CN104388519A - 利用斑马鱼胚胎测试天然植物提取物急性毒性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用斑马鱼胚胎测试天然植物提取物急性毒性的方法，包括如下步骤：配制胚胎培养液，将植物提取物粉末以二甲基亚砜溶解至澄清，过滤2次，用胚胎培养液稀释，获得含植物提取物不同浓度的稀释液，不同浓度的稀释液中所含二甲基亚砜最终浓度一致且最终浓度小于等于1.2％(V/V)；用不同浓度的稀释液培养斑马鱼胚胎，然后在7-72hpf观察记录不同浓度的稀释液对斑马鱼胚胎发育的影响，来判断植物提取物对斑马鱼胚胎发育的毒性。本发明方法操作简便，实用性强，可初步判断植物提取物的急性毒性，速度快，精确度高。

Description

利用斑马鱼胚胎测试天然植物提取物急性毒性的方法

技术领域

本发明涉及毒性检测领域，具体涉及一种利用斑马鱼胚胎测试植物提取物急性毒性的方法。

背景技术

自20世纪70年代美国Oregon大学著名遗传学家George Streisinger详细报道了斑马鱼的体外受精技术、单倍体诱导等技术，并建立其纯合品系，使得斑马鱼初步具备了成为模式动物的条件，为其迅速发展奠定了坚实的基础。进入21世纪，同果蝇、小鼠、兔子等经典模式动物相比，斑马鱼凭借其明显优势：(1)个体小；(2)发育快速，性成熟期短，繁殖能力强；(3)卵和胚胎透明，体外受精，体外发育，易于观察和操作；(4)胚胎小，每次测定只需少量样品，(5)下药方式简单，水溶性化合物可溶于培养水中扩散至胚胎，脂溶性化合物可通过显微注射到胚胎中；(6)胚胎学和遗传学操作技术成熟，且品系资源十分丰富；(7)温度适合时，一年四季均可人为控制产卵，且后代数量大；(8)全基因组序列测定已完成，与人类基因的相似度达87％，意味着在斑马鱼上做的毒性试验所得的结果在多数情况下也适用于人体；(9)目前已获得大量的斑马鱼突变体，迄今已鉴定有8000多种斑马鱼突变体，其中1/4成为人类疾病模型，比如人类贫血、耳聋、肌无力症、恶性肿瘤和阿尔茨海默病等，以上优势使斑马鱼成为国际标准化组织认可的五种试验标准鱼类之一。在2011年举行的世界合同定制服务中国展(ICSE China)认为斑马鱼相对于传统的模式生物，在高内涵、全自动、高通量筛选方面所凸显出来的巨大优势特别适用于人工合成化合物、天然植物药、动物药和海洋药物等的筛选，包括天然产品在营养保健、护肤美容中的应用。目前，斑马鱼是可进行高通量药物毒性筛选和安全性评价的唯一脊椎动物模型。因此，作为新兴的实验动物资源，斑马鱼在生命科学研究和生物医药领域中的应用呈快速增长趋势。

本发明旨在建议一种利用斑马鱼胚胎测试植物提取物急性毒性的方法，以模式动物斑马鱼为实验动物，从繁养和利用斑马鱼胚胎对天然植物提取物进行急性毒性试验并对该其进行安全性评估，建立早期、灵敏及高通量筛选的急性毒性检测平台，为进一步研发提供基础数据和实验依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用斑马鱼胚胎测试天然植物提取物急性毒性的方法。

本发明采用的技术方案为：

一种利用斑马鱼胚胎测试天然植物提取物急性毒性的方法，包括如下步骤：

配制胚胎培养液，即胚胎的培养用水，其中胚胎培养液含有：NaCl 5mM，KCl0.17mM，C aCl₂0.33mM，MgSO₄0.33mM，以1M NaOH调节pH至6.8-7.0，电导率在500-550μs；

将植物提取物粉末以二甲基亚砜溶解至澄清，过滤2次，用胚胎培养液稀释，获得含植物提取物不同浓度的稀释液，不同浓度的稀释液中所含二甲基亚砜最终浓度一致且最终浓度小于等于1.2％(V/V)；用不同浓度的稀释液培养斑马鱼胚胎，然后在7-72 hpf观察记录不同浓度的稀释液对斑马鱼胚胎发育的影响，来判断植物提取物对斑马鱼胚胎发育的毒性。

