CN115747343A - 一种基于青鳉鱼胚胎生物标志物的水质安全诊断方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于青鳉鱼胚胎生物标志物的水质安全诊断方法，通过青鳉鱼胚胎暴露试验，测定青鳉鱼胚胎个体水平生物标志物和分子水平生物标志物，并将各青鳉鱼胚胎生物标志物量化整合成青鳉鱼胚胎生物标志物响应指数从而更全面、更准确地量化水体污染程度，评价水体质量；与传统以污染物浓度为指标的评价模型相比，该方法可以真实地反映水环境安全状况；与青鳉鱼异常行为特征或单一毒理学数据建立的水质安全诊断模型相比，该方法将多种青鳉鱼胚胎生物标志物同时纳入模型体系，提高了水质生物监测系统的准确率和稳定性，同时基于青鳉鱼胚胎对水体质量更为敏感的特点，该方法能更及时地对水体质量作出准确评价。
Description
技术领域
本发明属于水质监测技术领域，尤其涉及一种基于青鳉鱼胚胎生物标志物的水质安全诊断方法。
背景技术
城镇化及工业化的快速发展导致我国多数城市正面临水体污染问题。城市污染水体既制约了区域社会与经济的发展，也对区域生态安全和居民环境造成了严重破坏。尽管我国污染水体治理技术日趋完善，但目前仍缺乏一种能够稳定、准确评价水体质量的安全诊断方法。
传统的物理化学监测方法仅能分析有限的水质指标，对于水体本身的生态功能、总体健康水平缺少毒理学数据的支撑，无法对整个水体的生态系统功能进行明确诊断。水质生物监测弥补了这方面的不足，可以从生物学角度反映大部分污染物引起的水体综合环境的变化。青鳉鱼是国际标准组织(ISO)推荐的毒性实验标准用鱼之一，因其具有体型小、易于培养、世代时间短、生存范围广(广温性和广盐性)、毒理学数据丰富、对多数污染物敏感等优点，被广泛用于水质监测领域。现有的青鳉鱼水质监测方法常使用青鳉鱼的异常行为特征或单一毒理学数据建立水质安全诊断模型。然而，实际应用过程中这些方法仍然存在一些不足，主要包括：(1)青鳉鱼的行为也受到其他非水质因素(包括水温、pH、噪音)的干扰，进而导致了青鳉鱼水质生物监测系统误报率高、稳定性差的问题；(2)青鳉鱼的异常行为特征仅仅能判断水体是否发生污染，不能准确评价水体污染程度；(3)单一毒理学数据判断的水体质量仍存在一定偶然性；(4)成鱼相对胚胎来说对污染物有较大耐受性，因此基于成鱼评估水体质量，存在一定的延时性问题。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷和不足，本发明提供了一种基于青鳉鱼胚胎生物标志物的水质安全诊断方法。本发明通过测定水体暴露下青鳉鱼胚胎的多种生物标志物，并将各生物标志物量化整合成青鳉鱼胚胎生物标志物响应指数以量化水体污染程度，准确评价水体质量。
为达到上述目的，本发明是通过如下具体技术方案实现的：
一种基于青鳉鱼胚胎生物标志物的水质安全诊断方法，通过测定水体暴露下青鳉鱼胚胎的多种生物标志物，并将各生物标志物量化整合成青鳉鱼胚胎生物标志物响应指数以量化水体污染程度，准确评价水体质量，本方法具体步骤如下：
步骤一、青鳉鱼胚胎暴露实验：
在恒温28.0±0.1℃的条件下，将青鳉鱼受精卵置于一个半静态装置内进行暴露实验，暴露实验分为对照组和实验组，对照组设置清洁水体，实验组设置待测水体，每组设置m个平行实验，其中m≥3，每个平行实验中放置n粒青鳉鱼受精卵，其中n≥20，每个平行实验中暴露溶液的体积至少为半静态装置容积的1/2，暴露期间每天更换装置内至少2/3的暴露溶液；
步骤二、测定青鳉鱼胚胎生物标志物：
测定的生物标志物包括青鳉鱼胚胎个体水平生物标志物和分子水平生物标志物；
其中个体水平生物标志物包括死亡率、畸形率、孵化率和孵化时间；
分子水平生物标志物包括BMP2基因和BMP4基因；
1、个体水平生物标志物的测定方法如下：
(1)使用显微镜观察记录胚胎的死亡率；
(2)使用显微镜观察记录胚胎的畸形率；
(3)使用显微镜观察记录胚胎的孵化率；
(4)观察记录胚胎的孵化时间；
(5)将得到的实验结果进行处理；
2、分子水平生物标志物测定方法如下：
(1)提取青鳉鱼胚胎或孵化幼鱼的总RNA；
(2)对提取的总RNA进行反转录合成cDNA；
(3)根据试剂盒说明书配制实时荧光定量PCR反应体系；
(4)PCR扩增和荧光定量：进行PCR扩增，得到扩增曲线，并对数据进行处理，进而得到BMP2基因和BMP4基因的表达量；
(5)将得到的实验结果进行处理；
步骤三、生物标志物响应指数：
将青鳉鱼胚胎死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因的表达量进行整合，形成青鳉鱼胚胎生物标志物响应指数；
青鳉鱼胚胎生物标志物响应指数Z的具体计算过程为：将青鳉鱼胚胎死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因分别定义为A、B、C、D、E和F；分别计算青鳉鱼胚胎死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因的偏离度RY，RY＝|PY-QY|/QY，PY表示实验组中青鳉鱼胚胎死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因或BMP4基因的测定结果，QY表示对照组中青鳉鱼胚胎死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因或BMP4基因的测定结果，Y＝A，B，C，D，E，F；
根据实验组中死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因或BMP4基因的偏离度RY分别为实验组中死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因赋予指定值SY，Y＝A，B，C，D，E，F；
当RY≤20％时，生物标志物的指定值SY设置为4；
当20％<RY≤50％时，生物标志物的指定值SY设置为3；
当50％<RY≤100％时，生物标志物的指定值SY设置为2；
当RY>100％时，生物标志物的指定值SY设置为1；
根据死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因所处的层级分别为死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因赋予权重WY，Y＝A，B，C，D，E，F；
死亡率的权重WA设置为3.0；
畸形率的权重WB设置为2.4；
孵化率的权重WC设置为2.4；
