测定吸收度OD；计算细胞的存活率，并以药物的不同浓度和细胞的存活率作图，确定药物的半数已知浓度(LD50)，实验重复三次，
式中，ODT为纳米SiO2暴露组吸光度，ODC为空白对照组吸光度。
四、细胞形态观察
24孔板接种细胞，每孔1ml，细胞浓度105/ml；细胞贴壁后，加入不同浓度纳米SiO2，暴露24h后进行苏木素-伊红(HE)染色处理；染色步骤：(1)4％多聚甲醛固定30min；(2)蒸馏水冲洗5min；(3)苏木素染色10min(20μl苏木素+800μl冰醋酸，现配现用)；(4)冲洗多余的染色液；(5)95％乙醇分化10s；(6)伊红染色液染色2min；然后在光学显微镜下观察，拍照细胞核成蓝黑色，胞浆呈淡红色，凋亡细胞常单个分布，表现为核染色质致密浓缩，核碎裂等。
五、乳酸脱氢酶释放含量测定
LDH是细胞能量代谢(糖酵解)中的一个重要的酶，可以催化乳酸生成丙酮酸，同时产生ATP；如果细胞死亡，胞膜破裂，那么LDH也就从胞浆中释放出来，LDH是质膜完整性的标志，也是检测细胞死亡的指标，LDH升得越高就说明细胞损伤得越严重；纳米SiO2处理细胞24h后，去培养基上清，按照LDH试剂盒说明书操作，440nm比色测定OD值，并计算LDH活力。
六、细胞内ROS水平的测定
使用荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS水平，DCFH-DA本身没有荧光，细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF；检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平；HEK293细胞用不同浓度纳米SiO2暴露24h后，去除细胞培养液，加入适当体积10μmol/L DCFH-DA；37℃细胞培养箱内孵育20min；用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，充分去除未进入细胞内的DCFH-DA；用多功能酶标仪检测细胞内ROS水平，激发光为488nm，发射光为530nm。
七、细胞内GSH含量测定
GSH是一种普遍存在于细胞中的含巯基的小分子，对维持细胞中氧化-抗氧化体系平衡具有重要作用，GSH水平的改变是细胞功能损伤的一个重要标志；纳米SiO2处理24h后，离心收集细胞，冰PBS缓冲液洗涤细胞2次，冰PBS缓冲液收集细胞，冰浴中用超声法破碎细胞(20kHz，2min)，显微镜下观察无细胞后，收集细胞匀浆，12000rpm 4℃离心10min；分别取100μl按GSH测定试剂盒说明书操作，405nm比色测定OD，并计算其活性，细胞匀浆中GSH含量用下列公式计算，结果计为空白对照组的GSH含量的百分比，作图，
式中，ODT为测定管吸光度，OD0为空白管吸光度，ODS为标准管吸光度，CS为标准管浓度(20μmol/L)，MGSH为GSH分子量(307)。
八、细胞内MDA含量的测定
纳米SiO2暴露细胞24h后，离心收集细胞，冰PBS缓冲液洗涤细胞2次，冰PBS缓冲液收集细胞，冰浴中用超声法破碎细胞，显微镜下观察无细胞后，4℃12000rpm离心10min，分别取100μl按MDA测定试剂盒(TAB法)说明书操作，532nm比色测定，并计算其活性，细胞匀浆中MDA含量用下列公式计算，结果计为空白对照组的MDA含量的百分比，作图。
式中，ODT为测定管吸光度，OD0为空白管吸光度，ODS为标准管吸光度，CS为标准管浓度(10nmol/L)。
九、Bradford比色法测定细胞蛋白含量
在小试管中加入1.0mg/ml牛血清白蛋白(用0.5mM NaCl配置)1、2、4、6、8μl，用0.015M NaCl补足300μl，每管加入3ml考马斯亮蓝染液，混匀，用1cm光径比色皿测595nm处吸光度OD，根据吸光度绘制标准曲线。
细胞经纳米SiO2暴露后，将平皿置于冰浴上，加人冰浴PBS，洗两遍；加入细胞裂解液，冰浴上处理30min；收集细胞裂解液，12000rpm离心15min，取上清用Bradford比色法测定细胞蛋白含量。
