CN1305588A - 有生命的线虫体内程序性死亡细胞的检测 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过将有生命的线虫暴露在染色程序性死亡细胞的活体染料中,检测程序性死亡细胞,在有生命的线虫体内检测程序性死亡细胞的方法和工具。对这种检测方法的应用包括确定调节程序性细胞死亡的试剂,条件或基因的方法。本发明还包括筛查表现出改变的程序性细胞死亡的突变线虫的方法。
Description
相关申请
本申请要求1998年6月19日提交的编号60/090,057临时申请的权益,该临时申请的内容通过在此引述而合并于本文。
本发明的背景
细胞程序性死亡是指涉及细胞的程序性死亡的细胞过程。细胞死亡是动物发育的重要组成部分。如程序性细胞死亡可协助形成身体的各部分,形成腔或分离出足趾和手指[参见Raff,Martin,自然,396:119-122,119(1998)]。细胞程序性死亡也出现在多种疾病状况中,如在受到心脏病或中风影响的细胞中。急性损伤导致坏死性细胞死亡,但较少受到损伤的细胞会进行程序性细胞死亡。同样地,某些神经退形性变疾病,癌症,或由病毒引起的疾病会涉及细胞程序性死亡途径。
能在活体内筛查调节细胞程序性死亡的条件或试剂的检测将显著地推进对这些疾病的治疗。在有生命的生物体内研究试剂或条件的作用可提供如何使用试剂或条件更精确的描绘。因此,存在一种需要能在有生命的生物体内快速并有效地筛查细胞程序性死亡调节试剂或条件的检测方法。
本发明的概述
本发明涉及在有生命的线虫体内确定存在或不存在一种或多种程序性死亡细胞的方法,包括将有生命的线虫(如Caenorhabditis elegans)与活体染料接触在线虫体内染色程序性死亡细胞;检测存在或不存在被染料染色的程序性死亡细胞。线虫较好的是成年的。使用在本方法中的活体染料可以是任何活体染料,包括吖啶橙或SYTO染料(如SYTO12)。程序性死亡细胞可视觉检测。
本发明的另一个实施方案涉及在有生命的线虫(如Caenorhabditis elegans)体内确定试剂或条件对细胞程序性死亡的影响,包括将有生命的线虫暴露在要检测的试剂中或条件下;将线虫与活体染料接触以染色线虫体内的程序性死亡细胞;检测存在或不存在被染料染色的程序性死亡细胞。线虫较好的是成年的。使用在本方法中的活体染料可以是任何活体染料,包括吖啶橙或SYTO染料(如SYTO12)。程序性死亡细胞可视觉检测。方法可进一步包括确定程序性死亡细胞的量和与对照物的比较。与对照物比较,程序性死亡细胞的量增加,说明试剂或条件诱导细胞程序性死亡。与对照物比较,程序性死亡细胞的量减少,说明试剂或条件抑制细胞程序性死亡。本发明还包括调节细胞程序性死亡的试剂,如由本文所描述的方法所确定的。
本发明还包括在有生命的线虫(如Caenorhabditis elegans)体内确定要测试的至少一种基因表达的程序性细胞死亡作用的方法,其中在基因的至少一个区域制成突变,包括将有生命的线虫与活体染料接触以染色线虫体内的程序性死亡细胞,检测存在或不存在被染料染色的程序性死亡细胞。方法进一步包括确定程序性死亡细胞的量并与对照物相比较。与对照物相比,程序性死亡细胞量的增加或减少,说明基因表达影响细胞程序性死亡。程序性死亡细胞量的增加说明基因的表达增强了细胞程序性死亡。程序性死亡细胞将的减少说明基因的表达抑制或减少了细胞程序性死亡。本发明还包括调节细胞程序性死亡的基因,如通过本文所述方法确定的。
本发明涉及在有生命的线虫体内确定存在或不存在程序性死亡细胞的方法,包括提供已用改变线虫对辐射的敏感性的诱变剂处理的线虫;将有生命的线虫与活体染料接触以染色线虫体内的程序性死亡细胞;检测在有生命的线虫体内存在或不存在被染料染色的程序性死亡细胞。该方法包括将线虫暴露在要测试的试剂中或条件下。