孵化时间的权重WD设置为2.4；
BMP2基因的权重WE设置为1.9；
BMP4基因的权重WF设置为1.9；
将实验组的死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因的指定值SA、SB、SC、SD、SE、SF和权重WA、WB、WC、WD、WE、WF全部代入Z＝∑SYWY/∑WY，其中Y＝A，B，C，D，E，F，计算得到实验组的生物标志物响应指数Z；
步骤四、根据实验组的青鳉鱼胚胎生物标志物响应指数Z确定实验组水体的生物胁迫等级和水体污染程度；
当3.00<Z≤4.00时，表明水体对青鳉鱼胚胎或幼鱼无胁迫或轻度胁迫；
当2.75<Z≤3.00时，表明水体对青鳉鱼胚胎或幼鱼中等胁迫；
当2.50<Z≤2.75时，表明水体对青鳉鱼胚胎或幼鱼较大胁迫；
当0.00≤Z≤2.50时，表明水体对青鳉鱼胚胎或幼鱼严重胁迫。
进一步的技术方案包括：
步骤一中，实验组设置的待测水体为真实环境中采集的待测污染水体。
步骤二中的个体水平生物标志物的测定方法如下：
(1)死亡率：每天8:00-9:00使用显微镜观察记录所有胚胎的死亡情况；当胚胎心脏无有节律的震动、卵黄囊外侧及胚胎中后部无体节、胚胎呈白色不透明或灰暗状态或胚胎尾部与卵黄囊未分离，出现以上任意一种情况即判定胚胎死亡；死亡率(％)＝死亡胚胎数量/胚胎总数×100％；
(2)畸形率：每天8:00-9:00使用显微镜观察记录所有胚胎及孵化幼鱼的畸形情况；当胚胎及孵化幼鱼出现脊柱弯曲或出现血栓，即判定胚胎及孵化幼鱼畸形；畸形率(％)＝畸形胚胎及畸形孵化幼鱼数量/胚胎总数×100％；
(3)孵化率：每天8:00-9:00使用显微镜观察记录所有胚胎的孵化情况；将幼鱼完全出壳视为孵化成功，没有完全出壳视为孵化失败；孵化率(％)＝孵化成功数量/胚胎总数×100％；
(4)孵化时间：将每组胚胎全部孵化所用的时间记为孵化时间；
(5)将得到的实验结果进行处理；
结果显示：将对照组和实验组中包含青鳉鱼胚胎或幼鱼的死亡率、畸形率、孵化率和孵化时间的个体水平生物标志物测定结果制成表格；
步骤二中的分子水平生物标志物测定方法如下：
(1)总RNA提取：在对照组和实验组中随机抽取6个胚胎或6条孵化幼鱼分别置于2mL离心管中，加入1mL的RNA抽提试剂Trizol用电动匀浆器匀浆5min，置于冰上静置10min，在4℃和12000r/min条件下离心10min，吸取800μL上清液，移入1.5mL离心管中；向1.5mL离心管中加入200μL氯仿，使用旋涡震荡仪旋涡震荡15s，置于冰上静置15min，在4℃和12000r/min下离心15min，吸取500μL上清液，移入新的1.5mL离心管中；向新的1.5mL离心管中加入500μL异丙醇，密封离心管后上下颠倒震荡5次，置于冰上静置10min，在4℃和12000r/min条件下离心10min，弃去上清液；加入1mL 4℃的75％乙醇洗涤沉淀，在4℃和12000r/min条件下离心5min，弃去上清液；将离心管在室温下静置5min，加入30μL DEPC水溶解总RNA沉淀；取1μL总RNA样品，用分光光度计测定260nm和280nm波长下的OD值，即OD260和OD280；RNA纯度通过Ratio＝OD260/OD280判断；当1.8≤Ratio≤2.0时，代表所提取的总RNA纯度较好；当Ratio<1.8时，代表蛋白质等其他有机物质的污染较为严重；当Ratio>2.0时，代表所提取的总RNA有所水解；
(2)总RNA反转录合成cDNA：利用上述提取的1.8≤Ratio≤2.0的总RNA为模板，通过反转录合成cDNA；将2.0μL的缓冲液5×Fast RT Buffer、0.5μL的逆转录酶RT EnzymeMix、0.5μL的寡核苷酸FQ-RT Primer、6.0μL的无核苷酸水RNase Free dH2O和1.0μL总RNA同时加入到含有RNA酶和DNA酶的200μL离心管中，置于96梯度PCR仪上依次于37℃孵育15min、98℃孵育5min、95℃孵育1min，反应结束后放入-80℃冰箱中保存待测；
(3)配制反应体系：根据SuperReal PreMix Plus试剂盒说明书配制实时荧光定量PCR反应体系，按照顺序依次将0.6μL正向引物β-actin：TGGCTTCTGCTCTGTATGGC；BMP2：GGGACTCGGTACTCCACACG；BMP4：ACACGTCCGCATCAGCCGTTCCTT、0.6μL反向引物β-actin：CCCTGTTAGACAACTACCTCCCT；BMP2：TTGGTGGCGTTGAGGTGGTC；BMP4：TGCGTTTCGTCCGGCGAGTCAAT、1.0μL cDNA、7.4μL的无核苷酸水RNase Free dH2O、10μL的NDA聚合酶2×SuperReal PreMix Plus和0.4μL的荧光定量PCR参比染料50×ROX ReferenceDye在冰上加入荧光定量八连管中，离心使反应体系全部沉降在管底；
(4)PCR扩增和荧光定量：将离心后的荧光定量八连管放入荧光定量PCR仪中的96孔板上，首先在95℃条件下进行15min预变性，然后循环40次三步法PCR扩增程序，每次循环均是在95℃下变性10sec，60℃下退火20sec，72℃下延伸32sec；每次循环结束时采集荧光信号；以循环数为横坐标，以每次循环结束时采集的荧光信号为纵坐标，得到对照组、实验组中青鳉鱼胚胎或幼鱼的β-actin基因、BMP2基因和BMP4基因的扩增曲线；
(5)将得到的实验结果进行处理：
使用荧光定量PCR仪配备的数据处理软件处理对照组、实验组中青鳉鱼胚胎或幼鱼的β-actin基因、BMP2基因和BMP4基因的扩增曲线；
依次点击数据处理软件中的Analysis→Analysis Settings→Ct Settings，将CtSettings模块中的Algorithm Settings设置为Baseline Threshold，将Ct Settings模块中的Default Ct Settings设置为Automatic Threshold，设置完成后，数据处理软件自动处理对照组和实验组中青鳉鱼胚胎或幼鱼的β-actin基因、BMP2基因和BMP4基因的扩增曲线，计算得到对照组中青鳉鱼胚胎或幼鱼的β-actin基因、BMP2基因和BMP4基因的阈值循环数Ctβ-actin对照、CtBMP2对照、CtBMP4对照；计算得到实验组中青鳉鱼胚胎或幼鱼的β-actin基因、BMP2基因和BMP4基因的阈值循环数Ctβ-actin实验组、CtBMP2实验组、CtBMP4实验组；将对照组和实验组中包含青鳉鱼胚胎或幼鱼的BMP2基因和BMP4基因的Ct测定结果制成表格；