优选地，所述的斑马鱼胚胎为处于4hpf(囊胚期)的胚胎。因为囊胚期为细胞高度分裂期，对毒性作用敏感。进一步，所述的斑马鱼为AB系斑马鱼。

优选地，所述斑马鱼胚胎通过如下方法选择：

选择游动和体色均正常3月龄的斑马鱼，繁养条件：通过光控系统，保持光照14h/黑暗10h交替的光照周期；水温维持在28.5℃；繁养用水电导率控制在500-550μs，由NaCl饱和溶液调节；同时pH控制在7.2-7.5，由NaHCO₃溶液调节；投喂由美国大盐湖丰年虫卵，孵化24h的丰年虾，2-3次/天；选择游动和体色均正常，摄食无异常的4月以上性成熟的健康成鱼(更优选为5月龄)进行配对，产卵前天傍晚亲鱼经投喂后，按照雌雄比例1:2或1：1，放入交配盒，以透明挡板分开，第二天早上经光刺激后于9点-10点取出挡板，自然交配并收集受精卵，用胚胎培养液清洗1-2次去除坏卵、粪便和杂质后，置于胚胎培养液中，在28.5℃，无光照的恒温培养箱中进行静置培养，每毫升培养液中最多只培养10个胚胎；当4hpf时，在显微镜下挑选来自同一亲本、正常发育比率达80％以上且发育时期一致的斑马鱼胚胎。

优选地，所述培养斑马鱼胚胎的方法如下：将斑马鱼胚胎以胚胎培养液清洗两遍，随机移取胚胎至加有1ml胚胎培养液/孔的24孔板中，每孔10胚胎，用巴氏吸管吸去胚胎培养液后迅速加入不同浓度的稀释液，每浓度3个复孔，同时设置对照组胚胎培养液组和二甲基亚砜组，二甲基亚砜组是将二甲基亚砜用胚胎培养液稀释，其中二甲基亚砜组的浓度与待检测的各稀释液中的浓度一致，每孔加液1ml，每24h换液一次。

优选地,所述不同浓度的稀释液中所含二甲基亚砜最终浓度一致且最终浓度为0.3％或0.5％(V/V)。

优选地，观察记录的时间为：7hpf、24hpf、31hpf、48hpf、55hpf、72hpf。

本发明中提及的NaCl，NaHCO₃，KCl，CaCl₂，MgSO₄，NaOH均为分析纯级别。

本发明利用斑马鱼胚胎测试天然植物提取物急性毒性的方法，可初步判断植物提取物的急性毒性，速度快，稳定性强，在实际实验过程中，已经验证了该方法在初步判断烟酸、反丁烯二酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、连翘苷、连翘酯苷A、蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、欧当归内酯A、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷、盐酸小檗碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、熊果酸、大黄酚、葛根素、马前苷等植物提取物的急性毒性中，均能得到稳定的实验结果，为后来的实验提供实验依据，为了节省篇幅，实施例2、3中仅以反丁烯二酸、葛根素为例来进行说明。

本发明所具有的有益效果：

本发明利用斑马鱼胚胎测试天然植物提取物急性毒性的方法，选择健康，发育同步的sphere期斑马鱼胚胎，测试不同植物提取物溶解于胚胎培养液中，通过扩散吸收方式测试不同浓度下对斑马鱼胚胎发育的影响，统计和分析实验数据，得出胚胎存活率为0-100％时相应的提取物浓度，作浓度效应曲线，对毒性大小进行初步判断，排除毒性大的天然植物提取物，为后来的实验提供实验依据。

本发明方法操作简便，实用性强，可初步判断植物提取物的急性毒性，速度快，精确度高。

本发明通过严格控制3月龄斑马鱼的繁养条件及胚胎的培养孵化条件，最大限度的保证了斑马鱼的繁殖和发育正常，保证了产卵率和成功率。

附图说明

图1为反丁烯二酸在72hpf和96hpf对胚胎的致死率线性图。

具体实施方式

为了理解本发明，下面结合具体实施例进一步说明本发明，但不限定本发明的保护范围。

实施例1

斑马鱼胚胎测试植物提取物急性毒性的方法，包括如下步骤：

胚胎培养液的配制：

胚胎培养液，即胚胎的培养用水，其中胚胎培养液含有：NaCl 5mM，KCl 0.17mM，C aCl₂0.33mM，MgSO₄0.33mM，以1M NaOH调节pH至6.8-7.0，电导率在500-550μs。常温放置使用，使用过程中注意温度不能相差大。

植物提取物工作液的配制：

植物提取物母液：以助溶剂DMSO溶解植物提取物粉末至澄清，用10ml注射器、0.22μm滤器单独过滤两次后，分装至已灭菌的1.5ml Eppendorf管，标记母液的名称、浓度、配制时间等信息，储存于-20℃。

