CN102899383A

CN102899383A - 斑马鱼测试水质及其毒性的用途和方法

Info

Publication number: CN102899383A
Application number: CN2012104539036A
Authority: CN
Inventors: 陈�峰
Original assignee: South China Botanical Garden of CAS
Current assignee: South China Botanical Garden of CAS
Priority date: 2012-11-13
Filing date: 2012-11-13
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2032-11-13
Also published as: CN102899383B

Abstract

本发明涉及一种斑马鱼测试水质及其毒性的用途和方法，其特征在于方法包含如下步骤：配制胚胎培养液，然后向胚胎培养液中加入待测水源，待测水源的加入体积与胚胎培养液的体积比为1∶3，用加入了待测水源的胚胎培养液培养斑马鱼胚胎，然后在12-24小时观察记录斑马鱼胚胎发育的畸形率和死亡率，来判断待测水源对胚胎的毒性。其中胚胎培养液用pH为6.7-8.5的弱碱性水直接配制，胚胎培养液中含有5mM NaCl、0.17mM KCl、0.43mM CaCl₂和0.33mMMgSO₄。本发明使用弱碱性水配制的胚胎培养液使得斑马鱼胚胎能够快速测试待测水源的综合毒性，缩短了检测周期。

Description

斑马鱼测试水质及其毒性的用途和方法

技术领域

本发明涉及毒性检测领域，具体涉及一种斑马鱼测试水质及其毒性的用途和方法。

背景技术

水在环境作用下所表现出来的综合特征，即水的物理性质和化学成分。自然界中的水，是由各种物质(溶解性和非溶解性物质)所组成的极其复杂的综合体。水中含有的溶解物质，直接影响天然水的许多性质，使水质有优劣之分。

对日益恶化的水源污染问题，自来水厂所采取的方式便是加入大量超过标准的氯(漂白粉)来消毒杀菌。加氯虽然能够杀死水中的各种病菌，但它一旦与水中的有机物结合，会因余氯或漂白粉的作用，产生大量有机氯化物(如三氯甲烷、二溴氯甲烷)，危害人体健康。有机氯化物在动物体系的试验中已被确认为致癌物质。

简单地检测水质的方法例如1.PH值试纸，标准：小于不小于7.5且不大于8.5，色度(铂钴色度单位)，比色法，自制标准液，标准：小于15，浑浊度(NTU-散射浊度单位)比色法，自制标准液，标准：小于1，臭和味：标准：无异臭、异味，肉眼可见物：标准：无

生活饮用水的水质标准有很多，例如感官性状，化学指标，毒理学指标，细菌学指标，放射性指标等。具体的，例如臭和味，浊度，水温，氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、氏氮、总氮，正磷酸盐、总磷，pH值，无机盐如钠，钾，钙，锰，镁等，重金属如铅、汞、砷等，有机物：化学需氧量(COD)、生化需氧量(BOD)、高锰酸钾指数、总有机碳(TOC)、有色可溶性有机物(CDOM)，溶解有机碳(DOC)，致癌物如二噁英，微生物如大肠杆菌、隐孢子虫、兰伯氏鞭毛虫等。

目前的测试水质的指标过多，而且工程比较大，而且对于很多未知的危害因素无法预期测量，所以急需一种能够快速测量水质是否满足饮用水的要求。

本发明发明人在科研过程中，有了一个惊奇的发现，即当使用特殊的胚胎培养液培养斑马鱼时，在培养液中加入需要检测的水源，能够使胚胎对水质的不良反应在较短的时间内表现出来，大大缩短了检测周期。

发明内容

本发明所要解决的技术问题提供一种斑马鱼测试水质及其毒性的用途和方法。为了解决上述问题，本发明采用以下的技术方案。

本发明提供一种斑马鱼测试水质及其毒性的用途和方法，其特征在于包含如下步骤：

配制胚胎培养液，然后向胚胎培养液中加入待测水源，待测水源的加入体积与胚胎培养液的体积比为1∶3，用加入了待测水源的胚胎培养液培养斑马鱼胚胎，然后在12-24小时观察记录斑马鱼胚胎发育的畸形率和死亡率，来判断待测水源对胚胎的毒性。其中胚胎培养液用pH为6.7-8.5的弱碱性水直接配制，胚胎培养液中含有5mM NaCl、0.17mM KCl、0.43mM CaCl₂和0.33mM MgSO₄。

上述方法中，斑马鱼胚胎通过如下方法选择：

采卵前一天将性成熟的斑马鱼，按雌∶雄为1∶2的比例放入配缸内并隔开，次日上午9:00自然交配并收集受精卵，用胚胎培养液清洗两次收集得到的受精卵，并去除杂质和坏卵，之后后置于胚胎培养液中，29.3℃进行控光培养；当2hpf时，在显微镜下挑选来自同一亲本、正常发育比率达85％以上且发育时期一致的斑马鱼胚胎。

