CN113804524A - 一种基于中国青鳉的化学品毒性高内涵快速筛查方法 - Google Patents
一种基于中国青鳉的化学品毒性高内涵快速筛查方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于中国青鳉的化学品毒性高内涵快速筛查方法，涉及环境化合物的检测技术领域，本方法利用中国青鳉胚胎、细胞、幼鱼或雄鱼精子，建立化学物质毒性评价模型，通过进行暴露实验，利用高内涵成像分析系统进行成像扫描，检测受试物的胚胎、器官、幼体和精子毒性。本发明方法取材方便、准确性好、灵敏度高、测试通量高，能够快速识别不同作用模式的环境内分泌干扰物，系统表征其毒性信息，在环境水体毒性识别与生态风险评价中有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及环境化合物的检测技术领域，特别是涉及一种基于中国青鳉的化学品毒性高内涵快速筛查方法。
背景技术
随着现代工业的进步，人类合成、使用和间接产生的化合物的种类和数量在不断增长，其中包括了化工原料、食品添加剂、阻燃剂、农药、药物、天然化合物及其衍生物等多个类别。然而由于对其毒性作用认识不足，绝大多数的化合物缺乏有效地监管，因此部分化合物能够以直接或间接的方式进入环境，成为环境污染物。这其中，许多环境污染物也是内分泌干扰物(Endocrine Disrupting Chemicals，EDCs)，它们的分子结构与人体内激素的分子结构非常相似，能与机体内的雌激素受体(ER)、雄激素受体(AR)、甲状腺激素受体(TR)、维生素A酸受体(RAR)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)、雌激素相关受体(ERR)、维生素D受体(VDR)等结合，表现出拟天然激素或抗天然激素的作用，损害人和动物的内分泌功能。
水环境是大部分污染物的最终聚集场所，作为水生生态系统中重要的组成部分，污染物可通过食物链在鱼类体内富集，影响其繁殖发育。因此，鱼类常用于环境内分泌干扰研究，监测环境污染。目前常用的试验鱼类模型有黑头呆鱼(Rathead Minnow，Pimephalespromelas)、斑马鱼(Zebrafish，Danio rerio)、日本青鳉(Japanese Medaka，Oryziaslatipes)和虹鳟(Rainbow Trout，Oncorhynchus mykiss)。与这些鱼类模式物种相比，中国青鳉(Chinese Medaka，Oryzias sinensis)体型小，繁殖能力强，是我国广泛分布的本土物种，可以直接从环境水体中获得，利用其进行环境污染物评价不存在外来物种入侵风险。
环境中所暴露的化合物会对生物体内特定器官产生各异的毒性作用，对化合物展开特定器官的毒性评价能够揭示其所具有的毒性作用机制。大型模式动物的活体毒性测试由于通量低、成本高以及周期长等缺点已不能满足当前巨量化合物毒性评价的需要。利用高内涵筛选(High Content Screening，HCS)能够在保持细胞结构和功能完整性前提下，通过高分辨率成像系统以高内涵的方式呈现化合物暴露下所产生的多维表型信息，从而对不同器官来源的细胞系和原代细胞进行高通量、多参数、高灵敏的毒性评价。因此，高内涵筛选可用于如肝毒性、遗传毒性、神经毒性、肾毒性、类激素活性等多种毒性的评价，系统地对化合物的毒性作用机制展开研究，从而更好地对化学污染物进行风险评估。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种基于中国青鳉的化学品毒性高内涵快速筛查方法，从而实现环境化合物毒性效应的快速、高灵敏、高通量、系统表征。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案如下：