植物提取物工作液：用胚胎培养液稀释植物提取物母液配制不同浓度的工作液，要求工作液内所含助溶剂最终浓度一致且最终浓度少于1.2％(V/V)。选择较宽的浓度范围进行试验：1μM，5μM，10μM，25μM，50μM，100μM，200μM，500μM，震荡摇匀，现配现用；

主要通过以下步骤进行植物提取物毒性测定。

1)、斑马鱼的培养

选择游动和体色均正常3月龄的斑马鱼，繁养条件：通过光控系统，保持光照14h/黑暗10h交替的光照周期；水温维持在28.5℃；繁养用水电导率控制在500-550μs，由NaCl饱和溶液调节；同时pH控制在7.2-7.5，由NaHCO₃溶液调节；投喂由美国大盐湖丰年虫卵，孵化24h的丰年虾，2-3次/天；

2)、胚胎挑选

选择游动和体色均正常，摄食无异常的5月龄性成熟的健康成鱼进行配对，产卵前天傍晚亲鱼经投喂后，按照雌雄比例1:2，放入交配盒，以透明挡板分开，第二天早上经光刺激后于9：30AM取出挡板，自然交配并收集受精卵，用胚胎培养液清洗2次去除坏卵、粪便和杂质后，置于胚胎培养液中，在28.5℃，无光照的恒温培养箱中进行静置培养，每毫升培养液中最多只培养10个胚胎，；12:15PM在显微镜下挑选来自同一亲本、正常发育比率达80％以上且发育时期一致的斑马鱼胚胎。

将斑马鱼胚胎用胚胎培养液清洗两遍，随机移取胚胎至加有1ml胚胎培养液/孔的24孔板中，每孔10胚胎，4hpf(球形期)时用巴氏吸管吸去胚胎培养液后迅速加入不同浓度的工作液，每浓度3个复孔，同时设置对照组胚胎培养液组和二甲基亚砜组，二甲基亚砜组是将二甲基亚砜用胚胎培养液稀释，其中二甲基亚砜组的浓度与待检测的各工作液中的浓度一致。每孔加液1ml，每24h换液一次；换液时防止温差过大影响胚胎发育。

培养至7-72hpf，需在显微镜下定时观察，及时剔除死卵，并根据胚胎各时期的发育特征和不同的毒理学终点和毒理指标，观察和记录胚胎发育的表型变化、正常率、畸形率、死亡率和未孵化率等信息。

对72hpf斑马鱼胚胎的侧面和背面拍照存档。避免胚胎反射性游走，可用0.0025～0.003％(g/ml)麻醉剂Tricaine(MS-222)麻醉1-3min，置于桥接盖玻片或100mm培养皿，以3.5％甲基纤维素进行定位拍照。

数据分析

采用Excel2007对实验数据求均值，方差和T-test，根据胚胎存活率和致畸效应浓度分别均为0-100％时相应的提取物浓度，作浓度效应曲线。用IBM SPSS19.0计算出半数致死浓度LC50(Lethality Concentration 50％)和半最大效应浓度EC50(Concentration for50％ of maximal effect)，依据LC50和EC50作为中轴线，再设较低和较高的浓度，在小浓度范围内进行三次的重复实验以确定LC50和EC50。

天然植物提取物对斑马鱼胚胎毒性判断

化合物对斑马鱼胚胎的毒效大小由治疗系数TI(Teratogenic index)进行评价，TI是通过比较引起半数致死的化合物浓度(LC50)和引起50％个体的发育缺陷浓度(EC50)而得，即TI＝LC50/EC50。当TI＞1时，说明引起半数胚胎畸形的浓度低于引起半数胚胎死亡的浓度，可判定此化合物会引起胚胎畸形，有毒性；当TI＜1时则判定对胚胎无毒性。当TI＝1是则说明相同浓度下有半数胚胎死亡和半数胚胎畸形，此现象一般不出现。

实施例2

用实施例1的方法来测试反丁烯二酸急性毒性。

下述所提及的E3，即指的是胚胎培养液；

实验分成两个大组：

CK组：1XE3、0.1％DMSO、0.3％DMSO；

实验组(反丁烯二酸)：50um、100um、200um、500um——均以1XE3配制

反丁烯二酸母液：以助溶剂DMSO溶解反丁烯二酸粉末至澄清，用10ml注射器、0.22μm滤器单独过滤两次后，分装至已灭菌的1.5ml Eppendorf管，标记母液的名称、浓度、配制时间等信息，储存于-20℃。

反丁烯二酸工作液：用E3稀释反丁烯二酸母液配制不同浓度的工作液，要求工作液内所含DMSO最终浓度为0.3％(V/V)。选择较宽的反丁烯二酸浓度范围进行试验：50μM，100μM，200μM，500μM，震荡摇匀，现配现用。