在另一个实施方案中,本发明涉及确定含有经历了改变的程序性细胞死亡的细胞的、突变的有生命的生物体的方法,包括将生物体与调节细胞程序性死亡的试剂或条件接触,从而产生突变的有生命的生物体;将突变生物体与活体染料接触以染色生物体内的程序性死亡细胞;检测有生命的突变的生物体内存在或不存在被染料染色的程序性死亡细胞;选取含有经历了改变的程序性细胞死亡的细胞的突变生物体,与对照物相比。与对照物相比,突变体可以是对辐射有更强或更弱的敏感性。本发明包括突变的线虫,如依据这种方法确定的。
本发明还涉及包括至少一种线虫(如Caenorhabditiselegans),以及活体染料(如,吖啶橙或SYTO染料)的试剂盒。线虫可以是突变的,这样线虫对诱导程序性细胞死亡的辐射是敏感的或是不敏感的。
附图简述
图1是成年雌雄同体种系图。
图2A是对野生,ced-3,ced-4,rad-5,ced-9(gf)和egl-1(1f)线虫辐射后0,1 2,24,和36小时生殖细胞的程序性细胞死亡量的图示。
图2B是对rad-5突变体和野生(WT)辐射(0Gy和120Gy)后1-8小时生殖细胞死亡的图示。
图2C是野生线虫,rad-5突变体,ced-3突变体和ced-4突变体暴露在0-5mM的N-亚硝基-N-乙脲后生殖细胞死亡的图示。
图3示意了分离信号途径加入到核心细胞程序性死亡方式中调节Caenorhabditis elegans体细胞死亡,生理学上的生殖细胞死亡和辐射诱导生殖细胞死亡。箭头表示激活;T-形图表示抑制。虚线箭头表示在egl-1(n3082)动物体内部分阻碍辐射诱导细胞死亡。
图4A是用微分干涉相差(DIC)光学仪器直接观察评定生殖细胞死亡的成年雌雄同体的照片。
图4B是用活体染料吖啶橙染色评定生殖细胞死亡的成年雌雄同体的照片。
图5是三维图,显示了用6,12或24kRad的γ辐射照射后28小时的ced-3-n717和野生品系(N2)表现出程序性生殖细胞死亡量的虫子的数量。
图6是三维图,显示了在暴露在5mM和1mM的N-亚硝基-N-乙脲后,处理后28小时的ced-3-n717和野生品系(N2)表现出程序性生殖细胞死亡量的虫子的数量。
图7是三维图,显示了用6,12或24kJ的UV辐射,照射后24小时ced-3-n717和野生品系(N2)表现出程序性生殖细胞死亡量的虫子的数量。
图8是三维图,显示了用1 2或24kRad的γ辐射照射后0,1,2,3,4,5,6,12和24小时的野生品系(N2)程序性生殖细胞死亡的平均数。
图9是通过微分干涉相差(DIC)光学仪器和吖啶橙(AO)确定的,用12kRad的γ辐射后24小时野生品系(N2)程序性死亡生殖细胞的照片。
图10是三维图,显示了用12kRad的γ辐射照射后24或48小时的rad-5和野生品系(N2)表现出程序性生殖细胞死亡量的虫子的数量。
本发明的详细描述
本发明涉及一种筛查影响(如增强或抑制)程序性细胞死亡(如DNA损伤诱导程序性细胞死亡)的试剂、条件或基因的检测方法。具体地,本发明涉及在用进行测试的试剂、条件或基因突变处理的有生命的生物体内检测程序性死亡细胞的方法。
细胞程序性死亡是指涉及细胞的程序性死亡的细胞过程。细胞可能由于多种原因程序性死亡。程序性细胞死亡出现在形成身体的各部分的时候,如形成器官或分离出足趾和手指。程序性细胞死亡也出现在消除曾经有一定作用但不再需要的结构的时候,如现在是青蛙的蝌蚪的尾巴[参见Raff,Martin,自然,396:119-122,119(1998)]。