十、流式细胞仪分析细胞周期和凋亡
细胞用不同浓度纳米SiO2处理24h后，消化、离心收集细胞(1500rpm，5min)，用PBS缓冲液洗细胞两次，离心收集(1500rpm，5min)，加入预冷的70％乙醇1ml，4℃固定细胞过夜。离心(1500rpm，5min)，去固定液，用PBS缓冲液洗细胞一次，离心收集(1500rpm，5min)。用终浓度为50μg/ml PI染色，室温30min；使用FACSCalibur流式细胞仪检测，
CELLQUEST软件分析数据并作图，分析细胞亚G1峰含量变化。
十一、统计方法
结果以均值±标准差(MEAN±SD)表示，并以t检验进行统计学分析。
对于本实施例，得到的结论为：
(1)纳米SiO2对HEK293细胞的毒性呈剂量依赖性和时间依赖性。在20-200μg/ml剂量范围内，毒性随剂量的增加和暴露时间的延长而急剧增加；20-nm，50-nm SiO2对HEK293细胞的半数致死量LD50分别为80±6.4μg/ml，140±8.6μg/ml。
(2)对细胞氧化应激水平的测定显示，在一定的浓度范围内，随着SiO2浓度的增大，胞浆内ROS异常水平升高，MDA含量升高，而GSH含量降低，提示纳米SiO2使细胞的氧化应激效应增强，而GSH消耗不足以抵消ROS的增加，细胞内氧化-抗氧化平衡被打破，细胞氧化应激损伤程度加大，导致脂质过氧化作用。
(3)LDH释放实验表明纳米SiO2引起了细胞膜损伤，从而可导致细胞坏死。
(4)流式细胞分析的结果显示，纳米SiO2抑制细胞的增殖，G1期细胞减少，G2和S期细胞有所增加。同时纳米SiO2导致了剂量依赖性的细胞凋亡。
总之，纳米SiO2导致HEK293细胞存活率下降，在一定的剂量范围内，其毒性呈剂量依赖性；纳米SiO2引起HEK293细胞内氧化应激和脂质过氧化反应，抑制细胞增殖，诱发细胞坏死和凋亡；纳米SiO2具有较明显的肾细胞毒性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。
Claims (5)
1.一种二氧化硅纳米颗粒细胞生物学安全性的评价方法，其特征在于，具体步骤为：
(1)MTT法检测细胞存活率
细胞线粒体内琥珀酸脱氢酶能将四氮唑化物MTT由黄色还原为蓝紫色的甲赞，后者溶于有机溶剂DMSO，甲赞的产量与细胞数成正比，在490nm处用酶标仪进行检测吸光度，即可反映细胞存活率和线粒体功能；(1)剂量-效应研究：6种不同尺度的SiO2颗粒，设置2～1000μg/ml浓度组暴露细胞24h，空白对照组加等量体积培养基；实验终止前4h每孔加500μg/ml MTT 10μl；培养结束后，4℃，3000rpm离心5min，小心吸弃上清，每孔加100μlDMSO，震荡10min，待MTT还原产物完全溶解，用酶标仪，以492nm为实验波长，630nm为参照波长，测定吸收度OD；按公式(1-1)计算细胞的存活率，并以纳米SiO2的不同浓度和细胞的存活率作图，确定纳米SiO2的半数致死剂量；实验重复三次；(2)时间-效应研究：不同尺度纳米SiO2分别处理细胞12，24，36，48h；在各时间终点加入MTT，测定方法如上，由吸光度计算细胞存活率，并作时间-存活率曲线；
(2)细胞形态观察
24孔板接种细胞，每孔1ml，细胞浓度105/ml；细胞贴壁后，加入不同浓度纳米SiO2，暴露24h后进行苏木素-伊红HE染色处理；染色步骤：(1)4％多聚甲醛固定30min；(2)蒸馏水冲洗5min；(3)苏木素染色10min；(4)冲洗多余的染色液；(5)95％乙醇分化10s；(6)伊红染色液染色2min；然后在光学显微镜下观察，拍照细胞核成蓝黑色，胞浆呈淡红色，凋亡细胞常单个分布，表现为核染色质致密浓缩，核碎裂；
(3)乳酸脱氢酶LDH释放含量测定
LDH是细胞能量代谢中的一个重要的酶，催化乳酸生成丙酮酸，同时产生ATP；如果细胞死亡，胞膜破裂，那么LDH也就从胞浆中释放出来，LDH是质膜完整性的标志，也是检测细胞死亡的指标，LDH升得越高就说明细胞损伤得越严重；纳米SiO2处理细胞24h后，去培养基上清，按照LDH试剂盒说明书操作，440nm比色测定OD值，并计算LDH活力；
