CN102213672A - 一种快速定量线虫存活率的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速定量线虫存活率的方法及试剂盒，具体是首先采用染料TTC对线虫进行染色，由于活线虫着色，死线虫不着色，且光吸收值与活线虫的数量成正比，从而直接可反映线虫的存活率，并据此制备试剂盒。这种方法及试剂盒可以在以线虫存活率为指标的药物筛选、农药筛选、环境评价、水质评价等方面应用。本发明在操作上快速、简单易行，对设备要求不高，成本低廉，具有很高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速定量线虫存活率的方法及试剂盒，该方法及试剂盒可在药物筛选、农药筛选、环境评价、水质评价等方面应用，属于生物技术领域。
背景技术
秀丽隐杆线虫（C.elegans）是一种生长在土壤中的线虫，以细菌为食，很容易在实验室培养。成虫体长1mm，且通体透明，在显微镜下易于观察。L3～L4期对外界敏感。从一个受精卵发育成可以产卵的成虫，它只需要3天。在自然状态下，秀丽隐杆线虫绝大部分个体为雌雄同体，其一生能产生约300个受精卵，如果在一个培养皿上放几只线虫，几天之后就可得到大量的后代（庞林海等，2007）。上述这些特点使得秀丽隐杆线虫在很多方面都有应用（秦峰松和杨崇林，2006）。
厦门大学柯翎等人（2004）以秀丽隐杆线虫作为重金属污染的指示生物，研究了Cu2+，Cd2+，Pb2+，Zn2+等4种重金属离子对秀丽隐杆线虫的毒性，发现重金属离子浓度越高，毒性越强，线虫死亡率越高。在高浓度组中线虫的中毒反应较迅速，短期内就出现死亡；而在低浓度组，中毒反应较慢，经较长时间才出现死亡，对照组相对其他各组，存活时间最长。北京师范大学的鄢雯等（2005）人将秀丽隐杆线虫用于环境水质的监测，同样发现秀丽隐杆线虫存活率与水样毒性之间存在紧密的关系，水样毒性越大，线虫死亡率越高，因此可用秀丽隐杆线虫的存活率评价饮用水源水和水厂工艺水水样毒性。王晓等人（2007）也将秀丽隐杆线虫用于对造纸厂废水中酸碱类毒物的追踪。实验显示，用秀丽隐杆线虫指示重金属危害、水样毒性大小等既降低了实验成本，又提高了检测效率。万树青（1993）等人用秀丽隐杆线虫的死亡率来评价棉酚，克线磷，甲基异柳磷，氧乐果，灭多威，硫酸铜等多种农药的杀虫效果。国外将秀丽隐杆线虫用于体内驱虫药物药效筛选的研究已有相关的文章发表（Gnoula等，2007），为驱虫药的体外研究提供了可行方法，并且呈现良好的选择性、准确度及重复性，而且成本低廉。这些研究表明，线虫死亡率的大小反应了供试药物的药效和毒性的大小。王摆（2006）以自由海洋线虫Chromadorina sp.为模型动物，选择水溶性的重金属镉离子和不溶于水的环境雌激素双酚A，以线虫的死亡率为指标，测试了两种化学物质对Chromadorina sp.的急性毒性。由此可见，线虫可在药物筛选、农药筛选、环境评价、水质评价等方面应用。
在以上诸多方面的应用中对线虫死活的判断是关键技术。在涉及线虫死亡或存活进行判断的现有技术中，万树青等（1993）人试图通过染色方法来区分死活线虫从而测定被测物杀线剂的活性，他们比较了中性红，甲基蓝，番红花红，曙红等4种染料的染色效果，发现这4种染料都能使死线虫着色，而活线虫不着色，番红花红效果最好。但是这种方法仍然需要在显微镜下一一计数，工作量很大。国外学者用MTT法检测了驱虫药物左旋咪唑对自由生活的幼体线虫存活率的影响（Catherine 等，2007；Smith等2009），但此方法用MTT对线虫染色的时间为3至24小时，且用DMSO溶出甲臢需要1小时，比较费时。而且， MTT价格昂贵，sigma公司产品1g参考价格为1413.36元，而同为sigma公司产品的TTC 5g参考价格为243元。美国专利（专利号为20060191023）公开了一种应用荧光染色剂法来鉴别死活线虫的染色方法。这种方法已用于驱虫药物的筛选研究，由于染色后活的线虫无荧光，而死亡的线虫有荧光，利用测试荧光强度的大小来确定线虫的死亡率，这样为高通量筛选提供了保证，但此法需要荧光酶标仪，对设备要求很高，难以在普通实验室和基层得以推广和应用。中国专利（专利号为200710202068.8）公开了一种应用中性红染料来鉴别死活线虫的染色方法。该方法可以使死线虫着色，活线虫不着色，但染色后需要裂解线虫释放染料后再测定染料的吸光值，步骤繁琐，比较费时。
通过对上述涉及线虫死亡或存活进行判断的现有技术分析可以看出，现有技术费时、费力、而且成本较高或需要昂贵的仪器设备，市场急需一种简单易行、成本低廉、不需昂贵的仪器设备就能进行快速定量线虫存活率的新方法，可以广泛应用于新药筛选、农药筛选、环境评价及水质评价等领域。