一种基于中国青鳉的化学品毒性高内涵快速筛查方法，包括采用中国青鳉胚胎、细胞、幼鱼或精子检测化学品毒性的方法，其中：
采用中国青鳉胚胎检测化学品毒性的方法，包括以下步骤：
1-1)将规范化养殖的中国青鳉雌雄成鱼按照1:2的个数比例放入交配盒中，并将雌雄成鱼隔开；过夜后取消隔档，并光照刺激中国青鳉交配产卵，收集鱼卵并用水清洗后镜检，随机选取发育正常的胚胎放入纯净水中培养一预定的时间；
1-2)将化学品用DMSO(二甲基亚砜)溶解，再用纯净水稀释至各实验梯度；在孔板的每孔内放置1个胚胎，加入系列实验梯度的化学品和DMSO对照品，进行暴露实验，实验过程中每隔半天更换一半的处理液；每个化学品至少设置3个剂量组，每个剂量组设置至少10个复孔，同时设置阴性对照组和阳性对照组；
1-3)在暴露实验过程中，通过高内涵成像分析系统进行成像扫描，分析各个图像中的各项指标，通过胚胎的形态学打分、心率、行动和孵化率指标判断化学品对胚胎发育的影响，通过胚胎的畸形率和致死率指标判断化学品对胚胎的影响，通过观察胚胎的体节、卵黄囊、心脏、血管、神经、眼点组织器官的发育畸形情况判断化学品的致畸性，通过检测胚胎及孵化子代性腺发育判断化学品的雌激素或雄激素活性；
采用中国青鳉细胞检测化学品毒性的方法，包括以下步骤：
2-1)提取至少3只中国青鳉幼鱼的组织，多次洗涤后，制成组织块，加入胰蛋白酶-EDTA，至组织松散；吸出多余的胰蛋白酶-EDTA，加入完全培养基终止消化，收集细胞悬液，过筛，离心；弃掉上清液，加入完全培养基重悬细胞，调整细胞密度，培养过夜；
2-2)将化学品用DMSO溶解制备高浓度母液，再用完全培养基稀释至各实验梯度；除去原培养基，加入系列浓度的化学品和DMSO对照品并继续培养一天，每个化学品至少设置3个剂量组，每个剂量组设置2个复孔，同时设置阴性对照组和阳性对照组；
2-3)对细胞加入化学品进行荧光染色，避光孵育；用无菌PBS缓冲液洗涤，并再加入无菌PBS缓冲液，利用高内涵成像分析系统进行活细胞成像扫描，分析各个图像中的荧光强度，根据荧光强度定量检测指标，该检测指标包括细胞数目、DNA含量、谷胱甘肽降低水平、活性氧簇含量和线粒体膜电位；根据该检测指标绘制量效关系曲线，并确定毒性阈值，判断化学品的毒性；
采用中国青鳉幼鱼检测化学品毒性的方法，包括以下步骤：
3-1)随机选取同一批次发育正常的胚胎，放入纯净水中培养使其孵化，待幼鱼孵出后继续进行驯养，驯养一段时间后随机选取形态大小接近、健康的中国青鳉幼鱼；
3-2)将化学品用DMSO溶解制备高浓度母液，再用纯净水稀释至各实验梯度；在孔板的每个孔内放置1条幼鱼，加入系列实验梯度的化学品和DMSO对照品，进行暴露实验；实验过程中每隔一天更换一半的处理液，每天定量喂食2次，试验过程中不曝气；每个化学品至少设置3个剂量组，每个剂量组设置至少8个复孔，同时设置阴性对照组和阳性对照组；
3-3)在暴露实验过程中，通过高内涵成像分析系统进行成像扫描，分析各个图像中幼鱼的评价指标，通过幼鱼的形态学打分和行动指标考察化学品对幼鱼发育的影响，通过胚胎幼鱼的畸形率和致死率指标考察化学品对幼鱼的影响，判断化学品的毒性；
采用中国青鳉精子检测化学品毒性的方法，包括以下步骤：
4-1)提取多条性成熟中国青鳉雄鱼的精子，制备成精子悬浮液，分装，并在2h内进行精子暴露实验；
4-2)将化学品用DMSO溶解制备高浓度母液，再用含盐养殖水稀释至各实验梯度；用孔板加入系列实验梯度的化学品/对照品，混合均匀后进行暴露实验；每个化学品至少设置3个剂量组，每个剂量组设置2个复孔，同时设置阴性对照组和阳性对照组；
