CN105309387A - 一种筛选抗衰老药物的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筛选抗衰老药物的试剂盒及其使用方法，属于生物检测技术领域。本发明提供的筛选抗衰老药物的试剂盒包括秀丽隐杆线虫、NGM培养基、大肠杆菌OP50、氟脲苷、无菌水，能够用于筛选抗衰老药物。此外，本发明使用特殊结构的秀丽隐杆线虫专用培养皿，省去了秀丽隐杆线虫培养过程中因为NGM培养基损耗带来的转板过程，避免因为频繁转板使秀丽隐杆线虫受到机械损伤造成非自然死亡，进而影响寿命分析实验结果的问题。同时，减少培养过程中大肠杆菌OP50和无菌水的添加频率，简化培养过程，节约成本，方便操作，适合在筛选抗衰老药物的领域大规模推广。

Description

一种筛选抗衰老药物的试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及一种筛选抗衰老药物的试剂盒及其使用方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

21世纪是人口老龄化的世纪，人口老龄化将带来一系列非常严重的医学和社会问题^[1]，面对庞大的老年群体，要从根本上提高他们的生存质量，就要找到改善身体机能、延缓衰老的方法。从中医药和化合物库中筛选和开发可预防及治疗衰老相关疾病、延长寿命的安全有效的抗衰老药物，逐渐成为今后我国新药研制的热点。

学界认为衰老机制在生物之间是进化保守的，现阶段国内外抗衰老药物筛选选用的模型主要有细胞、果蝇、线虫、斑马鱼、小鼠和大鼠。细胞为模型的药物筛选为体外药物作用研究，效率高但往往相关性差；果蝇的生活模式限制了其在高通量药物筛选中的应用；斑马鱼在衰老方面由于培养条件和发育时间的问题应用有所限制^[2]；鼠类的建模实验操作技术要求高且因其培养条件高和寿命周期长导致筛选效率低、研究成本高昂^[3]。而秀丽隐杆线虫培养条件简单，可以在琼脂板上或是液体培养基中取食细菌（E.coli）；世代周期短，通常为3天左右；寿命短，通常为3周左右；秀丽隐杆线虫实验群体容易放大，而且可以大量获得同步化（生长时期处于同一阶段）的秀丽隐杆线虫。秀丽隐杆线虫因为寿命周期短和容易实现高通量的优势，成为衰老研究的理想模型^[4]。但是现阶段，尚未出现基于上述秀丽隐杆线虫模型的筛选抗衰老药物的试剂盒，供本领域研发人员高效准确地筛选抗衰老药物。

对此，本发明特提供一种筛选抗衰老药物的试剂盒，使用该试剂盒能够快速准确地筛选抗衰老药物，本发明同时提供上述试剂盒的使用方法。

此外，在筛选化合物的抗衰老药效时，寿命分析实验均采用固体NGM培养基。但是，NGM培养基会随着水分蒸发逐渐干燥，涂在培养基表面的大肠杆菌OP50也会随着秀丽隐杆线虫的取食逐渐消耗殆尽，秀丽隐杆线虫会因失水或饥饿影响其正常寿命。同时，在筛选化合物的抗衰老药效时，研究者在寿命分析实验普遍采用在秀丽隐杆线虫生育期每天转板、生育期结束后2~5天转板一次直至寿命实验的结束^[5，6]，或者每天转板直至秀丽隐杆线虫全部死亡^[7，8]。然而该方法由于频繁转板会对秀丽隐杆线虫，尤其是衰老秀丽隐杆线虫造成机械损伤，导致秀丽隐杆线虫非自然死亡，进而影响寿命。以上缺陷均会给所筛药物的抗衰老药效分析增加影响因素。

并且，频繁转板也会带来其他问题，诸如药物用量大、人工工作量大、容易污染等。

因此，本发明基于上述问题，提供了一种使用特殊结构的秀丽隐杆线虫专用培养皿的试剂盒，省去了秀丽隐杆线虫培养过程中因为NGM培养基损耗带来的转板过程，简化培养过程，节约成本，方便操作，适合在筛选抗衰老药物的领域大规模推广。

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【2】贾熙华,曹诚.秀丽隐杆线虫在医药学领域的应用和进展[J],药学学报,2009,44(7):687.