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发明内容
鉴于现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种简单易行、成本低廉的快速定量线虫存活率的新方法及试剂盒，可以广泛应用于新药筛选、农药筛选、环境评价及水质评价等领域。具体内容如下：
一种快速定量线虫存活率的方法，采用染料对线虫进行染色，由于活线虫着色，死线虫不着色，且光吸收值与活线虫的数量成正比，从而直接可反映线虫的存活率，该方法应用的染料是红四氮唑或称四氮红唑（全称为：2，3，5-三苯基氯化四氮唑；英文名称为：2,3,5-Triphenyl tetrazolium chloride，简写为TTC或TZ），分子式为C19H15ClN4。
TTC原理：存活状态的线虫存在呼吸作用，在呼吸过程中产生还原态脱氢辅酶I或II（NADH2或NADPH2）。当TTC的无色溶液渗入活线虫的活细胞内并作为氢受体被脱氢辅酶上的氢还原时，生成一种红色、稳定、不会扩散和不溶于水的三苯基甲臢（TTF）。化学方程式如下：
TTC(无色) TTF（红色）
因此，能被TTC溶液染成红色的线虫即为活线虫。染色后用DMSO或甲醇溶出甲臢，或用甘油做透明剂，即可用普通酶标仪在一定波长处检测吸光值，从而对活线虫进行定量。
该方法中的线虫是自由生活的种类，或者是寄生生活的种类，优选秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）。
以经过同步化的秀丽隐杆线虫为实验材料，用常规方法制成均匀分布的线虫液。吸取等量的均匀分布的线虫液，加入多孔板。线虫数量为15～1500条。
该方法中的线虫是处于任一发育阶段的线虫，自由生活的线虫是选自一期幼体线虫至成虫的任一发育阶段线虫，寄生生活的是自由生活时期幼体线虫。其他自由生活种类的线虫培养及同步化可以采用同秀丽隐杆线虫相同的方法获得足够数量的线虫个体用于实验。寄生性线虫种类如根结线虫和孢囊线虫可以采其卵块或孢囊，然后，置于水中孵化，一般一个卵块或孢囊含大约3000枚线虫卵，孵化后可获得相应数量的线虫幼体。根据实验需要采集足够的卵块或孢囊，即可获得足够数量的线虫个体用于实验。
染色温度为4℃～35℃、染料浓度为0.1%～20%、染色时间为5min～45min，染色后，水洗涤染色液洗至溶液澄清，弃掉上清。染色后用DMSO或甲醇溶出甲臢，或用甘油做透明剂，即可用酶标仪在485nm或490nm波长处检测吸光值，从而对活线虫进行定量。
最后，由于测定了线虫存活率，其死亡率为100%减去所测定的存活率，这是同领域人员所公知的，因而本方法也可以用于测定线虫的死亡率。
该方法可广泛应用于新药筛选、农药筛选、环境评价及水质评价领域。
此外，利用本发明还可制备成一种快速定量线虫存活率或死亡率的试剂盒，该试剂盒含有染料红四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC），分子式为C19H15ClN4。可测定线虫存活率或死亡率，更广泛应用于新药筛选、农药筛选、环境评价及水质评价领域。
该试剂盒可以含有线虫，其中的线虫是自由生活的种类，或者是寄生生活的种类，优选秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）。
该试剂盒中的线虫是处于任一发育阶段的线虫，自由生活的线虫是选自一期幼体线虫至成虫的任一发育阶段线虫，寄生生活的是自由生活时期的幼体线虫，线虫数量为15～1500条。
该试剂盒染色温度为4℃～35℃、染料浓度为0.1%～20%、染色时间为5min～45min。
该试剂盒含有二甲基亚砜（DMSO）或甲醇或甘油。
与现有技术相比，本发明所提供的方法及试剂盒可直接检测线虫存活率，不用裂解线虫，操作快速、简单；设备、费用要求低，在普通实验室就可实现高通量筛选，节省人力物力和时间；可方便用于新药筛选、农药筛选、环境评价及水质评价等方面。
具体实施方式：
实施例一、不同温度下染色结果
染色剂：5%红四氮唑（TTC），用磷酸盐缓冲液(pH7.0)配制。
供试线虫：秀丽隐杆线虫同步化成虫1500条。
染色时间：30min。