程序性细胞死亡也发生在细胞暴露在应激条件下时,如辐射,紫外线(UV),毒性药物等等。这样的应激作用能对细胞的DNA造成损伤,致使产生程序性细胞死亡的级联事件。经历程序性死亡的细胞缩小并在细胞的内容物溢出前被邻近的细胞吞没。暴露在剧烈应激条件下的细胞可能经历导致细胞肿胀并爆裂的坏死性,非计划死亡。爆裂致使细胞内容物溢出到它们的邻近细胞,从而引起损伤炎性反应(同上)。
程序性死亡途径涉及导致细胞死亡的几个事件。在一种途径中,受体,称为“Fas受体”,在程序性死亡的细胞中表达。将Fas配体与Fas受体结合使得受体聚集,蛋白质,称为“procaspases,”彼此裂解激活开始自杀过程。同前。结果,某些基因是表达的或是灭活的。在虫子Caenorhabditis elegans中,基因,ced-3和ced-4是表达的,并激活程序性细胞死亡。其他基因的表达,如ced-9,抑制ced-3和ced-4激活程序性细胞死亡,参看图3。这样,当引发程序性细胞死亡时,ced-9部分或全部被灭活。
损伤细胞DNA的应激作用可诱导程序性细胞死亡。研究DNA损伤诱导程序性细胞死亡途径提供了认识一些疾病如扩增性疾病,神经退行性变疾病,与细胞死亡有关的心脏或脑病况的发展和/或治疗。直到现在,还没有能使人快速有效地筛查大量程序性死亡细胞的检测方法。同样直到现在,还没有能使人在有生命的生物体内(活体)研究DAN损伤诱导程序性细胞死亡过程的程序性细胞死亡检测方法。
本发明可以使人在有生命的生物体内容易地筛查大量程序性死亡细胞。生物体是任何有生命的植物或动物,包括不会受到检测中用来染色程序性死亡细胞的活体染料的毒性,致命影响或作用的线虫(如Caenorhabditis elegans)。具体地,检测包括将有生命的线虫与活体染料接触。活体染料应与有生命的线虫接触足够长的时间以使生物体摄取或吸收染料并染色程序性死亡细胞。程序性死亡细胞可被视觉或荧光检测。可使用荧光显微镜。荧光显微镜发出能使人看到荧光染色细胞的波长的光。另外,也可使用检测荧光染色细胞(如荧光板式读取仪)的工具。将有生命的线虫与活体染料接触然后检测程序性死亡细胞的步骤,本文称为“程序性死亡检测法”或“DNA损伤诱导程序性死亡检测法。”因为程序性死亡细胞被染色,所以它们可方便快速地被确定。具体地,Caenorhabditis elegans是透明的虫子,在虫子是有生命情况下,染色的程序性死亡细胞可在在显微镜下观察到。虫子不需要解剖。因此,检测法可使人在活体系统内有效地研究程序性细胞死亡途径。
使用在这种检测法中的生物体是线虫,具体地是Caenorhabditis elegans。这种检测法在有生命的线虫(如,活着的或没有死去的)中实施,较好的在成年线虫体内实施。在有生命的线虫体内实施检测提供了很有意义的益处,因为检测法提供了程序性细胞死亡,及影响程序性细胞死亡的试剂,条件或基因更精确的描绘。
使用在检测法中的染料是活体染料或可生存染色剂。活体染料是染色有生命细胞的染料。令人惊异地,染料被线虫摄取或吸收后,染料还能染色DNA损伤诱导程序性死亡细胞。目前可获得的或目后发展的活体染料可使用在本检测法中。活体染料的实例是吖啶橙(分子探针,Eugene,OR),锥虫蓝,SYTO染料如SUTO12(分子探针,Eugene,OR)。可使用在本发明中的染料是能被线虫吸收或摄取,对线虫没有毒性,并能染色程序性死亡细胞的染料。活体染料染色程序性死亡细胞比染色活细胞或在背景中存在的染料具有更强的亮度,因为染料更容易渗透有折射力的程序性死亡细胞的膜。