4-3)暴露实验过程中，通过高内涵成像分析系统进行成像扫描，分析各个图像中精子的形态及运动状况；检测运动精子的数量占视野中所有精子总数的比例，统计精子的运动率、平均直线速度、平均曲线速度、平均圆周速度指标，确定毒性阈值，判断化学品毒性。
进一步地，步骤1-1)中，规范化养殖中国青鳉的方法为：中国青鳉在独立养殖系统中进行养殖，养殖用水采用充分曝气处理的循环水，水温25±1℃，水硬度8.0mg/L，pH控制在8.0左右，溶解氧8.0-9.0mg/L，光照周期昼夜比为14h:10h；驯养过程中饵料为新孵化的丰年虾幼虫，每日喂食2次。
进一步地，步骤1-1)胚胎放入纯净水中培养的时间为4-11h。
进一步地，步骤1-2)中，孔板选用96孔板，在25℃、光照周期昼夜比为14h:10h的条件下进行暴露实验。
进一步地，步骤2-1)中，中国青鳉幼鱼首先置于冰上麻醉，用1％的次氯酸钠浸泡1min，75％酒精体表消毒10s，再提取组织，该组织包括肝胰脏、肾脏、鳃、肌肉、性腺、尾鳍和皮肤；加入与组织块等体积分数的0.25％胰蛋白酶-EDTA，混匀置于细胞培养箱中25℃消化2-3min至组织松散；细胞密度为1×106个/L。
进一步地，步骤2-1)和2-2)中，完全培养基组分为80％DMEM、15％FBS、5％H2O和0.1％青链霉素；培养条件为在20-28℃、5％CO2培养箱中。
进一步地，步骤2-3)中，避光孵育时间为20-40min。
进一步地，步骤3-1)中，孵化后驯养1-14d。
进一步地，步骤3-2)中，选用24孔板，在25℃、光照周期昼夜比为14h:10h的条件下进行暴露实验。
进一步地，步骤4-1)中，随机取多条性成熟中国青鳉雄鱼置于冰上麻醉，用1％的次氯酸钠浸泡1min，75％酒精体表消毒10s，再提取精子。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
鱼类是反映环境变化的敏感指示生物，利用其进行环境评价具有普适性。与斑马鱼、日本青鳉相比，中国青鳉是我国的本土物种，利用其评价环境内分泌干扰物不存在外来物种入侵问题。此外，中国青鳉具有体型小、繁殖能力强，产卵周期短，生长周期短，体外发育，胚胎透明等特点，为科学研究和野外环境监测提供了极其便利的条件。
传统的体内毒性测试存在测试通量低、耗时长、成本高以及动物伦理等问题，己经不能满足化学物质毒性测试的需求。体外毒理学分析在体外建模的基础上还需要一系列可量化的综合评估标准，常规的细胞毒性实验虽然能够一定程度的用于研究，但是由于相关方法大都在一次试验中仅检测单个指标，无法全面系统地表征环境样品对生物有机体的毒性。高内涵分析在保留了高通量能力的基础上，不再是在分子水平针对某种单一靶标进行的筛选，而是在细胞水平针对生物体内多系统、多途径、多种靶标进行的动态筛选，不仅能了解样品相关的细胞生物学的变化，阐明样品与药靶相互作用的关系，还能通过观察细胞形态预测化合物的毒性，实现化合物多种生物活性和毒性的早期、快速、高通量检测，弥补了现有发现毒理学筛选方法在通量、毒性机制检测、潜在毒性揭示全方面的不足。因此，与现有方法相比，本发明所提供的基于中国青鳉的化学品毒性高内涵快速筛查方法取材方便、准确性好、灵敏度高、测试通量高，能够识别不同作用模式的环境内分泌干扰物，获得全面的毒性信息，在环境水体毒性识别与生态风险评价中有较好的应用前景。
附图说明
图1为高浓度双酚芴暴露后中国青鳉胚胎发育畸形图。
图中：A类图所示为眼睛发育畸形；B类图所示为单眼幼虫卵黄囊吸收迟缓；C类图所示为身体和尾巴卷曲的孵化1hpf的畸形幼鱼。
具体实施方式
为使本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，并配合所附图作详细说明如下。