对照组的BMP2基因和BMP4基因阈值循环数CtBMP2对照和CtBMP4对照减去对照组的β-actin基因阈值循环数Ctβ-actin对照得到对照组的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2对照和ΔCtBMP4对照；实验组的BMP2和BMP4基因阈值循环数CtBMP2实验组和CtBMP4实验组减去实验组的β-actin基因阈值循环数Ctβ-actin实验组得到实验组的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2实验组和ΔCtBMP4实验组；将对照组和实验组中包含青鳉鱼胚胎或幼鱼的BMP2基因和BMP4基因的ΔCt测定结果制成表格；
对照组的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2对照、ΔCtBMP4对照减去对照组的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2对照、ΔCtBMP4对照得到对照组的BMP2基因和BMP4基因的ΔΔCtBMP2对照、ΔΔCtBMP4对照，实验组的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2实验组和ΔCtBMP4实验组减去对照组的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2对照和ΔCtBMP4对照得到实验组的BMP2基因和BMP4基因的ΔΔCtBMP2实验组和ΔΔCtBMP4实验组，将对照组和实验组中包含青鳉鱼胚胎或幼鱼的BMP2基因和BMP4基因的ΔΔCt测定结果制成表格；
将对照组的BMP2基因和BMP4基因的ΔΔCtBMP2对照、ΔΔCtBMP4对照分别代入公式
和
得到对照组的BMP2基因和BMP4基因的表达量；将实验组的BMP2基因和BMP4基因的ΔΔCtBMP2实验组、ΔΔCtBMP4实验组分别代入公式
和
得到实验组的BMP2基因和BMP4基因的表达量；将对照组和实验组中包含青鳉鱼胚胎或幼鱼的BMP2和BMP4基因表达量的分子水平生物标志物测定结果制成表格。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案的有益效果如下：
本发明提供了一种基于青鳉鱼胚胎生物标志物的水质安全诊断方法，通过测定青鳉鱼胚胎个体水平生物标志物和分子水平生物标志物，并将各青鳉鱼胚胎生物标志物量化整合成青鳉鱼胚胎生物标志物响应指数从而更全面、更准确地量化水体污染程度，评价水体质量。与传统以污染物浓度为指标的评价模型相比，该方法可以真实地反映水环境安全状况；与青鳉鱼异常行为特征或单一毒理学数据建立的水质安全诊断模型相比，该方法将多种青鳉鱼胚胎生物标志物同时纳入模型体系，提高了水质生物监测系统的准确率和稳定性，同时基于青鳉鱼胚胎对水体质量更为敏感的特点，该方法能更及时地对水体质量作出准确评价。
附图说明
图1是本发明所述一种基于青鳉鱼胚胎生物标志物的水质安全诊断方法的流程图；
图2是本发明实施例中青鳉鱼胚胎或幼鱼畸形情况的示意图；
图3是本发明实施例中青鳉鱼胚胎或幼鱼的死亡率的示意图；
图4是本发明实施例中青鳉鱼胚胎或幼鱼的畸形率的示意图；
图5是本发明实施例中青鳉鱼胚胎或幼鱼的孵化率的示意图；
图6是本发明实施例中青鳉鱼胚胎或幼鱼的孵化时间的示意图；
图7是本发明实施例中青鳉鱼胚胎或幼鱼的BMP2基因表达量的示意图；
图8是本发明实施例中青鳉鱼胚胎或幼鱼的BMP4基因表达量的示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于青鳉鱼胚胎生物标志物的水质安全诊断方法，下面给出一个具体实施例对本发明做进一步的解释说明。
图1代表了本发明所述一种基于青鳉鱼胚胎生物标志物的水质安全诊断方法的操作流程；
步骤一、青鳉鱼胚胎暴露实验：
在恒温28.0℃条件下，将青鳉鱼受精卵置于6孔细胞培养板进行暴露实验。暴露实验分为对照组、实验组1和实验组2，对照组设置清洁水体，实验组1设置模拟污染水体1，模拟污染水体1的成分为100μg/L的Cu，实验组2设置模拟污染水体2，模拟污染水体2的成分为200μg/L的Cu+20μg/L的Hg，对照组、实验组1和实验组2均设置3个平行实验，每个平行实验中放置20粒青鳉鱼受精卵，每个平行实验中暴露溶液的体积为9mL，暴露期间每天更换6孔细胞培养板内2/3的暴露溶液；
步骤二、测定青鳉鱼胚胎生物标志物：
测定的生物标志物包括青鳉鱼胚胎个体水平生物标志物和分子水平生物标志物；
其中个体水平生物标志物包括死亡率、畸形率、孵化率和孵化时间；
分子水平生物标志物包括BMP2基因和BMP4基因；
1、个体水平生物标志物的测定方法如下：
(1)死亡率：每天8:00-9:00使用显微镜(Nikon eclipse Ts2)观察记录对照组、实验组1和实验组2中胚胎的死亡情况；当胚胎心脏无有节律的震动、卵黄囊外侧及胚胎中后部无体节、胚胎呈白色不透明或灰暗状态或胚胎尾部与卵黄囊未分离，出现以上任意一种情况即判定胚胎死亡；死亡率(％)＝死亡胚胎数量/胚胎总数×100％，其中胚胎总数为20；
(2)畸形率：每天8:00-9:00使用显微镜(Nikon eclipse Ts2)观察记录对照组、实验组1和实验组2中胚胎及孵化幼鱼的畸形情况；实验组1和实验组2中胚胎及孵化幼鱼的畸形情况制成图2；当胚胎及孵化幼鱼出现脊柱弯曲或出现血栓，即判定胚胎及孵化幼鱼畸形；畸形率(％)＝畸形胚胎及畸形孵化幼鱼数量/胚胎总数×100％，其中胚胎总数为20；
(3)孵化率：每天8:00-9:00使用显微镜(Nikon eclipse Ts2)观察记录所有胚胎的孵化情况；将幼鱼完全出壳视为孵化成功，没有完全出壳视为孵化失败；孵化率(％)＝孵化成功数量/胚胎总数×100％，其中胚胎总数为20。
(4)孵化时间：将对照组、实验组1和实验组2中胚胎全部孵化所用的时间分别记为对照组、实验组1和实验组2的孵化时间。
(5)将得到的实验结果进行处理分析。
结果显示：将对照组、实验组1和实验组2中青鳉鱼胚胎或幼鱼的死亡率、畸形率、孵化率和孵化时间分别制成图3、图4、图5和图6；对照组、实验组1和实验组2中包含青鳉鱼胚胎或幼鱼的死亡率、畸形率、孵化率和孵化时间的个体水平生物标志物测定结果见表1；
表1个体水平生物标志物测定结果