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【4】OlsenA,VantipalliMC,LithgowGJ.UsingCaenorhabditiselegansasamodelforagingandage-relateddiseases.AnnNYAcadSci,2006,(5):120-8

【5】D.Srivastava,U.Arya,T.SoundaraRajanetal.ReserpinecanconferstresstoleranceandlifespanextensioninthenematodeC.elegans[J],Biogerontology,2008,9:309-316.

【6】AndersOlsen,M.C.Vantipalli,G.J.Lithgow.LifespanextensionofC.elegansfollowingrepeatedmildhormeticheattreatments[J],Biogerontology,2006,7:221-230.

【7】尹大强，于振洋，胡霞林等.用秀丽线虫测定药品与个人护理品的世代毒性的方法.中国.200810207706.X[P].2009-12-25.

【8】于笑坤，何潇潇，付学奇，马俊峰。水溶性人参皂苷对秀丽隐杆线虫生物学功能的影响【J】，吉林大学学报，2012，7，50（4）：812-814.。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选抗衰老药物的试剂盒，使用该试剂盒能够筛选出抗衰老药物。

本发明的另一个目的是提供一种无需转板的筛选抗衰老药物的试剂盒，该试剂盒能够避免因为频繁转板使秀丽隐杆线虫受到机械损伤造成非自然死亡，进而影响寿命分析实验的结果的问题。同时，减少培养过程大肠杆菌OP50和无菌水的添加频率，简化培养过程，节约成本，方便操作。

本发明的另一个目的是提供上述筛选抗衰老药物的试剂盒的使用方法。

本发明提供一种筛选抗衰老药物的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括以下试剂：

①、试剂A：秀丽隐杆线虫；

②、试剂B：NGM培养基；

③、试剂C：大肠杆菌OP50；

④、试剂D：氟脲苷；

⑤、试剂E：无菌水。

其中，所述秀丽隐杆线虫的浓度为100条/20ul，大肠杆菌OP50的浓度为10mg/ml，氟脲苷的浓度为50μM，无菌水的体积为50-100μL。

所述秀丽隐杆线虫为同步化线虫，秀丽隐杆线虫同步化的步骤如下：用M9缓冲液将平板上的秀丽隐杆线虫冲下来，将冲洗液吸入离心管；4000rpm/min离心3min，去除上清；加入裂解液，终浓度：3.2%NaClO和1MNaOH；在涡旋仪上震荡7min，使秀丽隐杆线虫的虫体破裂释放卵；4000rpm/min离心3min，去除上清，收集沉淀获得大量的秀丽隐杆线虫卵；M9缓冲液冲洗两次，加入1mlM9缓冲液，置于20℃培养箱中孵化48小时。

所述试剂盒还含有秀丽隐杆线虫专用培养皿，该培养皿皿盖为环形镂空形状，镂空部位覆盖有封口膜，培养皿中加有NGM培养基。

所述试剂C为含有大肠杆菌OP50活菌的冻干粉或菌液。

本发明还提供上述筛选抗衰老药物的试剂盒的使用方法：

（1）将含有待测药物的溶液与NGM培养基混匀，倒入秀丽隐杆线虫专用培养皿中，制板待用，NGM培养基中含有浓度为50μM的氟脲苷，其中，空白组使用等量无菌水替换含有待测药物的溶液；

（2）将L4期同步化的秀丽隐杆线虫，用铂丝挑针转移到各药物组和空白组的秀丽隐杆线虫专用培养皿中，药物组为含有不同浓度待测药物的NGM培养基，每个药物浓度三个平行，每平行板25~30条秀丽隐杆线虫，置于20°C培养，每天观察并计数秀丽隐杆线虫存活数和死亡数；

（3）一周后培养皿开始干燥，秀丽隐杆线虫开始出现皮肤略显皱缩、状态不活跃、行动略缓，菌斑镜下观察已接近无菌等缺水、缺大肠杆菌OP50表现，此时在无菌超净台中打开皿盖，用移液器加入定量无菌水50-100μL和大肠杆菌OP5020-50μL，10mg/mL；加完后静置，待水和菌皆渗入NGM培养基中将培养基正置，用封口膜封皿，重置20°C培养箱培养；约一周又出现干燥和缺菌状态，重复上述补充水分和菌的操作，补充无菌水需持续到整个寿命实验结束，而补充大肠杆菌OP50视具体情况，25-30条秀丽隐杆线虫约需补充2次；