本实施例提供一种基于中国青鳉的化学品毒性高内涵快速筛查方法，包括以下内容：
(1)应用中国青鳉胚胎评价化学品的胚胎毒性
(a)中国青鳉胚胎毒性评价模型的建立
中国青鳉于独立养殖系统中进行规范化养殖，其养殖用水采用充分曝气处理的循环水，水温25±1℃，水硬度8.0mg/L，pH控制在8.0左右，溶解氧8.0-9.0mg/L，光照周期昼夜比为14h:10h。胚胎放入纯净水中培养的时间为4-11h，优选为7h。驯养过程中饵料为新孵化的丰年虾幼虫，每日喂食2次。实验前一晚将雌雄中国青鳉成鱼按1:2比例放入专用的交配盒中，并用隔板将雌雄鱼分开。次日打开隔板，开灯给予光照刺激使其交配产卵。收集鱼卵，用水清洗并镜检，随机选取发育正常的胚胎放入纯净水中培养一定时间用于后续暴露实验。
(b)受试物(即化学品)暴露实验
将受试物用DMSO溶解制备高浓度母液，然后用纯净水依次稀释至各实验梯度。暴露实验选用96孔板，每孔放置1个胚胎，随后加入系列浓度的受试物/对照品，于25℃、光照周期昼夜比为14h:10h的条件下进行暴露实验。实验过程中每12h更换一半的处理液。每个受试物至少设置3个剂量组，每个剂量组设置至少10个复孔，同时设置阴性对照组和阳性对照组。
(c)高内涵筛选技术检测受试物的胚胎毒性
实验过程中通过高内涵成像分析系统进行成像扫描，分析各个图像中胚胎及幼鱼的发育情况。通过胚胎的形态学打分、心率、行动以及孵化率等指标考察受试物对胚胎发育的影响，通过胚胎的畸形率以及致死率等指标考察受试物对胚胎的影响。通过观察胚胎的体节、卵黄囊、心脏、血管、神经、眼点等组织器官的发育畸形情况判定物质的致畸性。通过检测胚胎及孵化子代性腺发育判定物质的雌激素或雄激素活性。
(2)应用中国青鳉细胞评价化学品的器官毒性
(a)中国青鳉原代细胞毒性评价模型的建立
取至少3只中国青鳉幼鱼置于冰上麻醉，用1％的次氯酸钠浸泡1min，75％酒精体表消毒10s，用眼科剪迅速取出中国青鳉的组织，中国青鳉组织包括肝胰脏、肾脏、鳃、肌肉、性腺、尾鳍和皮肤，优选为肝胰脏。放入含预冷无菌生理盐水的培养皿中，多次洗涤后转移至新的细胞培养皿中。将分离的组织用眼科剪剪成约1mm3的组织块，加入与组织块等体积分数的0.25％胰蛋白酶-EDTA，混匀置于细胞培养箱中25℃消化2-3min至组织松散。吸出多余胰蛋白酶-EDTA，加入完全培养基(80％DMEM，15％FBS，5％H2O，0.1％青链霉素)终止消化。收集细胞悬液，用150目筛网过滤，1000r/min离心5min。弃上清，加入完全培养基重悬细胞，台酚蓝计数，调整细胞密度为1×106个/L，将细胞接种至黑色透底细胞培养板中，置于25℃、5％CO2培养箱中培养过夜，细胞培养温度为20-28℃，优选为25℃。
(b)受试物暴露实验
将受试物用DMSO溶解制备高浓度母液，然后用完全培养基依次稀释至各实验梯度。除去原培养基，加入系列浓度的受试物/对照品于25℃、5％CO2培养箱中培养24h，细胞培养温度为20-28℃，优选为25℃。每个受试物至少设置3个剂量组，每个剂量组设置2个复孔，同时设置阴性对照组和阳性对照组。
(c)高内涵筛选技术检测受试物的器官毒性
给药处理24h后进行荧光染色，置于25℃、5％CO2培养箱中避光孵育，孵育时间为20-40min，优选为30min。再用无菌PBS缓冲液小心洗涤1次，加入100μL无菌PBS缓冲液上机检测。利用高内涵成像分析系统进行活细胞成像扫描，根据图像荧光强度定量描述检测指标。检测指标包括细胞数目、DNA含量、谷胱甘肽降低水平、活性氧簇含量和线粒体膜电位。以化学品浓度的log值为横坐标，分别以细胞数目、DNA含量、谷胱甘肽降低水平、活性氧簇含量和线粒体膜电位为纵坐标，通过非线性拟合，绘制量效关系曲线，进而确定毒性阈值，预测受试物的器官毒性风险。