| 分组 | 死亡率(％) | 畸形率(％) | 孵化率(％) | 孵化时间(min) |
| 对照组 | 3.33 | 0.00 | 96.67 | 296 |
| 实验组1 | 6.67 | 10.00 | 93.33 | 296 |
| 实验组2 | 20.00 | 35.00 | 80.00 | 288 |
2、分子水平生物标志物测定方法如下：
(1)总RNA提取：在对照组、实验组1或实验组2中随机抽取6个胚胎或6条孵化幼鱼分别置于2mL离心管中，加入1mL的RNA提取试剂Trizol用电动匀浆器(F6/10)匀浆5min，置于冰上静置10min，在4℃和12000r/min条件下离心10min，吸取800μL上清液，移入1.5mL离心管中；向1.5mL离心管中加入200μL氯仿，使用旋涡震荡仪(MIX-28+)旋涡震荡15s，置于冰上静置15min，在4℃和12000r/min下离心15min，吸取500μL上清液，移入新的1.5mL离心管中；向新的1.5mL离心管中加入500μL异丙醇，密封离心管后上下颠倒震荡5次，置于冰上静置10min，在4℃和12000r/min条件下离心10min，弃去上清液；加入1mL 4℃的75％乙醇洗涤沉淀，在4℃和12000r/min条件下离心5min，弃去上清液；将离心管在室温下静置5min，加入30μL DEPC水溶解总RNA沉淀；取1μL总RNA样品，用分光光度计(Epoch)测定260nm和280nm波长下的OD值，即OD260和OD280；RNA纯度通过Ratio＝OD260/OD280判断；当1.8≤Ratio≤2.0时，代表所提取的总RNA纯度较好；当Ratio<1.8时，代表蛋白质等其他有机物质的污染较为严重；当Ratio>2.0时，代表所提取的总RNA有所水解；
(2)总RNA反转录合成cDNA：利用上述提取的1.8≤Ratio≤2.0的总RNA为模板，通过反转录合成cDNA；将2.0μL的缓冲液5×Fast RT Buffer、0.5μL的逆转录酶RT EnzymeMix、0.5μL的寡核苷酸FQ-RT Primer、6.0μL的无核苷酸水RNase Free dH2O和1.0μL总RNA同时加入到含有RNA酶和DNA酶的200μL离心管中，置于96梯度PCR仪(MP60201)上依次于37℃孵育15min、98℃孵育5min、95℃孵育1min，反应结束后放入-80℃冰箱中保存待测；
(3)配制反应体系：根据SuperReal PreMix Plus(SYBR-Green)试剂盒说明书配制实时荧光定量PCR反应体系，按照顺序依次将0.6μL正向引物β-actin：TGGCTTCTGCTCTGTATGGC；BMP2：GGGACTCGGTACTCCACACG；BMP4：ACACGTCCGCATCAGCCGTTCCTT、0.6μL反向引物β-actin：CCCTGTTAGACAACTACCTCCCT；BMP2：TTGGTGGCGTTGAGGTGGTC；BMP4：TGCGTTTCGTCCGGCGAGTCAAT、1.0μL cDNA、7.4μL的无核苷酸水RNase Free dH2O、10μL的DNA聚合酶2×SuperReal PreMix Plus和0.4μL的荧光定量PCR参比染料50×ROX ReferenceDye在冰上加入荧光定量八连管中，离心使反应体系全部沉降在管底；
(4)PCR扩增和荧光定量：将离心后的荧光定量八连管放入荧光定量PCR仪(QuantStudioTM 1)中的96孔板上，首先在95℃条件下进行15min预变性，然后循环40次三步法PCR扩增程序，每次循环均是在95℃下变性10sec，60℃下退火20sec，72℃下延伸32sec；每次循环结束时采集荧光信号；以循环数为横坐标，以每次循环结束时采集的荧光信号为纵坐标，得到对照组、实验组1和实验组2中青鳉鱼胚胎或幼鱼的β-actin基因、BMP2基因和BMP4基因的扩增曲线；
(5)将得到的实验结果进行处理：
使用荧光定量PCR仪(QuantStudioTM 1)配备的QuantStudioTM Design&AnalysisSoftware v1.5.1数据处理软件处理对照组、实验组1和实验组2中青鳉鱼胚胎或幼鱼的β-actin基因、BMP2基因和BMP4基因的扩增曲线；
依次点击QuantStudioTM Design&Analysis Software v1.5.1数据处理软件中的Analysis→Analysis Settings→Ct Settings，将Ct Settings模块中的AlgorithmSettings设置为Baseline Threshold，将Ct Settings模块中的Default Ct Settings设置为Automatic Threshold，设置完成后，QuantStudioTM Design&Analysis Software v1.5.1数据处理软件自动处理对照组、实验组1和实验组2中青鳉鱼胚胎或幼鱼的β-actin基因、BMP2基因和BMP4基因的扩增曲线，计算得到对照组中青鳉鱼胚胎或幼鱼的β-actin基因、BMP2基因和BMP4基因的阈值循环数Ctβ-actin对照、CtBMP2对照、CtBMP4对照；计算得到实验组1中青鳉鱼胚胎或幼鱼的β-actin基因、BMP2基因和BMP4基因的阈值循环数Ctβ-actin实验组1、CtBMP2实验组1、CtBMP4实验组1，计算得到实验组2中青鳉鱼胚胎或幼鱼的β-actin基因、BMP2基因和BMP4基因的阈值循环数Ctβ-actin实验组2、CtBMP2实验组2、CtBMP4实验组2；对照组、实验组1和实验组2中青鳉鱼胚胎或幼鱼的β-actin基因、BMP2基因和BMP4基因的阈值循环数Ctβ-actin对照、CtBMP2对照、CtBMP4对照、Ctβ-actin实验组1、CtBMP2实验组1、CtBMP4实验组1、Ctβ-actin实验组2、CtBMP2实验组2、CtBMP4实验组2的测定结果见表2；
表2 Ct测定结果
| 分组 | β-actin基因 | BMP2基因 | BMP4基因 |
| 对照组 | 20.840 | 25.700 | 19.600 |
| 实验组1 | 21.000 | 25.952 | 20.133 |
| 实验组2 | 22.680 | 26.226 | 20.429 |