根据Brenner(Brenner.Genetics,1974，77:71-94）所述的方法培养秀丽隐杆线虫。将培养4～5天处于混合时期的线虫用M9缓冲液(Brenner，Genetics,1974，77:71-94）冲洗至eppendorf管，4000rpm离心4min沉降线虫，加入1ml碱性裂解液（0.4～0.5M NaOH,2～4%漂白粉），充分裂解后，4000rpm离心4min；弃上清后，M9缓冲液洗涤2次，重悬于1mlM9缓冲液，置18℃孵育8h后，虫卵基本都孵化成L1期线虫；弃去上清液，将线虫均匀地铺在培养基表面，置18℃培养，2.5d后，线虫基本发育到成虫期。同步化成虫用M9缓冲液冲洗至eppendorf管中，离心弃上清后，M9缓冲液再冲洗两遍。加500微升的染色液，在4～35℃条件下染色。染色完毕，加入100微升二甲基亚砜（DMSO）或甲醇，溶出着色线虫体内的红色物质，1～3分钟后，即可用酶标仪于485nm或490nm处测溶液的吸光值。用酶标仪在485nm处测吸光值，结果见表1。
表1.不同染色温度下测得的吸光值
| 温度（℃） | 吸光值 |
| 4 | 0.121 |
| 28 | 0.296 |
| 30 | 0.346 |
| 33 | 0.375 |
| 35 | 0.176 |
此外，线虫染色完毕后，还可以在洗涤之后加入100微升40～50%的甘油，甘油作为透明剂可以使线虫身体呈透明，用酶标仪于485nm或490nm处测定吸光值。
实施例二、不同染色时间染色结果
染色剂：5%红四氮唑（TTC），用磷酸盐缓冲液（pH7.0)配制。
供试线虫：秀丽隐杆线虫同步化成虫300条。
染色温度： 32℃。
同步化成虫用M9缓冲液冲洗至eppendorf管中，离心弃上清后，M9缓冲液再冲洗两遍。加500微升的染色液，染色时间为5～45分钟。不同的时间，线虫可不同程度着色。染色完毕用酶标仪于485nm处测吸光值，结果见表2。
表2.不同染色时间染色测得的吸光值
| 染色时间（min） | 吸光值 |
| 5 | 0.159 |
| 15 | 0.207 |
| 25 | 0.178 |
| 35 | 0.164 |
| 45 | 0.166 |
实施例三、不同浓度染色剂染色结果
染色剂：不同浓度红四氮唑（TTC），用磷酸盐缓冲液(pH7.0)配制。
供试线虫：秀丽隐杆线虫同步化成虫1000条。
染色温度：32℃。
染色时间：30min。
同步化成虫用M9缓冲液冲洗至eppendorf管中，离心弃上清后，M9缓冲液再冲洗两遍。加500微升的染色液，染色液浓度为0.1～20%，线虫可不同程度着色。染色完毕用酶标仪于485nm处测吸光值，结果见表3。
表3.不同染料浓度染色测得的吸光值
| TTC浓度（%） | 吸光值 |
| 0.1 | 0.063 |
| 1 | 0.093 |
| 4 | 0.165 |
| 8 | 0.121 |
| 20 | 0.164 |
实施例四、不同数量线虫染色实验
染色剂：2%红四氮唑（TTC），用磷酸盐缓冲液(pH7.0)配制。
供试线虫：秀丽隐杆线虫同步化成虫。
染色温度：32℃。
染色时间：30min。
同步化成虫用M9缓冲液冲洗至eppendorf管中，离心弃上清后，M9缓冲液再冲洗两遍。用常规方法配制成分布均匀的线虫液，线虫量为15～1500条，加500微升染色液。线虫液着色程度随线虫数量的增加而增强。
实施例五、不同生长时期线虫染色实验
染色剂：2%红四氮唑（TTC），用磷酸盐缓冲液(pH7.0)配制。
供试线虫：不同生长时期秀丽隐杆线虫。
染色温度：32℃。
染色时间：30min。
处于不同生长时期的线虫用M9缓冲液冲洗至eppendorf管中，离心弃上清后，M9缓冲液再冲洗两遍。加500微升的染色液，染色完毕后，在倒置镜下观察，线虫均可着色。
实施例六、镜检与TTC染色方法所得线虫存活量结果的比较
供试线虫：秀丽隐杆线虫同步化线虫
标准曲线的建立：
线虫的浓度是68条/10微升，作为供试定量线虫，把此溶液均分成两部分，一部分用热处理法处死线虫，另一部分为未处理的线虫液。分别加水至总体积为1毫升。按标准曲线所取点分配线虫，在4000转/分钟离心4分钟，弃上清，M9液洗涤两次，继续离心，用5%的红四氮唑在32℃染色30min，M9缓冲液洗去残留的染料，加100微升二甲基亚砜（DMSO），用酶标仪在490nm处测定光吸收值，得到标准曲线表4。
表4.标准曲线
| 孔1 | 孔2 | 孔3 | 孔4 | 孔5 | 孔6 | |
| 活线虫（条） | 0 | 200 | 400 | 600 | 800 | 1000 |
| 死线虫（条） | 1000 | 800 | 600 | 400 | 200 | 0 |
| 吸光值 | 0.044 | 0.056 | 0.058 | 0.093 | 0.119 | 0.164 |