(3)应用中国青鳉幼鱼评价化学品的幼体毒性
(a)中国青鳉幼鱼毒性评价模型的建立
随机选取同一批次发育正常的胚胎放入纯净水中培养使其孵化，待幼鱼孵出后投喂微量磨碎的熟蛋黄进行驯养。驯养1-14d(优选7d)后随机选取形态大小接近、健康活泼的中国青鳉幼鱼作为毒性试验用鱼。
(b)受试物暴露实验
将受试物用DMSO溶解制备高浓度母液，然后用纯净水依次稀释至各实验梯度。暴露实验选用24孔板，每孔放置1条幼鱼，加入系列浓度的受试物/对照品，于25℃、光照周期昼夜比为14h:10h的条件下进行暴露实验。实验过程中每24h更换一半的处理液，暴露期间每天定量喂食2次，试验过程中不曝气。每个受试物至少设置3个剂量组，每个剂量组设置至少8个复孔，同时设置阴性对照组和阳性对照组。
(c)高内涵筛选技术检测受试物的幼体毒性
实验过程中通过高内涵成像分析系统进行成像扫描，根据评价指标分析各个图像中幼鱼的发育情况。评价指标包括毒理学终点(致畸、致死等)、器官毒性(血管、心脏、肝脏等)、遗传毒性(染色体，DNA损伤等)和神经毒性(运动能力等)。通过幼鱼的形态学打分以及行动等指标考察受试物对幼鱼发育的影响，通过胚胎幼鱼的畸形率以及致死率等指标考察受试物对幼鱼的影响。
(4)应用中国青鳉雄鱼精子评价化学品的精子毒性
(a)中国青鳉精子毒性评价模型的建立
随机取10条性成熟中国青鳉雄鱼置于冰上麻醉，用1％的次氯酸钠浸泡1min，75％酒精体表消毒10s，用眼科剪解剖取出精巢，剪碎加入到预冷的含盐养殖水中，含盐养殖水中盐含量为0.4-0.7％，优选为0.6％。用枪头充分搅拌精巢使其充分释放出精子后将杂质挑出，制备成精子悬浮液，并立即分装于2h内进行精子暴露实验。
(b)受试物暴露实验
将受试物用DMSO溶解制备高浓度母液，然后用含盐养殖水依次稀释至各实验梯度。于96孔板加入系列浓度的受试物/对照品，充分混合均匀进行精子暴露实验。每个受试物至少设置3个剂量组，每个剂量组设置2个复孔，同时设置阴性对照组和阳性对照组。
(c)高内涵筛选技术检测受试物的精子毒性
实验过程中通过高内涵成像分析系统进行成像扫描，分析各个图像中精子的形态及运动状况。检测运动精子的数量占视野中所有精子总数的比例，统计精子的运动率、平均直线速度、平均曲线速度、平均圆周速度等指标，预测受试物对精子活力的影响。
以下列举一具体应用实例：
一、应用中国青鳉胚胎评价双酚芴的胚胎毒性
(1)中国青鳉胚胎毒性评价模型的建立
中国青鳉于独立养殖系统中进行规范化养殖，其养殖用水采用充分曝气处理的循环水，水温25±1℃，水硬度8.0mg/L，pH控制在8.0左右，溶解氧8.0-9.0mg/L，光照周期昼夜比为14h:10h。驯养过程中饵料为新孵化的丰年虾幼虫，每日喂食2次。实验前一晚将雌雄中国青鳉成鱼按1:2比例放入专用的交配盒中，并用隔板将雌雄鱼分开。次日打开隔板，开灯给予光照刺激使其交配产卵。收集鱼卵，用水清洗并镜检，随机选取发育正常的胚胎放入纯净水中培养一定时间用于后续暴露实验。
(2)受试物暴露实验
将双酚芴用DMSO溶解制备高浓度母液，然后用纯净水依次稀释至各实验梯度。暴露实验选用96孔板，每孔放置1个胚胎，加入系列浓度的双酚芴/对照品，于25℃、光照周期昼夜比为14h:10h的条件下进行14d暴露实验。实验过程中每12h更换一半的处理液。双酚芴设置高(15mg/mL)、中(10mg/mL)和低(5mg/mL)3个剂量组，每个剂量组设置20个复孔，阳性对照组为15mg/mL双酚A。
(3)高内涵筛选技术检测受试物的胚胎毒性