本发明涉及将线虫与活体染料接触足够长的时间以染色存在的程序性死亡细胞。染料的浓度,动力学,缓冲液的量,要染色的虫子的量是影响染料应与虫子接触的时间长度的因素。如用吖啶橙染色细胞,500μL的300μg/毫升AO的M9缓冲液溶液平铺在含150-200只不饿的虫子的板上。这些虫子(线虫)和染色剂在黑暗中温育2小时。将虫子冲洗并置于新鲜的介质或缓冲液中。然后将这些虫子置于显微镜下进行视觉检测。虫子暴露在染料中的时间长度可通过此领域中的技术人员已知的方法确定[参见Sulston,J.E.等人,“涉及线虫Caenorhabditiselegans的方法,”Cold Spring Harbor:CSHL出版社,587-606页(1988)]。
通常经历DNA损伤诱导程序性细胞死亡的细胞是生殖细胞。因此,程序性细胞死亡检测较好地在生殖细胞上实施。然而,程序性死亡体细胞也应用活体染料染色,因为程序性死亡细胞的膜是有折射力的,正如生殖细胞的膜。
在活体染料步骤后,检测染色的程序性死亡细胞。它们也可以通过光源(如荧光显微镜或荧光板式读取仪)在适当的放大倍数下视觉检测细胞来计数或评定。当一次实施几只虫子的筛查时(如试剂影响的初级筛查),可在低倍放大下(如10X-15X放大倍数)观察程序性死亡细胞以获得是否出现更多或更少的程序性细胞死亡的总评估。当计数或评定特异程序性死亡细胞时,可使用较大放大倍数,430X-1000X的放大倍数。
在虫子体内自然进行程序性死亡的细胞,可使用本发明的方法研究。此外,可使用本发明的方法测试并评定多种试剂,条件或基因以确定是否它们诱导程序性细胞死亡。
可进行测试的条件是任何条件包括时间,温度,压力,和各种介质。条件还可以包括暴露在不种类型的光或辐射中,如UV,红外线和γ辐射。虫子可暴露在一种或多种这些条件下,与活体染料接触,如本文所述,然后可以检测程序性死亡细胞。可测试一种或多种条件并与对照物比较。对照物可以是没有暴露在一种或多种条件下的线虫,但与活体染料接触或暴露到活体染料中。没有暴露在一种或多种条件下的虫子中的程序性死亡细胞的量,可以与在暴露在一种或多种条件下的虫子中发现的程序性死亡细胞的量相比。与对照物相比,程序性死亡相比的数量增加,说明条件诱导程序性细胞死亡,而程序性死亡细胞的量减少说明条件抑制或减少程序性细胞死亡。
具体地,γ辐射是一种可以评定其程序性细胞死亡作用的条件。对野生或突变体线虫测试这种条件,如本文所述的。可以测试辐射的量的范围(如在约1到30 kRad之间)和时间。具体地,可以筛查并测试辐射敏感性或不敏感性突变体。在制成突变体后,如本文所述,它们可进行辐射敏感性测试。突变体可暴露在不同量的辐射下,与对照物相比,如暴露在相同辐射量下的野生线虫。然后将突变体和对照物线虫都与活体染料接触,以使染料染色程序性死亡细胞。然后可以检测程序性死亡细胞,如在显微镜下。与对照物相比,突变体内程序性死亡细胞量的增加,说明突变体对辐射敏感或更敏感。与对照物相比,程序性死亡细胞量的减少,说明突变体对辐射不敏感或较不敏感。敏感性或不敏感性的程度可通过将突变体暴露到不同程度的辐射下确定。如为了确定辐射敏感性突变体的敏感性,可将突变体暴露在低辐射量下来评定是否低辐射量(如1.0kRad)能诱导DNA损伤诱导程序性细胞死亡。如果该辐射量不能诱导程序性细胞死亡,那么以递增的方式增加辐射。同样地,辐射不敏感性突变体可暴露在高辐射量(30kRad)下以确定是否高辐射量会诱导DNA损伤诱导程序性细胞死亡。如果该辐射量诱导程序性细胞死亡,那么测试的辐射量可以递减的方式减少。