以活线虫的数量为横坐标，以490nm处的吸收值为纵坐标，所得的回归方程为Y=1.18×10－4X+0.03，R2=0.9137。
分别取不同量的上述活线虫液在与建立标准曲线相同的条件下染色，共取三个点作为供试点。三个点所用线虫量及染色后测定的吸光值见表5：
表5.镜检与TTC染色方法所测得的活线虫量比较
| 镜检活线虫量（条） | 染色后测得吸光值 | 计算所得活线虫量（条） |
| 500 | 0.099 | 585 |
| 700 | 0.117 | 738 |
| 900 | 0.139 | 925 |
实施例七、驱虫药阿苯达唑的急性毒性检测
阿苯达唑片 生产厂家：上海全宇生物科技内乡制药有限公司；规格：0.1g/片
染色剂：5%红四氮唑，用磷酸盐缓冲液配制。
供试线虫：成虫浓度为3000条/毫升的混合时期秀丽隐杆线虫液。
药品的配制：阿苯达唑片研磨后用1%DMSO溶解，然后稀释成不同的浓度备用。实验在96孔板上进行，每孔加线虫液100微升，加供试液100微升，25℃放置14小时后，弃上清，水洗涤两遍，用5%TTC在32℃染色40min。用同样的线虫液同时做标准曲线（见表6）。染色完毕，加100微升DMSO，用酶标仪在485nm处检测吸光值。结果见表7。
表6.阿苯达唑片急性毒性检测标准曲线
| 孔1 | 孔2 | 孔3 | 孔4 | 孔5 | 孔6 | |
| 活线虫（条） | 0 | 200 | 400 | 600 | 800 | 1000 |
| 死线虫（条） | 1000 | 800 | 600 | 400 | 200 | 0 |
| 吸光值 | 0.256 | 0.425 | 0.304 | 0.525 | 0.7 | 0.754 |
以活线虫的数量为横坐标，以485nm处的吸收值为纵坐标，所得的回归方程为Y=0.0006X+0.1968,R2=0.9003。
表7.阿苯达唑片急性毒性检测
| 药物浓度（μM） | 3.125 | 6.25 | 12.5 | 25 | 50 | 100 |
| OD值 | 0.312 | 0.274 | 0.218 | 0.253 | 0.216 | 0.14 |
回归方程为Y=-0.0014X+0.2824,R2=0.8056用以推算药物的半数致死量，对药物的优化和筛选提供理论依据。令Y=0.287，得X=3.571μM,即该药对秀丽隐杆线虫14小时的半数致死浓度为3.571μM。
实施例八、环境毒性检测
秀丽隐杆线虫也可以作为水生毒理学、水体污染方面的研究，但是用其作为指示生物监测水体污染的研究较少。目前重金属污染方面的研究常用水生生物来检测。本方法用Cu2+对秀丽隐杆线虫的急性毒性试验（表8），以了解Cu2+对其存活率的影响。通过本试验，为重金属对秀丽隐杆线虫的毒理学研究提供以线虫作为重金属污染的高通量测试方法的实践依据。
供试线虫为同步化成虫，浓度为3000条/毫升。
Cu2+溶液是由CuSO4·5H2O配制，稀释成不同浓度备用。实验在96孔板上进行，每孔加线虫液100微升，加供试液100微升，18℃放置4小时后，弃上清，水洗涤两遍，用5%TTC在32℃染色30min。用同样的线虫液同时做标准曲线（见表8）。染色完毕，加100微升DMSO，用酶标仪在485nm处检测吸光值。结果见表9。
表8. Cu2+急性毒性检测标准曲线
| 孔1 | 孔2 | 孔3 | 孔4 | 孔5 | 孔6 | |
| 活线虫（条） | 0 | 200 | 400 | 600 | 800 | 1000 |
| 死线虫（条） | 1000 | 800 | 600 | 400 | 200 | 0 |
| 吸光值 | 0.077 | 0.146 | 0.08 | 0.145 | 0.228 | 0.276 |
以活线虫的数量为横坐标，以485nm处的吸收值为纵坐标，所得的回归方程为Y=0.0002X+0.0828,R2=0.8761。
表9. Cu2+急性毒性检测
| Cu2+浓度（mg/L） | 17.05 | 21.31 | 26.63 | 41.62 | 52.02 |
| OD值 | 0.12 | 0.105 | 0.082 | 0.079 | 0.06 |
回归方程为Y=-0.0015X+0.1368,R2=0.8548。令Y=0.113，得X=15.87 mg/L，即Cu2+对秀丽隐杆线虫4小时的半数致死浓度为15.87 mg/L。
Claims (16)
1.一种快速定量线虫存活率的方法，采用染料对线虫进行染色，由于活线虫着色，死线虫不着色，且光吸收值与活线虫的数量成正比，从而直接可反映线虫的存活率，其特征在于该方法应用的染料是红四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC），分子式为C19H15ClN4。