实验期间每4h通过高内涵成像分析系统进行胚胎成像扫描，待幼鱼孵出时，用麻醉剂MS-222将幼鱼麻醉，将幼鱼移入96孔板中进行中国青鳉幼鱼成像分析。分析各个图像中胚胎及幼鱼的发育情况。通过胚胎的形态学打分以及孵化率等指标考察受试物对胚胎发育的影响，通过胚胎的畸形率以及致死率等指标考察受试物对胚胎的影响。通过观察胚胎的体节、卵黄囊、心脏、血管、神经、眼点等组织器官的发育畸形情况判定双酚芴的致畸性。利用包含各项毒理学指标的毒性数据进行后续数据分析，剂量效应曲线利用GraphPadPrism四参数模型进行拟合，得到对应的半数致死剂量LC50，利用SPSS数据统计软件对数据进行正态性检验和多组间单因素方差分析。结果表明胚胎孵化时间随双酚芴浓度的增加而延长，双酚芴发挥着抗雌激素效应。低浓度双酚芴处理中国青鳉胚胎后，胚胎并未出现明显的畸形现象。而在高浓度双酚芴处理组中，暴露后胚胎出现显著的发育延迟(未孵化)。如图1所示，孵化后出现了眼点发育不良、卵黄囊肿、心包囊肿、体轴弯曲等畸形现象。随着双酚芴浓度的升高和处理时间的变长，其对中国青鳉胚胎的毒性也显著升高，造成中国青鳉胚胎畸形程度、畸形率和死亡数量都显著增加。中国青鳉胚胎可以明显地体现出染毒前后胚胎发育的差异，对双酚芴胚胎毒性评价的结果具有清晰的指示性。
二、应用中国青鳉肝细胞评价多种化学品的肝脏毒性
(1)中国青鳉原代肝细胞毒性评价模型的建立
取3只中国青鳉雄鱼幼鱼置于冰上麻醉，用1％的次氯酸钠浸泡1min，75％酒精体表消毒10s，用眼科剪迅速取出中国青鳉的肝胰脏组织，放入含预冷无菌生理盐水的培养皿中，多次洗涤后转移至新的细胞培养皿中。将分离的组织用眼科剪剪成约1mm3的组织块，加入与组织块等体积分数的0.25％胰蛋白酶-EDTA，混匀置于细胞培养箱中25℃消化2-3min至组织松散。吸出多余胰蛋白酶-EDTA，加入完全培养基(80％DMEM，15％FBS，5％H2O，0.1％青链霉素)终止消化。收集细胞悬液，用150目筛网过滤，1000r/min离心5min。弃上清，加入完全培养基重悬细胞，台酚蓝计数，调整细胞密度为1×106个/L，将细胞接种至黑色透底96孔细胞培养板中，置于25℃、5％CO2培养箱中培养过夜。
(2)受试物暴露实验
将受试物用DMSO溶解制备高浓度母液，然后用完全培养基依次稀释至各实验梯度。除去原培养基，加入系列浓度的受试物/对照品于25℃、5％CO2培养箱中培养24h。每个受试物设置5个剂量组，每个剂量组设置2个复孔，同时设置阴性对照组(含DMSO的完全培养基和阿司匹林)和阳性对照组(噻氯吡啶)。
(3)高内涵筛选技术检测受试物的肝脏毒性
给药处理24h后，按各荧光染料说明书配制Hoechst33342、mBC1 dye、ROS dye、Mito dye染色液。加入配制好的染液，置于25℃、5％CO2培养箱中避光孵育30min。再用无菌PBS缓冲液小心洗涤1次，加入100μL无菌PBS缓冲液上机检测。采用美国美谷分子MolecularDevices公司的ImageXpress高内涵成像分析系统选择Hoechst33342、mBC1 dye、ROS dye和Mito dye通道，进行活细胞成像扫描。利用美国美谷分子Molecular Devices公司的MetaXpress软件对高内涵图像进行数据量化，分析各个图像中的荧光强度，计算细胞数目、DNA含量、谷胱甘肽降低水平、ROS含量和线粒体膜电位5种指标，考察受试物对细胞生存率、细胞形态、谷胱甘肽降低水平、ROS含量及线粒体功能的影响。采用GraphPad Prism及SPSS数据统计软件对数据进行正态性检验和多组间单因素方差分析。