上述方法中，培养斑马鱼胚胎的方法如下：将斑马鱼胚胎用胚胎培养液清洗两次，然后移入24孔板的样孔中，每孔20枚，每孔滴加加入了待测水源的胚胎培养液，每孔4ml，随后加盖封闭，置于培养箱中，在29.3℃培养斑马鱼胚胎。

上述方法中，观察记录的时间是培养后第12、18、24小时，记录畸形率和死亡率。

上述方法中，pH为7.0-7.8，优选地，pH为7.2。

畸形是指斑马鱼体型与正常的相同培养时间单用胚胎培养液培养的斑马鱼体型有差异。

死亡是指用搅拌棒触碰斑马鱼尾部时斑马鱼没有任何反应。

上述方法中，所述的待测水源为任何需要测量其对生物毒性的水源，优选地，待测水源为天然泉水、河水、饮用水、工厂污水等，尤其优选地是含有重金属铅和铬超标的待测水源，二氯甲烷或甲苯超标的水源。

本发明还提供了斑马鱼用于测试待测水源毒性的用途，其特征在于：向胚胎培养液中加入待测水源，待测水源的加入体积与胚胎培养液的体积比为1∶3，用加入了待测水源的胚胎培养液培养斑马鱼胚胎，然后在12-24小时观察记录斑马鱼胚胎发育的畸形率和死亡率，来判断待测水源对胚胎的毒性，其中胚胎培养液用pH为6.7-8.5的弱碱性水直接配制，胚胎培养液中含有5mM NaCl、0.17mM KCl、0.43mM CaCl₂和0.33mM MgSO₄。

本发明配制胚胎培养液所用的氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁以及弱碱性水等均为市购，其中无机盐均为AR级；

需要特别说明的是，弱碱性水可以采用任何通过光电催化电解水获得的弱碱性水，该弱碱性水的pH为6.7-8.5，可以通过市场上的弱碱性水制备装置制备，也可以自行通过电解的方式制备，需要注意的是本发明的弱碱性水并不是通过在水中加入化学物质制备得到的弱碱性水，任何通过加入化学物质到水中制备的弱碱性水不是本发明所说的弱碱性水。弱碱性水的pH可以在制备中调节，而不是通过加入化学物质调节pH。

本发明的有益效果：

本发明使用弱碱性水配制的胚胎培养液来作为测试待测水源毒性的培养液，其不仅因为培养液中的水为弱碱性水，还因为培养液中的无机盐的特定组成，使得斑马鱼胚胎能够快速测试待测水源的综合毒性，缩短了检测周期。

具体实施方式

为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但本发明并不限制于此。

实施例1最佳胚胎培养液的筛选

1.1不同配方的胚胎培养液的配制及培养斑马鱼的效果

A用普通水配制包含以下浓度无机盐的胚胎培养液，调节pH为7.2，培养斑马鱼胚胎72小时，观察斑马鱼的透明度和存活率。具体结果见表1：

表1普通水配制的胚胎培养液对斑马鱼胚胎的影响

B用通过电解纯水制备的pH为7.2的弱碱性水配制包含以下浓度无机盐的胚胎培养液，培养斑马鱼胚胎72小时，观察斑马鱼的透明度和存活率。具体结果见表2：

表2弱碱性水配制的胚胎培养液对斑马鱼胚胎的影响

通过普通水和弱碱性水配制的不同浓度比例的培养液可以看出，A1和B1的培养液对斑马鱼的培养效果最好。这证明本发明采用的无机盐浓度作为培养液是优选的。

实施例2斑马鱼测试水源毒性

分别用上述编号A1和B1的胚胎培养液加入待测水源，待测水源与胚胎培养液的体积比为1∶3，并对所述溶液进行斑马鱼毒性测定，其中每一处理重复5次，取平均值，对照为未加待测水源的胚胎培养液A1和B1。主要通过以下步骤进行测定：

1)斑马鱼的培养：

取性成熟AB系普通斑马鱼雌雄分缸，饲养于流水循环养殖系统，照明14h/黑暗10h交替进行，水温保持在28℃，定时喂以人工孵育24h的丰年虾；

2)胚胎挑选：

采卵前一天将性成熟的斑马鱼，按雌∶雄为1∶2的比例放如配缸内并隔开，次日上午9:00自然交配并收集受精卵，用胚胎培养液B1清洗两次收集得到的受精卵，并去除杂质和坏卵，之后后置于胚胎培养液B1中，29.3℃进行控光培养；当2hpf时，在显微镜下挑选来自同一亲本、正常发育比率达85％以上且发育时期一致的胚胎，用胚胎培养液B1清洗两次后移入24孔板的样孔中，每孔20枚；