对照组的BMP2基因和BMP4基因阈值循环数CtBMP2对照和CtBMP4对照减去对照组的β-actin基因阈值循环数Ctβ-actin对照得到对照组的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2对照和ΔCtBMP4对照；实验组1的BMP2基因和BMP4基因阈值循环数CtBMP2实验组1和CtBMP4实验组1减去实验组1的β-actin基因阈值循环数Ctβ-actin实验组1得到实验组1的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2实验组1和ΔCtBMP4实验组1；实验组2的BMP2基因和BMP4基因阈值循环数CtBMP2实验组2和CtBMP4实验组2减去实验组2的β-actin基因阈值循环数Ctβ-actin实验组2得到实验组2的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2实验组2和ΔCtBMP4实验组2；对照组、实验组1和实验组2的β-actin基因、BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2对照、ΔCtBMP4对照、ΔCtBMP2实验组1、ΔCtBMP4实验组1、ΔCtBMP2实验组2、ΔCtBMP4实验组2的测定结果见表3；
表3 ΔCt测定结果
| 分组 | BMP2基因 | BMP4基因 |
| 对照组 | 4.860 | -1.240 |
| 实验组1 | 4.952 | -0.867 |
| 实验组2 | 3.546 | -2.251 |
对照组的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2对照、ΔCtBMP4对照减去对照组的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2对照、ΔCtBMP4对照得到对照组的BMP2基因和BMP4基因的ΔΔCtBMP2对照、ΔΔCtBMP4对照；实验组1的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2实验组1、ΔCtBMP4实验组1减去对照组的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2对照、ΔCtBMP4对照ΔCt得到实验组1的BMP2基因和BMP4基因的ΔΔCtBMP2实验组1、ΔΔCtBMP4实验组1；实验组2的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2实验组2、ΔCtBMP4实验组2减去对照组的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2对照、ΔCtBMP4对照得到实验组2的BMP2基因和BMP4基因的ΔΔCtBMP2实验组2、ΔΔCtBMP4实验组2；对照组、实验组1和实验组2的BMP2基因和BMP4基因的ΔΔCtBMP2对照、ΔΔCtBMP4对照、ΔΔCtBMP2实验组1、ΔΔCtBMP4实验组1、ΔΔCtBMP2实验组2、ΔΔCtBMP4实验组2测定结果见表4；
表4 ΔΔCt测定结果
| 分组 | BMP2基因 | BMP4基因 |
| 对照组 | 0 | 0 |
| 实验组1 | 0.092 | 0.373 |
| 实验组2 | -1.314 | -1.011 |
将对照组的BMP2基因和BMP4基因的ΔΔCtBMP2对照、ΔΔCtBMP4对照分别代入公式
和
得到对照组的BMP2基因和BMP4基因的表达量；将实验组1的BMP2基因和BMP4基因的ΔΔCtBMP2实验组1、ΔΔCtBMP4实验组1分别代入公式
和
得到实验组1的BMP2基因和BMP4基因的表达量；将实验组2的BMP2基因和BMP4基因的ΔΔCtBMP2实验组2、ΔΔCtBMP4实验组2分别代入公式
和
得到实验组2的BMP2基因和BMP4基因的表达量；将对照组、实验组1和实验组2中青鳉鱼胚胎或幼鱼的BMP2基因和BMP4基因表达量分别制成图7和图8；对照组、实验组1和实验组2中包含青鳉鱼胚胎或幼鱼的BMP2和BMP4基因表达量的分子水平生物标志物测定结果见表5；
表5分子水平生物标志物测定结果
| 分组 | BMP2基因 | BMP4基因 |
| 对照组 | 1.00 | 1.00 |
| 实验组1 | 0.94 | 0.77 |
| 实验组2 | 2.49 | 2.02 |
步骤三、生物标志物响应指数：
将青鳉鱼胚胎死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因的表达量进行整合，形成青鳉鱼胚胎生物标志物响应指数；
青鳉鱼胚胎生物标志物响应指数Z的具体计算过程为：将青鳉鱼胚胎死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因分别定义为A、B、C、D、E和F；分别计算青鳉鱼胚胎死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因的偏离度RY，RY＝|PY-QY|/QY，PY表示实验组1或实验组2中青鳉鱼胚胎死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因或BMP4基因的测定结果，QY表示对照组中青鳉鱼胚胎死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因或BMP4基因的测定结果，Y＝A，B，C，D，E，F；
根据对照组和实验组1的青鳉鱼胚胎死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因的测定结果，实验组1的死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因的偏离度RY计算结果如下：
实验组1的死亡率的偏离度RA为100.30％；
实验组1的畸形率的偏离度RB为正无穷；
实验组1的孵化率的偏离度RC为3.46％；
实验组1的孵化时间的偏离度RD为0.00％；
实验组1的BMP2基因的偏离度RE为6.00％；
实验组1的BMP4基因的偏离度RF为23.00％；
根据对照组和实验组2的青鳉鱼胚胎死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因的测定结果，实验组2的死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因的偏离度RY计算结果如下：
实验组2的死亡率的偏离度RA为500.60％；
实验组2的畸形率的偏离度RB为正无穷；