测试化学品包括氟康唑、己唑醇、三唑酮、百草枯、溴氰菊酯、氰氟草酯、异烟肼、吡嗪酰胺、磷酸三苯酯、磷酸三丁酯、全氟辛基磺酸、全氟辛酸、2,4-二叔丁基酚、氯化镉和芦荟大黄素。利用高内涵成像分析系统可以直观地发现其中氟康唑、己唑醇、三唑酮、百草枯、溴氰菊酯、氰氟草酯、异烟肼、吡嗪酰胺、磷酸三苯酯、磷酸三丁酯、全氟辛基磺酸、全氟辛酸、2,4-二叔丁基酚、氯化镉和芦荟大黄素在细胞数目、DNA含量、GSH降低水平、ROS含量和线粒体膜电位5个指标检测结果均为阳性，这些化合物均能抑制原代肝细胞增殖，影响细胞中DNA含量，降低GSH水平，诱导氧自由基过度产生及线粒体损伤，表明这些化合物对中国青鳉原代肝细胞具有明显的毒性。中国青鳉原代肝细胞可以明显地体现出细胞染毒前后形态及功能的变化，对肝脏效应评价的结果具有清晰的指示性。
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用以限定本发明，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的适当修改或者等同替换，均应涵盖于本发明的保护范围内，本发明的保护范围以权利要求所限定者为准。
Claims (10)
1.一种基于中国青鳉的化学品毒性高内涵快速筛查方法，其特征在于，包括采用中国青鳉胚胎、细胞、幼鱼或精子检测化学品毒性的方法，其中：
采用中国青鳉胚胎检测化学品毒性的方法，包括以下步骤：
1-1)将规范化养殖的中国青鳉雌雄成鱼按照1:2的个数比例放入交配盒中，并将雌雄成鱼隔开；过夜后取消隔档，并光照刺激中国青鳉交配产卵，收集鱼卵并用水清洗后镜检，随机选取发育正常的胚胎放入纯净水中培养一预定的时间；
1-2)将化学品用DMSO溶解，再用纯净水稀释至各实验梯度；在孔板的每孔内放置1个胚胎，加入系列实验梯度的化学品和DMSO对照品，进行暴露实验，实验过程中每隔半天更换一半的处理液；每个化学品至少设置3个剂量组，每个剂量组设置至少10个复孔，同时设置阴性对照组和阳性对照组；
1-3)在暴露实验过程中，通过高内涵成像分析系统进行成像扫描，分析各个图像中的各项指标，通过胚胎的形态学打分、心率、行动和孵化率指标判断化学品对胚胎发育的影响，通过胚胎的畸形率和致死率指标判断化学品对胚胎的影响，通过观察胚胎的体节、卵黄囊、心脏、血管、神经、眼点组织器官的发育畸形情况判断化学品的致畸性，通过检测胚胎及孵化子代性腺发育判断化学品的雌激素或雄激素活性；
采用中国青鳉细胞检测化学品毒性的方法，包括以下步骤：
2-1)提取至少3只中国青鳉幼鱼的组织，多次洗涤后，制成组织块，加入胰蛋白酶-EDTA，至组织松散；吸出多余的胰蛋白酶-EDTA，加入完全培养基终止消化，收集细胞悬液，过筛，离心；弃掉上清液，加入完全培养基重悬细胞，调整细胞密度，培养过夜；
2-2)将化学品用DMSO溶解制备高浓度母液，再用完全培养基稀释至各实验梯度；除去原培养基，加入系列浓度的化学品和DMSO对照品并继续培养一天，每个化学品至少设置3个剂量组，每个剂量组设置2个复孔，同时设置阴性对照组和阳性对照组；
2-3)对细胞加入化学品进行荧光染色，避光孵育；用无菌PBS缓冲液洗涤，并再加入无菌PBS缓冲液，利用高内涵成像分析系统进行活细胞成像扫描，分析各个图像中的荧光强度，根据荧光强度定量检测指标，该检测指标包括细胞数目、DNA含量、谷胱甘肽降低水平、活性氧簇含量和线粒体膜电位；根据该检测指标绘制量效关系曲线，并确定毒性阈值，判断化学品的毒性；
采用中国青鳉幼鱼检测化学品毒性的方法，包括以下步骤：
3-1)随机选取同一批次发育正常的胚胎，放入纯净水中培养使其孵化，待幼鱼孵出后继续进行驯养，驯养一段时间后随机选取形态大小接近、健康的中国青鳉幼鱼；
3-2)将化学品用DMSO溶解制备高浓度母液，再用纯净水稀释至各实验梯度；在孔板的每个孔内放置1条幼鱼，加入系列实验梯度的化学品和DMSO对照品，进行暴露实验；实验过程中每隔一天更换一半的处理液，每天定量喂食2次，试验过程中不曝气；每个化学品至少设置3个剂量组，每个剂量组设置至少8个复孔，同时设置阴性对照组和阳性对照组；