（4）用挑针轻触，秀丽隐杆线虫无反应则判定为死亡；爬到培养皿边缘或皿盖干死、钻到琼脂里面的秀丽隐杆线虫从实验中排除；

（5）采用相关软件对实验数据进行处理、分析，计算出秀丽隐杆线虫的平均寿命，平均寿命显著高于空白组则证明药物具有抗衰老活性，平均寿命低于或等于空白组则证药物不具有抗衰老活性，以此评价药物的抗衰老活性。

本发明的有益效果：

1、本发明提供一种基于秀丽隐杆线虫模型的筛选抗衰老药物的试剂盒，该试剂盒检测结果准确，使用方法简单，适合在筛选抗衰老药物的领域大规模推广。

2、本发明所述试剂盒使用特殊结构的秀丽隐杆线虫专用培养皿，使用该培养皿能够在减少NGM培养基中水分蒸发的同时，保证秀丽隐杆线虫生存所需的氧气，同时减少无菌水和大肠杆菌OP50的添加频率，补加水以1周为周期，补加菌以1周为周期，重复过程直至寿命实验结束，使培养过程更简便，延长NGM培养基的使用时间。省去了秀丽隐杆线虫培养过程中因为NGM培养基损耗带来的转板过程，避免因为频繁转板使秀丽隐杆线虫受到机械损伤造成非自然死亡，进而影响寿命分析实验结果的问题；同时解决因为频繁转板带来的诸如药物用量大、人工工作量大、容易污染等其他问题。

以下提供具体实施例以实现本发明所述的筛选抗衰老药物的试剂盒，但不限于这些实施例。

具体实施方式

实验生物：

秀丽隐杆线虫早衰模型株系TK22，购买于TheCaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。

秀丽隐杆线虫正常株系N2，购买于TheCaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。

细菌株：尿嘧啶渗漏突变型大肠杆菌OP50，购买于TheCaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。

培养基：

NGM培养基：NaCl1.5g，K₂HPO₄1.3g，KH₂PO₄8.5g，蛋白胨1.4g，琼脂粉8.5g，蒸馏水500mL。灭菌后加入过滤除菌的500μL胆固醇（5mg/ml，无水乙醇配制），高压蒸汽灭菌的500μL1mol/LMgSO₄，500μL1mol/LCaCl_2。

M9缓冲液：NaCl1.98g，Na₂HPO₄2.38g，KH₂PO₄1.20g，MgSO₄0.048g，蒸馏水400mL。

LB液体培养基：NaCl2g，蛋白胨2g，酵母膏1g，蒸馏水200mL。溶解后用1MNaOH调节pH为7.0，高压蒸汽灭菌。

3.药材：

六味地黄丸，十全大补汤，七宝美髯丹，还少丹，生脉散，秦椒丸，天麻丸，二陈丸均购自兰州惠仁堂大药房。

4.仪器：

高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂）

单人单面超净台（苏州净化设备厂）

生化培养箱（宁波江南仪器厂）

隔水式恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）

连续变倍体视显微镜（上海一恒科学仪器有限公司）

离心机（CT15E，日立）

电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）

实施例1试剂盒的装配

本发明所述的一种筛选抗衰老药物的试剂盒，该试剂盒包括以下试剂：

①、试剂A：秀丽隐杆线虫；

②、试剂B：NGM培养基；

③、试剂C：大肠杆菌OP50；

④、试剂D：氟脲苷；

⑤、试剂E：无菌水。

其中，所述试剂C为含有大肠杆菌OP50活菌的冻干粉或菌液。

所述秀丽隐杆线虫的浓度为100条/20ul，大肠杆菌OP50的浓度为10mg/ml，氟脲苷的浓度为50μM，无菌水的体积为50-100μL。

所述试剂盒还含有秀丽隐杆线虫专用培养皿，培养皿皿盖为环形镂空形状，镂空部位覆盖有封口膜，培养皿中加有NGM培养基。

将以上试剂和秀丽隐杆线虫专用培养皿分装于合适的容器中，放置到外包试剂盒中。

本实验中，选取正常株系秀丽隐杆线虫N2，用于筛选对正常株系作用的抗衰老药物，选取早衰模型株系秀丽隐杆线虫TK22，用于筛选对早衰模型株系作用的抗衰老药物。

本领域技术人员可根据具体研究内容，选用类似株系，而不局限于本发明实施例中所述的秀丽隐杆线虫株系。

实施例2秀丽隐杆线虫的同步化

秀丽隐杆线虫同步化的步骤如下：用M9缓冲液将平板上的秀丽隐杆线虫冲下来，将冲洗液吸入离心管；4000rpm/min离心3min，去除上清；加入裂解液，终浓度：3.2%NaClO和1MNaOH；在涡旋仪上震荡7min，使秀丽隐杆线虫的虫体破裂释放卵；4000rpm/min离心3min，去除上清，收集沉淀获得大量的秀丽隐杆线虫卵；M9缓冲液冲洗两次，加入1mlM9缓冲液，置于20℃培养箱中孵化48小时。