实验组2的孵化率的偏离度RC为17.24％；
实验组2的孵化时间的偏离度RD为2.70％；
实验组2的BMP2基因的偏离度RE为149.00％；
实验组2的BMP4基因的偏离度RF为102.00％；
根据实验组1和实验组2中死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因的偏离度RY分别为实验组1和实验组2中死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因赋予指定值SY，Y＝A，B，C，D，E，F；
当RY≤20％时，生物标志物的指定值SY设置为4；
当20％<RY≤50％时，生物标志物的指定值SY设置为3；
当50％<RY≤100％时，生物标志物的指定值SY设置为2；
当RY>100％时，生物标志物的指定值SY设置为1；
实验组1的死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因的指定值SY设置情况如下：
实验组1的死亡率的偏离度RA为100.30％，实验组1的死亡率的指定值SA设置为1；
实验组1的畸形率的偏离度RB为正无穷，实验组1的畸形率的指定值SB设置为1；
实验组1的孵化率的偏离度RC为3.46％，实验组1的孵化率的指定值SC设置为4；
实验组1的孵化时间的偏离度RD为0.00％，实验组1的孵化时间的指定值SD设置为4；
实验组1的BMP2基因的偏离度RE为6.00％，实验组1的BMP2基因的指定值SE设置为3；
实验组1的BMP4基因的偏离度RF为23.00％，实验组1的BMP4基因的指定值SF设置为3；
实验组2的死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因的指定值SY设置情况如下：
实验组2的死亡率的偏离度RA为500.60％，实验组2的死亡率的指定值SA设置为1；
实验组2的畸形率的偏离度RB为正无穷，实验组2的畸形率的指定值SB设置为1；
实验组2的孵化率的偏离度RC为17.24％，实验组2的孵化率的指定值SC设置为4；
实验组2的孵化时间的偏离度RD为2.70％，实验组2的孵化时间的指定值SD设置为4；
实验组2的BMP2基因的偏离度RE为149.00％，实验组2的BMP2基因的指定值SE设置为1；
实验组2的BMP4基因的偏离度RF为102.00％，实验组2的BMP4基因的指定值SF设置为1；
根据死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因所处的层级分别为死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因赋予权重WY，Y＝A，B，C，D，E，F；
实验组1和实验组2死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因的权重WY设置情况如下：
实验组1和实验组2的死亡率的权重WA设置为3.0；
实验组1和实验组2的畸形率的权重WB设置为2.4；
实验组1和实验组2的孵化率的权重WC设置为2.4；
实验组1和实验组2的孵化时间的权重WD设置为2.4；
实验组1和实验组2的BMP2基因的权重WE设置为1.9；
实验组1和实验组2的BMP4基因的权重WF设置为1.9；
将实验组1的死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因的指定值SA、SB、SC、SD、SE、SF和权重WA、WB、WC、WD、WE、WF全部代入Z＝∑SYWY/∑WY，其中Y＝A，B，C，D，E，，计算得到实验组1的生物标志物响应指数Z；将实验组2的死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因的指定值SA、SB、SC、SD、SE、SF和权重WA、WB、WC、WD、WE、WF全部代入Z＝∑SYWY/∑WY，其中Y＝A，B，C，D，E，，计算得到实验组2的生物标志物响应指数Z；
步骤四：根据实验组1和实验组2的生物标志物响应指数Z确定实验组1和实验组2水体的生物胁迫等级和水体污染程度；
当3.00<Z≤4.00时，表明水体对青鳉鱼胚胎或幼鱼无胁迫或轻度胁迫；
当2.75<Z≤3.00时，表明水体对青鳉鱼胚胎或幼鱼中等胁迫；
当2.50<Z≤2.75时，表明水体对青鳉鱼胚胎或幼鱼较大胁迫；
当0.00≤Z≤2.50时，表明水体对青鳉鱼胚胎或幼鱼严重胁迫；
计算结果：本实施例中，实验组1的生物标志物响应指数Z为2.71，实验组2的生物标志物响应指数Z为2.03；这表明实验组1的模拟污染水体1对青鳉鱼胚胎或幼鱼具有较大胁迫；实验组2的模拟污染水体2对青鳉鱼胚胎或幼鱼具有严重胁迫；可见，本实施例中两组模拟污染水体暴露实验可以很好的反映青鳉鱼胚胎或幼鱼所受到的损伤，而且青鳉鱼胚胎或幼鱼的生物标志物与污染物的浓度和种类存在较好的剂量-效应关系，这意味着本发明提供的方法能够更全面、更准确地量化水体污染程度，评价水体质量，提高水质生物监测系统的准确率和稳定性。
Claims (4)
1.一种基于青鳉鱼胚胎生物标志物的水质安全诊断方法，通过测定水体暴露下青鳉鱼胚胎的多种生物标志物，并将各生物标志物量化整合成青鳉鱼胚胎生物标志物响应指数以量化水体污染程度，准确评价水体质量，其特征在于，本方法具体步骤如下：
步骤一、青鳉鱼胚胎暴露实验：
在恒温28.0±0.1℃的条件下，将青鳉鱼受精卵置于一个半静态装置内进行暴露实验，暴露实验分为对照组和实验组，对照组设置清洁水体，实验组设置待测水体，每组设置m个平行实验，其中m≥3，每个平行实验中放置n粒青鳉鱼受精卵，其中n≥20，每个平行实验中暴露溶液的体积至少为半静态装置容积的1/2，暴露期间每天更换装置内至少2/3的暴露溶液；
步骤二、测定青鳉鱼胚胎生物标志物：
测定的生物标志物包括青鳉鱼胚胎个体水平生物标志物和分子水平生物标志物；
其中个体水平生物标志物包括死亡率、畸形率、孵化率和孵化时间；
分子水平生物标志物包括BMP2基因和BMP4基因；
1、个体水平生物标志物的测定方法如下：
(1)使用显微镜观察记录胚胎的死亡率；
(2)使用显微镜观察记录胚胎的畸形率；
(3)使用显微镜观察记录胚胎的孵化率；
(4)观察记录胚胎的孵化时间；
(5)将得到的实验结果进行处理；
2、分子水平生物标志物测定方法如下：
(1)提取青鳉鱼胚胎或孵化幼鱼的总RNA；
(2)对提取的总RNA进行反转录合成cDNA；
(3)根据试剂盒说明书配制实时荧光定量PCR反应体系；