(4)细胞内ROS水平的测定
使用荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS水平，DCFH-DA本身没有荧光，细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF；检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平；细胞用不同浓度纳米SiO2暴露24h后，去除细胞培养液，加入适当体积10μmol/LDCFH-DA；37℃细胞培养箱内孵育20min；用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，充分去除未进入细胞内的DCFH-DA；用多功能酶标仪检测细胞内ROS水平，激发光为488nm，发射光为530nm；
(5)细胞内GSH含量测定
GSH是一种普遍存在于细胞中的含巯基的小分子，对维持细胞中氧化-抗氧化体系平衡具有重要作用，GSH水平的改变是细胞功能损伤的一个重要标志；纳米SiO2处理24h后，离心收集细胞，冰PBS缓冲液洗涤细胞2次，冰PBS缓冲液收集细胞，冰浴中用超声法破碎细胞(20kHz，2min)，显微镜下观察无细胞后，收集细胞匀浆，12000rpm 4℃离心10min；分别取100μl按GSH测定试剂盒说明书操作，405nm比色测定OD，并计算其活性，细胞匀浆中GSH含量用下列公式1-2计算，结果计为空白对照组的GSH含量的百分比，作图；
式中，ODT为测定管吸光度，OD0为空白管吸光度，ODS为标准管吸光度，CS为标准管浓度，MGSH为GSH分子量；
(6)细胞内MDA含量的测定
纳米SiO2暴露细胞24h后，离心收集细胞，冰PBS缓冲液洗涤细胞2次，冰PBS缓冲液收集细胞，冰浴中用超声法破碎细胞，显微镜下观察无细胞后，4℃12000rpm离心10min，分别取100μl按MDA测定试剂盒说明书操作，532nm比色测定，并计算其活性，细胞匀浆中MDA含量用下列公式1-3计算，结果计为空白对照组的MDA含量的百分比，作图；
式中，ODT为测定管吸光度，OD0为空白管吸光度，ODS为标准管吸光度，CS为标准管浓度；
(7)流式细胞仪分析细胞周期和凋亡
细胞用不同浓度纳米SiO2处理24h后，消化、离心收集细胞，离心条件为1500rpm，5min，用PBS缓冲液洗细胞两次，离心收集，离心条件为1500rpm，5min，加入预冷的70％乙醇1ml，4℃固定细胞过夜；离心条件为1500rpm，5min，去固定液，用PBS缓冲液洗细胞一次，离心收集，离心条件为1500rpm，5min；用终浓度为50μg/ml PI染色，室温30min；使用FACSCalibur流式细胞仪检测，CELLQUEST软件分析数据并作图，分析细胞亚G1峰含量变化；
(8)透射电镜观察细胞超微结构
纳米SiO2暴露细胞24h后，离心收集细胞，冷PBS洗2次，3％戊二醛固定30min以上，锇酸固定，经梯度脱水后包埋；超薄切片，透射电镜下观察其超微结构并拍片。
2.如权利要求1所述的一种二氧化硅纳米颗粒细胞生物学安全性的评价方法，其特征在于，所述的细胞选自PC12神经细胞、MRC-5正常人胚胎肺细胞、HEK293肾细胞中的一种。
3.如权利要求1所述的一种二氧化硅纳米颗粒细胞生物学安全性的评价方法，其特征在于，所述的二氧化硅纳米颗粒的粒径为20～800nm。
4.如权利要求3所述的一种二氧化硅纳米颗粒细胞生物学安全性的评价方法，其特征在于，所述的二氧化硅纳米颗粒的粒径为20～50nm。
5.如权利要求1所述的一种二氧化硅纳米颗粒细胞生物学安全性的评价方法，其特征在于，所述的二氧化硅纳米颗粒的剂量为2～1000μg/ml。
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