分别在8.75hpf、23.4hpf、32.2hpf、47.3hpf、50hpf、53.3hpf、55.4hpf、72hpf、80.3hpf、96hpf时间点进行观察。

实验结果如下：

CK组：

表1

CK	1XE3	0.1％DMSO	0.3％DMSO
				72hpf存活率-％	100％	96.70％	100％
72hpf死亡率-％	0％	3.30％	0％
				72hpf致死/致畸率-％	3.30％	3.30％	0％
96hpf存活率-％	100％	97.70％	100％
				96hpf死亡率-％	0％	3.30％	0％
96hpf致死/致畸率-％	3.30％	3.30％	0％

从表1可以看出，在72hpf和96hpf，CK组几乎100％的鱼仔正常发育，个别一两个属于自身发育异常，可忽略，这说明该实验的可信度高。

实验组

表2

反丁烯二酸	50um	100um	200um	500um
					72hpf存活率-％	70％	23.3％	0％	0％
72hpf死亡率-％	30％	76.7％	100％	100％
					72hpf致死/致畸率-％	40％	80％	100％	100％
96hpf存活率-％	70％	20％	0％	0％
					96hpf死亡率-％	30％	80％	100％	100％
96hpf致死/致畸率-％	43.3％	80％	100％	100％

从图1和表2可以看出，在72hpf和96hpf的结果中可知随着药物浓度的增加，鱼仔的存活率减少，致死/致畸率成正比例上升；且两个观察时间点所得到的数据和线性趋势几乎一致，证明该实验条件下，72hpf为该药对斑马鱼胚胎有明显药效的稳定观察点。

从72hpf和96hpf对胚胎的致死率线性图发现，在50um-100um浓度下，胚胎死亡率为23.3-70％，估计LC50在两浓度间(约58um)。

在实验过程中发现，在500um浓度下，8.75hpf有约50％的卵凝结死亡，48hpf已100％死亡，该浓度下的药物对胚胎毒性强烈。200um浓度下，32.2hpf约90％胚胎正常，但48hpf时大部分鱼仔死亡。

实施例3

用实施例1的方法来测试葛根素的急性毒性。

下述所提及的E3，即指的是胚胎培养液；

实验分成两个大组：

CK组：1XE3、0.5％DMSO；

实验组(葛根素)：1um、5um、10um、25um、50um、100um、200um——均以1XE3配制

葛根素母液：以助溶剂DMSO溶解葛根素粉末至澄清，用10ml注射器、0.22μm滤器单独过滤两次后，分装至已灭菌的1.5ml Eppendorf管，标记母液的名称、浓度、配制时间等信息，储存于-20℃。

葛根素工作液：用E3稀释葛根素母液配制不同浓度的工作液，要求工作液内所含助溶剂最终浓度为0.5％(V/V)。选择浓度范围为：1um、5um、10um、25um、50um、100um、200um，震荡摇匀，现配现用。

CK组实验结果见表3所示：

表3

实验组的实验结果见表4、表5所示。其中表4为在72hpf不同浓度葛根素(每个浓度3个复孔)对胚胎畸形/死亡率的影响结果，表5为96hpf不同浓度葛根素(每个浓度3个复孔)对胚胎畸形/死亡率的影响结果，通过表4可以看出，同一浓度每孔的重复性较好。通过表4、表5可以看出，在72hpf和96hpf，实验组几乎100％的鱼仔正常发育，个别一两个属于自身发育异常，可忽略，这说明该实验的可信度高。葛根素在200uM浓度下对斑马鱼胚胎的毒性很低甚至没有(从心率，体轴、心包等整体形态进行观察分析)。少部分孔出现的畸形胚胎是估计是鱼胚胎本身质量问题，而非药的毒性所致。

表4

表5

葛根素平均值	CK-1XE3	CK-0.5％DMSO	1uM	5uM	10uM	25uM	50uM	100uM	200uM
										96hpf平均正常率％	100	100	96.67	96.67	100	96.67	100	96.67	100
96hpf平均畸形率％	0	0	3.33	3.33	0	3.33	0	3.3	0
										96hpf平均死亡率％	0	0	0	0	0	0	0	0	0

实施例4：本发明的培养条件对斑马鱼存活率的影响

1)、斑马鱼的培养

选择游动和体色均正常3月龄的斑马鱼，繁养条件：通过光控系统，保持光照14h/黑暗10h交替的光照周期；水温维持在28.5℃；繁养用水电导率控制在500-550μs，由NaCl饱和溶液调节；同时pH控制在7.2-7.5，由NaHCO₃溶液调节；投喂由美国大盐湖丰年虫卵，孵化24h的丰年虾，2-3次/天；