实施例3试剂盒的使用

（1）将含有待测药物的溶液与NGM培养基混匀，倒入秀丽隐杆线虫专用培养皿中，制板待用，NGM培养基中含有浓度为50μM的氟脲苷，其中，空白组使用等量无菌水替换含有待测药物的溶液；

（2）将L4期同步化的秀丽隐杆线虫，用铂丝挑针转移到各药物组和空白组的秀丽隐杆线虫专用培养皿中，药物组为含有不同浓度待测药物的NGM培养基，每个药物浓度三个平行，每平行板25~30条秀丽隐杆线虫，置于20°C培养，每天观察并计数秀丽隐杆线虫存活数和死亡数；

（3）一周后培养皿开始干燥，秀丽隐杆线虫开始出现皮肤略显皱缩、状态不活跃、行动略缓，菌斑镜下观察已接近无菌等缺水、缺大肠杆菌OP50表现，此时在无菌超净台中打开皿盖，用移液器加入定量无菌水50-100μL和大肠杆菌OP5020-50μL，10mg/mL；加完后静置，待水和菌皆渗入NGM培养基中将培养基正置，用封口膜封皿，重置20°C培养箱培养；约一周又出现干燥和缺菌状态，重复上述补充水分和菌的操作，补充无菌水需持续到整个寿命实验结束，而补充大肠杆菌OP50视具体情况，25-30条秀丽隐杆线虫约需补充2次；

（4）用挑针轻触，秀丽隐杆线虫无反应则判定为死亡；爬到培养皿边缘或皿盖干死、钻到琼脂里面的秀丽隐杆线虫从实验中排除；

（5）采用相关软件对实验数据进行处理、分析，计算出秀丽隐杆线虫的平均寿命，平均寿命显著高于空白组则证明药物具有抗衰老活性，平均寿命低于或等于空白组则证药物不具有抗衰老活性，以此评价药物的抗衰老活性。

实施例4试剂盒效果验证实验

本试剂盒对所选传统中药复方进行了抗衰老药效筛选的效果验证。

实验步骤：

1.含有待测药物溶液的制备

六味地黄丸，十全大补汤，七宝美髯丹，还少丹，生脉散，秦椒丸，天麻丸，二陈丸

将上述中药用无菌水溶解，滤去杂质，将滤液稀释至各浓度梯度待用。本领域研究人员可根据实验需要，自行调整浓度范围。

2.中药复方的寿命分析实验

具体实验步骤参照实施例3，寿命分析实验结果见表1和表2。

表1所选中药复方对早衰模型株系秀丽隐杆线虫TK22寿命的影响

表2所选中药复方对正常株系秀丽隐杆线虫N2寿命的影响

表1的实验结果表明，所筛选的八个中药复方对早衰模型株系秀丽隐杆线虫TK22平均寿命的影响，相对于空白组，生脉散延寿41.0％，天麻丸延寿26.0％，六味地黄丸延寿23.3％，秦椒丸延寿18.6％，七宝美髯丹延寿15.8％，十全大补汤延寿13.1％，还少丹延寿10.4％，具有显著性差异(P<0.05)。

中药复方处理正常株系秀丽隐杆线虫N2的寿命分析实验中选取的药物浓度是表1实验结果中具有最佳延长早衰模型株系秀丽隐杆线虫TK22寿命的浓度。表2的实验结果表明，相对于空白组，生脉散延寿47.3%、还少丹延寿38.3%、二陈丸延寿21.8%、十全大补汤延寿14.5%、六味地黄丸延寿12.7%，具有显著性差异（P<0.05）。

由表1和表2的数据结果可以得出，使用本发明公开的试剂盒对中药复方进行检测，其抗衰老效果的预计结果与古方结论一致。由此证明本发明的试剂盒可以被用于筛选抗衰老药物，且结果准确，使用方法简便，易于掌握。