3-3)在暴露实验过程中，通过高内涵成像分析系统进行成像扫描，分析各个图像中幼鱼的评价指标，通过幼鱼的形态学打分和行动指标考察化学品对幼鱼发育的影响，通过胚胎幼鱼的畸形率和致死率指标考察化学品对幼鱼的影响，判断化学品的毒性；
采用中国青鳉精子检测化学品毒性的方法，包括以下步骤：
4-1)提取多条性成熟中国青鳉雄鱼的精子，制备成精子悬浮液，分装，并在2h内进行精子暴露实验；
4-2)将化学品用DMSO溶解制备高浓度母液，再用含盐养殖水稀释至各实验梯度；用孔板加入系列实验梯度的化学品/对照品，混合均匀后进行暴露实验；每个化学品至少设置3个剂量组，每个剂量组设置2个复孔，同时设置阴性对照组和阳性对照组；
4-3)暴露实验过程中，通过高内涵成像分析系统进行成像扫描，分析各个图像中精子的形态及运动状况；检测运动精子的数量占视野中所有精子总数的比例，统计精子的运动率、平均直线速度、平均曲线速度、平均圆周速度指标，确定毒性阈值，判断化学品毒性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1-1)中，规范化养殖中国青鳉的方法为：中国青鳉在独立养殖系统中进行养殖，养殖用水采用充分曝气处理的循环水，水温25±1℃，水硬度8.0mg/L，pH控制在8.0左右，溶解氧8.0-9.0mg/L，光照周期昼夜比为14h:10h；驯养过程中饵料为新孵化的丰年虾幼虫，每日喂食2次。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1-1)胚胎放入纯净水中培养的时间为4-11h。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1-2)中，孔板选用96孔板，在25℃、光照周期昼夜比为14h:10h的条件下进行暴露实验。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2-1)中，中国青鳉幼鱼首先置于冰上麻醉，用1％的次氯酸钠浸泡1min，75％酒精体表消毒10s，再提取组织，该组织包括肝胰脏、肾脏、鳃、肌肉、性腺、尾鳍和皮肤；加入与组织块等体积分数的0.25％胰蛋白酶-EDTA，混匀置于细胞培养箱中25℃消化2-3min至组织松散；细胞密度为1×106个/L。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2-1)和2-2)中，完全培养基组分为80％DMEM、15％FBS、5％H2O和0.1％青链霉素；培养条件为在20-28℃、5％CO2培养箱中。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2-3)中，避光孵育时间为20-40min。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3-1)中，孵化后驯养1-14d。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3-2)中，选用24孔板，在25℃、光照周期昼夜比为14h:10h的条件下进行暴露实验。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4-1)中，随机取多条性成熟中国青鳉雄鱼置于冰上麻醉，用1％的次氯酸钠浸泡1min，75％酒精体表消毒10s，再提取精子。
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