3)处理：

吸走样孔中的胚胎培养液B1，且将配制好的含有待测水源的胚胎培养液和不含待测水源的培养液A1和B1分别迅速加入样孔中，每孔4ml，随后加盖封闭，置于培养箱29.3℃培养；

4)观察胚胎和记录：

定期在显微镜下观察并记录胚胎的畸形率(取5次平行试验的平均值)和死亡率(取5次平行试验的平均值)。

结果，见表3：

表3含待测水源的胚胎培养液处理结果

其中水源1是经过测定满足饮用水标准的饮用水，水源2是经过测量受过化工厂污水污染的河水，水中超标物质未知。水源3是重金属超标的水源，其中铬金属离子超标，达到了3ppm，铅金属离子超标，达到了0.3ppm，水源4是有机物超标的水源，其中甲苯的浓度达到了100ppm。

通过对斑马鱼胚胎的A1培养液和B1培养液的试验发现，A1和B1胚胎培养液本身对斑马鱼胚胎的影响是相同，培养液本身并没有对斑马鱼胚胎的生长产生影响，但是如果加入超标水源后发现，同样在含有水源2的培养液中培养斑马鱼，可以发现B1的培养液对斑马鱼胚胎的影响是迅速的，能够在培养12小时就见到明显效果，培养12小时就能够达到含有相同水源2的A1的培养到24小时候才能够初步看到的效果，所以说B1培养液中测试待测水源对斑马鱼胚胎的影响是快速的，也就是说用斑马鱼胚胎测试待测水源的影响，用B1的胚胎培养液效果明显，时间短，反应迅速。B1胚胎培养液的特点是用弱碱性水配制培养液，其中的无机盐能够与弱碱性水共同实现斑马鱼测试待测水源毒性的作用。

通过本发明的斑马鱼测试方法测量后，发现水源2术语存在超标污染物的水源。对水源2中含有的污染物的测量，发现其中二氯甲烷的浓度达到了117ppm，超过了生物生存的二氯甲烷的量，对水生生物具有严重的影响，对于这样的水源，本发明的方法能够在12小时就看到明显水源不满足要求的结果。

对于污染物然中超标，也就是通过观察其颜色或味道就能够判断肯定超标的水源，经过本发明的斑马鱼方法测试，能够在12小时就看到斑马鱼胚胎停止发育或发育后很快死亡的现象，说明本发明的方法对于严重超标污染的水源的测量是快速而且准确的。

所以说应用弱碱性水配制的5mM NaCl、0.17mM KCl、0.43mM CaCl₂和0.33mM MgSO₄的培养液能够使得斑马鱼胚胎快速检测出待测水源的毒性。

Claims

1.一种斑马鱼测试水质及其毒性的方法，其特征在于包含如下步骤：

配制胚胎培养液，然后向胚胎培养液中加入待测水源，待测水源的加入体积与胚胎培养液的体积比为1∶3，用加入了待测水源的胚胎培养液培养斑马鱼胚胎，然后在12-24小时观察记录斑马鱼胚胎发育的畸形率和死亡率，来判断待测水源对胚胎的毒性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中胚胎培养液用pH为6.7-8.5的弱碱性水直接配制，胚胎培养液中含有5mM NaCl、0.17mM KCl、0.43mM CaCl₂和0.33mM MgSO₄。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中斑马鱼胚胎通过如下方法选择：

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中培养斑马鱼胚胎的方法如下：将斑马鱼胚胎用胚胎培养液清洗两次，然后移入24孔板的样孔中，每孔20枚，每孔滴加加入了待测水源的胚胎培养液，每孔4ml，随后加盖封闭，置于培养箱中，在29.3℃培养斑马鱼胚胎。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中观察记录的时间是培养后第12、18、24小时，记录畸形率和死亡率。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中pH为7.0-7.8。

7.根据权利要求6所述的方法，其中pH为7.2。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中待测水源为任何需要测量其对生物毒性的水源。

9.斑马鱼用于测试待测水源毒性的用途，其特征在于：向胚胎培养液中加入待测水源，待测水源的加入体积与胚胎培养液的体积比为1∶3，用加入了待测水源的胚胎培养液培养斑马鱼胚胎，然后在12-24小时观察记录斑马鱼胚胎发育的畸形率和死亡率，来判断待测水源对胚胎的毒性，其中胚胎培养液用pH为6.7-8.5的弱碱性水直接配制，胚胎培养液中含有5mM NaCl、0.17mM KCl、0.43mM CaCl ₂和0.33mM MgSO₄。