综上所述，本发明所述筛选抗衰老药物的试剂盒能够用于筛选抗衰老药物。此外，该试剂盒还省去了秀丽隐杆线虫培养过程中因为NGM培养基损耗带来的转板过程，避免因为频繁转板使秀丽隐杆线虫受到机械损伤造成非自然死亡，进而影响寿命分析实验的结果的问题，减少培养过程大肠杆菌OP50和无菌水的添加频率，简化培养过程，节约成本，方便操作，适合在筛选抗衰老药物领域大规模推广。

Claims (6)

1.一种筛选抗衰老药物的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括以下试剂：

①、试剂A：秀丽隐杆线虫；

②、试剂B：NGM培养基；

③、试剂C：大肠杆菌OP50；

④、试剂D：氟脲苷；

⑤、试剂E：无菌水。

2.根据权利要求1所述的一种筛选抗衰老药物的试剂盒，其特征在于，所述秀丽隐杆线虫的浓度为100条/20ul，大肠杆菌OP50的浓度为10mg/ml，氟脲苷的浓度为50μM，无菌水的体积为50-100μL。

3.根据权利要求1所述的一种筛选抗衰老药物的试剂盒，其特征在于，所述秀丽隐杆线虫为同步化线虫，秀丽隐杆线虫同步化的步骤如下：用M9缓冲液将平板上的秀丽隐杆线虫冲下来，将冲洗液吸入离心管；4000rpm/min离心3min，去除上清；加入裂解液，终浓度：3.2%NaClO和1MNaOH；在涡旋仪上震荡7min，使秀丽隐杆线虫的虫体破裂释放卵；4000rpm/min离心3min，去除上清，收集沉淀获得大量的秀丽隐杆线虫卵；M9缓冲液冲洗两次，加入1mlM9缓冲液，置于20℃培养箱中孵化48小时。

4.根据权利要求1所述的一种筛选抗衰老药物的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有秀丽隐杆线虫专用培养皿，该培养皿皿盖为环形镂空形状，镂空部位覆盖有封口膜，培养皿中加有NGM培养基。

5.根据权利要求1所述的一种筛选抗衰老药物的试剂盒，其特征在于：所述试剂C为含有大肠杆菌OP50活菌的冻干粉或菌液。

6.一种筛选抗衰老药物的试剂盒的使用方法，其特征在于，如权利要求1所述的试剂盒的使用方法如下：

（1）将含有待测药物的溶液与NGM培养基混匀，倒入秀丽隐杆线虫专用培养皿中，制板待用，NGM培养基中含有浓度为50μM的氟脲苷，其中，空白组使用等量无菌水替换含有待测药物的溶液；

（2）将L4期同步化的秀丽隐杆线虫，用铂丝挑针转移到各药物组和空白组的秀丽隐杆线虫专用培养皿中，药物组为含有不同浓度待测药物的NGM培养基，每个药物浓度三个平行，每平行板25~30条秀丽隐杆线虫，置于20°C培养，每天观察并计数秀丽隐杆线虫存活数和死亡数；

（3）一周后培养皿开始干燥，秀丽隐杆线虫开始出现皮肤略显皱缩、状态不活跃、行动略缓，菌斑镜下观察已接近无菌等缺水、缺大肠杆菌OP50表现，此时在无菌超净台中打开皿盖，用移液器加入定量无菌水50-100μL和大肠杆菌OP5020-50μL，10mg/mL；加完后静置，待水和菌皆渗入NGM培养基中将培养基正置，用封口膜封皿，重置20°C培养箱培养；约一周又出现干燥和缺菌状态，重复上述补充水分和菌的操作，补充无菌水需持续到整个寿命实验结束，而补充大肠杆菌OP50视具体情况，25-30条秀丽隐杆线虫约需补充2次；

（4）用挑针轻触，秀丽隐杆线虫无反应则判定为死亡；爬到培养皿边缘或皿盖干死、钻到琼脂里面的秀丽隐杆线虫从实验中排除；

（5）采用相关软件对实验数据进行处理、分析，计算出秀丽隐杆线虫的平均寿命，平均寿命显著高于空白组则证明药物具有抗衰老活性，平均寿命低于或等于空白组则证药物不具有抗衰老活性，以此评价药物的抗衰老活性。