(4)PCR扩增和荧光定量：进行PCR扩增，得到扩增曲线，并对数据进行处理，进而得到BMP2基因和BMP4基因的表达量；
(5)将得到的实验结果进行处理；
步骤三、生物标志物响应指数：
将青鳉鱼胚胎死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因的表达量进行整合，形成青鳉鱼胚胎生物标志物响应指数；
青鳉鱼胚胎生物标志物响应指数Z的具体计算过程为：将青鳉鱼胚胎死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因分别定义为A、B、C、D、E和F；分别计算青鳉鱼胚胎死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因的偏离度RY，RY＝|PY-QY|/QY，PY表示实验组中青鳉鱼胚胎死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因或BMP4基因的测定结果，QY表示对照组中青鳉鱼胚胎死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因或BMP4基因的测定结果，Y＝A，B，C，D，E，F；
根据实验组中死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因或BMP4基因的偏离度RY分别为实验组中死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因赋予指定值SY，Y＝A，B，C，D，E，F；
当RY≤20％时，生物标志物的指定值SY设置为4；
当20％<RY≤50％时，生物标志物的指定值SY设置为3；
当50％<RY≤100％时，生物标志物的指定值SY设置为2；
当RY>100％时，生物标志物的指定值SY设置为1；
根据死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因所处的层级分别为死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因赋予权重WY，Y＝A，B，C，D，E，F；
死亡率的权重WA设置为3.0；
畸形率的权重WB设置为2.4；
孵化率的权重WC设置为2.4；
孵化时间的权重WD设置为2.4；
BMP2基因的权重WE设置为1.9；
BMP4基因的权重WF设置为1.9；
将实验组的死亡率、畸形率、孵化率、孵化时间、BMP2基因和BMP4基因的指定值SA、SB、SC、SD、SE、SF和权重WA、WB、WC、WD、WE、WF全部代入Z＝∑SYWY/∑WY，其中Y＝A，B，C，D，E，F，计算得到实验组的生物标志物响应指数Z；
步骤四、根据实验组的青鳉鱼胚胎生物标志物响应指数Z确定实验组水体的生物胁迫等级和水体污染程度；
当3.00<Z≤4.00时，表明水体对青鳉鱼胚胎或幼鱼无胁迫或轻度胁迫；
当2.75<Z≤3.00时，表明水体对青鳉鱼胚胎或幼鱼中等胁迫；
当2.50<Z≤2.75时，表明水体对青鳉鱼胚胎或幼鱼较大胁迫；
当0.00≤Z≤2.50时，表明水体对青鳉鱼胚胎或幼鱼严重胁迫。
2.根据权利要求1所述的一种基于青鳉鱼胚胎生物标志物的水质安全诊断方法，其特征在于，步骤一中，实验组设置的待测水体为真实环境中采集的待测污染水体。
3.根据权利要求1所述的一种基于青鳉鱼胚胎生物标志物的水质安全诊断方法，其特征在于，步骤二中的个体水平生物标志物的测定方法如下：
(1)死亡率：每天8:00-9:00使用显微镜观察记录所有胚胎的死亡情况；当胚胎心脏无有节律的震动、卵黄囊外侧及胚胎中后部无体节、胚胎呈白色不透明或灰暗状态或胚胎尾部与卵黄囊未分离，出现以上任意一种情况即判定胚胎死亡；死亡率(％)＝死亡胚胎数量/胚胎总数×100％；
(2)畸形率：每天8:00-9:00使用显微镜观察记录所有胚胎及孵化幼鱼的畸形情况；当胚胎及孵化幼鱼出现脊柱弯曲或出现血栓，即判定胚胎及孵化幼鱼畸形；畸形率(％)＝畸形胚胎及畸形孵化幼鱼数量/胚胎总数×100％；
(3)孵化率：每天8:00-9:00使用显微镜观察记录所有胚胎的孵化情况；将幼鱼完全出壳视为孵化成功，没有完全出壳视为孵化失败；孵化率(％)＝孵化成功数量/胚胎总数×100％；
(4)孵化时间：将每组胚胎全部孵化所用的时间记为孵化时间；
(5)将得到的实验结果进行处理；
结果显示：将对照组和实验组中包含青鳉鱼胚胎或幼鱼的死亡率、畸形率、孵化率和孵化时间的个体水平生物标志物测定结果制成表格。
4.根据权利要求1所述的一种基于青鳉鱼胚胎生物标志物的水质安全诊断方法，其特征在于，步骤二中的分子水平生物标志物测定方法如下：
(1)总RNA提取：在对照组和实验组中随机抽取6个胚胎或6条孵化幼鱼分别置于2mL离心管中，加入1mL的RNA抽提试剂Trizol用电动匀浆器匀浆5min，置于冰上静置10min，在4℃和12000r/min条件下离心10min，吸取800μL上清液，移入1.5mL离心管中；向1.5mL离心管中加入200μL氯仿，使用旋涡震荡仪旋涡震荡15s，置于冰上静置15min，在4℃和12000r/min下离心15min，吸取500μL上清液，移入新的1.5mL离心管中；向新的1.5mL离心管中加入500μL异丙醇，密封离心管后上下颠倒震荡5次，置于冰上静置10min，在4℃和12000r/min条件下离心10min，弃去上清液；加入1mL 4℃的75％乙醇洗涤沉淀，在4℃和12000r/min条件下离心5min，弃去上清液；将离心管在室温下静置5min，加入30μL DEPC水溶解总RNA沉淀；取1μL总RNA样品，用分光光度计测定260nm和280nm波长下的OD值，即OD260和OD280；RNA纯度通过Ratio＝OD260/OD280判断；当1.8≤Ratio≤2.0时，代表所提取的总RNA纯度较好；当Ratio<1.8时，代表蛋白质等其他有机物质的污染较为严重；当Ratio>2.0时，代表所提取的总RNA有所水解；
(2)总RNA反转录合成cDNA：利用上述提取的1.8≤Ratio≤2.0的总RNA为模板，通过反转录合成cDNA；将2.0μL的缓冲液5×Fast RT Buffer、0.5μL的逆转录酶RT Enzyme Mix、0.5μL的寡核苷酸FQ-RT Primer、6.0μL的无核苷酸水RNase Free dH2O和1.0μL总RNA同时加入到含有RNA酶和DNA酶的200μL离心管中，置于96梯度PCR仪上依次于37℃孵育15min、98℃孵育5min、95℃孵育1min，反应结束后放入-80℃冰箱中保存待测；