2)、胚胎挑选

选择游动和体色均正常，摄食无异常的5月龄性成熟的健康成鱼进行配对，产卵前天傍晚亲鱼经投喂后，按照雌雄比例1:2，放入交配盒，以透明挡板分开，第二天早上经光刺激后于9：30AM取出挡板，自然交配并收集受精卵，用胚胎培养液清洗2次去除坏卵、粪便和杂质后，置于胚胎培养液中，在28.5℃，无光照的恒温培养箱中进行静置培养，每毫升培养液中最多只培养10个胚胎；12:15PM在显微镜下挑选来自同一亲本、正常发育比率达80％以上且发育时期一致的斑马鱼胚胎。

将斑马鱼胚胎用胚胎培养液清洗两遍，随机移取胚胎至加有1ml胚胎培养液/孔的24孔板中，每孔10胚胎，每24h换液一次，72h观察斑马鱼的透明度和存活率。

所提及的胚胎培养液，即胚胎的培养用水，其中胚胎培养液含有：NaCl 5mM，KCl0.17mM，CaCl₂0.33mM，MgSO₄0.33mM，以1M NaOH调节pH至6.8-7.0，电导率在500-550μs。常温放置使用，使用过程中注意温度不能相差大。

结果发现：透明度好，存活率为100％，平均畸形率为3.33％。通过严格控制3月龄斑马鱼的繁养条件及胚胎的培养孵化条件，最大限度的保证了斑马鱼的繁殖和发育正常，保证了成功率。

Claims (6)

1.一种利用斑马鱼胚胎测试天然植物提取物急性毒性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

配制胚胎培养液，即胚胎的培养用水，其中胚胎培养液含有：NaCl 5mM，KCl0.17mM，C aCl₂0.33mM，MgSO₄0.33mM，以1M NaOH调节pH至6.8-7.0，电导率在500-550μs；

将植物提取物粉末以二甲基亚砜溶解至澄清，过滤2次，用胚胎培养液稀释，获得含植物提取物不同浓度的稀释液，不同浓度的稀释液中所含二甲基亚砜最终浓度一致且最终浓度小于等于1.2％(V/V)；用不同浓度的稀释液培养斑马鱼胚胎，然后在7-72hpf观察记录不同浓度的稀释液对斑马鱼胚胎发育的影响，来判断植物提取物对斑马鱼胚胎发育的毒性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的斑马鱼胚胎为处于4hpf的胚胎。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述斑马鱼胚胎通过如下方法选择：选择游动和体色均正常3月龄的斑马鱼，繁养条件：通过光控系统，保持光照14h/黑暗10h交替的光照周期；水温维持在28.5℃；繁养用水电导率控制在500-550μs，由NaCl饱和溶液调节；同时pH控制在7.2-7.5，由NaHCO₃溶液调节；投喂由美国大盐湖丰年虫卵，孵化24h的丰年虾，2-3次/天；选择游动和体色均正常，摄食无异常的4月以上性成熟的健康成鱼(更优选为5月龄)进行配对，产卵前天傍晚亲鱼经投喂后，按照雌雄比例1:2或1：1，放入交配盒，以透明挡板分开，第二天早上经光刺激后于9点-10点取出挡板，自然交配并收集受精卵，用胚胎培养液清洗1-2次去除坏卵、粪便和杂质后，置于胚胎培养液中，在28.5℃，无光照的恒温培养箱中进行静置培养，每毫升培养液中最多只培养10个胚胎；当4hpf时，在显微镜下挑选来自同一亲本、正常发育比率达80％以上且发育时期一致的斑马鱼胚胎。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述培养斑马鱼胚胎的方法如下：将斑马鱼胚胎以胚胎培养液清洗两遍，随机移取胚胎至加有1ml胚胎培养液/孔的24孔板中，每孔10胚胎，用巴氏吸管吸去胚胎培养液后迅速加入不同浓度的稀释液，每浓度3个复孔，同时设置对照组胚胎培养液组和二甲基亚砜组，二甲基亚砜组是将二甲基亚砜用胚胎培养液稀释，其中二甲基亚砜组的浓度与待检测的各稀释液中的浓度一致，每孔加液1ml，每24h换液一次。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述不同浓度的稀释液中所含二甲基亚砜最终浓度一致且最终浓度为0.3％或0.5％(V/V)。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：观察记录的时间为：7hpf、24hpf、31hpf、48hpf、55hpf、72hpf。