2.根据权利要求1所述的一种快速定量线虫存活率的方法，其特征在于该方法中的线虫是自由生活的种类，或者是寄生生活的种类，优选秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）。
3.根据权利要求1至2中任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的方法，其特征在于该方法中的线虫是处于任一发育阶段的线虫，自由生活的线虫是选自一期幼体线虫至成虫的任一发育阶段线虫，寄生生活的是自由生活时期的幼体线虫。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的方法，其特征在于染色温度为4℃～35℃、染料浓度为0.1%～20%、染色时间为5min～45min。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的方法，其特征在于应用的线虫数量为15～1500条。
6.根据权利要求1至5任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的方法，其特征在于该方法采用二甲基亚砜（DMSO）或甲醇将在线虫体内显色的染料溶出。
7.根据权利要求1至5任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的方法，其特征在于染色后还可以采用甘油作为透明剂，然后采用酶标仪直接测定吸光值。
8.根据权利要求1至7任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的方法，其特征在于该方法在新药筛选、农药筛选、环境评价及水质评价领域应用。
9.一种快速定量线虫存活率的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有染料红四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC），分子式为C19H15ClN4。
10.一种快速定量线虫存活率的试剂盒，其特征在于该试剂盒可以含有线虫，其中的线虫是自由生活的种类，或者是寄生生活的种类，优选秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）。
11.根据权利要求9至10中任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的试剂盒，其特征在于该试剂盒中的线虫是处于任一发育阶段的线虫，自由生活的线虫是选自一期幼体线虫至成虫的任一发育阶段线虫，寄生生活的是自由生活时期的幼体线虫。
12.根据权利要求9至11中任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的试剂盒，其特征在于染色温度为4℃～35℃、染料浓度为0.1%～20%、染色时间为5min～45min。
13.根据权利要求9至12中任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的试剂盒，其特征在于应用的线虫数量为15～1500条。
14.根据权利要求9至13任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有二甲基亚砜（DMSO）或甲醇。
15.根据权利要求9至14任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有甘油。
16.根据权利要求9至15任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的试剂盒，其特征在于该试剂盒在新药筛选、农药筛选、环境评价及水质评价领域应用。
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2010
- 2010-04-03 CN CN201010138624.1A patent/CN102213672B/zh active Active
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|---|---|
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