(3)配制反应体系：根据SuperReal PreMix Plus试剂盒说明书配制实时荧光定量PCR反应体系，按照顺序依次将0.6μL正向引物β-actin：TGGCTTCTGCTCTGTATGGC；BMP2：GGGACTCGGTACTCCACACG；BMP4：ACACGTCCGCATCAGCCGTTCCTT、0.6μL反向引物β-actin：CCCTGTTAGACAACTACCTCCCT；BMP2：TTGGTGGCGTTGAGGTGGTC；BMP4：TGCGTTTCGTCCGGCGAGTCAAT、1.0μL cDNA、7.4μL的无核苷酸水RNase Free dH2O、10μL的NDA聚合酶2×SuperReal PreMix Plus和0.4μL的荧光定量PCR参比染料50×ROX ReferenceDye在冰上加入荧光定量八连管中，离心使反应体系全部沉降在管底；
(4)PCR扩增和荧光定量：将离心后的荧光定量八连管放入荧光定量PCR仪中的96孔板上，首先在95℃条件下进行15min预变性，然后循环40次三步法PCR扩增程序，每次循环均是在95℃下变性10sec，60℃下退火20sec，72℃下延伸32sec；每次循环结束时采集荧光信号；以循环数为横坐标，以每次循环结束时采集的荧光信号为纵坐标，得到对照组、实验组中青鳉鱼胚胎或幼鱼的β-actin基因、BMP2基因和BMP4基因的扩增曲线；
(5)将得到的实验结果进行处理：
使用荧光定量PCR仪配备的数据处理软件处理对照组、实验组中青鳉鱼胚胎或幼鱼的β-actin基因、BMP2基因和BMP4基因的扩增曲线；
依次点击数据处理软件中的Analysis→Analysis Settings→Ct Settings，将CtSettings模块中的Algorithm Settings设置为Baseline Threshold，将Ct Settings模块中的Default Ct Settings设置为Automatic Threshold，设置完成后，数据处理软件自动处理对照组和实验组中青鳉鱼胚胎或幼鱼的β-actin基因、BMP2基因和BMP4基因的扩增曲线，计算得到对照组中青鳉鱼胚胎或幼鱼的β-actin基因、BMP2基因和BMP4基因的阈值循环数Ctβ-actin对照、CtBMP2对照、CtBMP4对照；计算得到实验组中青鳉鱼胚胎或幼鱼的β-actin基因、BMP2基因和BMP4基因的阈值循环数Ctβ-actin实验组、CtBMP2实验组、CtBMP4实验组；将对照组和实验组中包含青鳉鱼胚胎或幼鱼的BMP2基因和BMP4基因的Ct测定结果制成表格；
对照组的BMP2基因和BMP4基因阈值循环数CtBMP2对照和CtBMP4对照减去对照组的β-actin基因阈值循环数Ctβ-actin对照得到对照组的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2对照和ΔCtBMP4对照；实验组的BMP2和BMP4基因阈值循环数CtBMP2实验组和CtBMP4实验组减去实验组的β-actin基因阈值循环数Ctβ-actin实验组得到实验组的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2实验组和ΔCtBMP4实验组；将对照组和实验组中包含青鳉鱼胚胎或幼鱼的BMP2基因和BMP4基因的ΔCt测定结果制成表格；
对照组的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2对照、ΔCtBMP4对照减去对照组的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2对照、ΔCtBMP4对照得到对照组的BMP2基因和BMP4基因的ΔΔCtBMP2对照、ΔΔCtBMP4对照，实验组的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2实验组和ΔCtBMP4实验组减去对照组的BMP2基因和BMP4基因的差异阈值循环数ΔCtBMP2对照和ΔCtBMP4对照得到实验组的BMP2基因和BMP4基因的ΔΔCtBMP2实验组和ΔΔCtBMP4实验组，将对照组和实验组中包含青鳉鱼胚胎或幼鱼的BMP2基因和BMP4基因的ΔΔCt测定结果制成表格；
将对照组的BMP2基因和BMP4基因的ΔΔCtBMP2对照、ΔΔCtBMP4对照分别代入公式
和
得到对照组的BMP2基因和BMP4基因的表达量；将实验组的BMP2基因和BMP4基因的ΔΔCtBMP2实验组、ΔΔCtBMP4实验组分别代入公式
和
得到实验组的BMP2基因和BMP4基因的表达量；将对照组和实验组中包含青鳉鱼胚胎或幼鱼的BMP2和BMP4基因表达量的分子水平生物标志物测定结果制成表格。
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| CN202211416713.7A CN115747343A (zh) | 2022-11-14 | 2022-11-14 | 一种基于青鳉鱼胚胎生物标志物的水质安全诊断方法 |
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| CN101982072A (zh) * | 2010-10-11 | 2011-03-02 | 上海市环境科学研究院 | 环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法 |
| CN102175829A (zh) * | 2011-01-20 | 2011-09-07 | 济南市供排水监测中心 | 采用生物鱼毒性试验检测水质毒性的方法 |
| CN111544604A (zh) * | 2020-06-02 | 2020-08-18 | 闽江学院 | 一种利用海水青鱂幼鱼评价化合物神经毒性的方法 |
| CN113804524A (zh) * | 2021-08-30 | 2021-12-17 | 北京大学 | 一种基于中国青鳉的化学品毒性高内涵快速筛查方法 |
-
2022
- 2022-11-14 CN CN202211416713.7A patent/CN115747343A/zh active Pending
Patent Citations (4)
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