同样地,可以测试试剂以确定其对程序性细胞死亡的影响。具体地,可进行测试的一类试剂是基因毒性试剂。基因毒性试剂是改变线虫体内细胞核酸的试剂。为了评定或确定调节(增强或减少)程序性细胞死亡的试剂,可将线虫暴露在进行测试的试剂中。暴露的时间长度(如5分钟-12小时)和试剂的浓度可使用此领域中已知的方法确定。可测试不同的时间长度和浓度以确定所需效果的最佳参数。如,试剂N-亚硝基-N-乙脲(ENU)是进行测试的并发现诱导DNA-损伤程序性细胞死亡的试剂。参看实施例5,图6。测试两种不同浓度的这种试剂,5mM和1mM,并与线虫接触4小时。另一种可考虑的因素是进行测试的试剂的动力学,其可能或可能不是已知的。如要进行测试的试剂或者可能被虫子吸收,或者可能被虫子摄取。要测试的药物的动力学可能对暴露虫子的时间长度有影响。在动力学不是已知的情况下,使用程序性细胞死亡检测时可测试并评定一个范围的暴露时间。虫子暴露在试剂中后,然后可实施活体染料和检测步骤,如本文所描述的。确定程序性死亡细胞的量并与对照物相比。一种类型的对照物,称为负对照物,是对没有暴露在试剂中,但进行了检测法的其他步骤(如活体染料和检测步骤)的线虫体内程序性死亡细胞的评定。负对照物可保持在允许程序性细胞死亡出现的条件(如,自然地或诱导地)下。另一种对照物,称为正对照物,是一种其中线虫暴露在试剂中并诱导了程序性细胞死亡的对照物。要测试的试剂可与负对照物对比也可与正对照物对比,以确定试剂诱导或抑制程序性细胞死亡的程度。与负对照物相比,一种试剂增加了程序性死亡细胞的量,说明该试剂诱导程序性细胞死亡,而与负对照物相比,程序性死亡细胞的量减少,说明该试剂减少或抑制程序性细胞死亡。
在测试试剂时,当线虫处于“预-成年”阶段时,线虫较好地暴露在要测试的试剂中或用要测试的试剂处理。有几个幼虫阶段。如对于Caenorhabditis elegans线虫的完整的生命周期在25℃约为3天,在约12小时达到L1阶段,在L1阶段后7小时达到L2阶段,在L2阶段后约7小时达到L3阶段,在L3阶段后约9小时达到L4阶段。在L4阶段后,幼虫变成成虫[参见Epstein,H.F.等人,“Caenorhabditis elegans”生物体的现代生物学分析,48卷,4-6页(1995)]。活体染料染色步骤较好地在线虫达到成虫阶段时实施。
具体地,本发明涉及筛查癌症调节试剂。因为癌细胞不能经历程序性细胞死亡,所以癌细胞是致命的。癌细胞常常在它们的程序性细胞死亡途径中有缺损。可检测试剂以确定它们对程序性细胞死亡途径的作用,并使用在发展对癌症的治疗中。使用本文所描述的方法可筛查试剂是化学-敏感性的及化学-抗性的。本发明还包括使用本发明的方法确定的化学-敏感性的及化学抗性的试剂。
本发明的另一种应用是确定调节程序性细胞死亡的一种或多种基因,或基因的一个或多个区域的方法。线虫可活体突变。出现在种系中突变是可遗传的。突变发生最有效的发展阶段是L4幼虫晚期或年轻的成虫阶段。突变可通过化学实施或通过辐射实施。一种常见的并广泛使用了化学诱变剂是乙基甲磺酸(EMS)。EMS以每个诱变G/C碱基对约7×10-6的频率实施G/C到A/T的转换。通常使用的EMS浓度为50mM,但较低含量(10-25mM)能降低毒性。使用EMS或其他方法实施突变的方案在Epstein,H.F.等人的“Caenorhabditis elegans”中描述,1995年,生物体的现代生物学分析,48:2,31-55页。为了减少不需要或无关的突变量,可存在几种溶液。新鲜分离的突变体可完全地与未发生突变的遗传背景异型杂交。孟德尔分离和杂交将从选取的突变中分离大部分无关突变。同上,第36页。除去不需要的突变的其他方法在此领域中是众所周知的(同上)。突变的基因也可通过此领域中已知的方法分离克隆[参见Sambrook等人,“分子克隆”,实验室手册,第2版,Cold Spring Harbor出版社,1989]。
然后突变体线虫可进行程序性细胞死亡检测以评定突变的基因对程序性细胞死亡的影响。与对照物相比,程序性死亡细胞量的增加,说明突变体具有增强的进行程序性细胞死亡的能力。在这种情况中,在它们非突变形式中的多种基因或一种基因的表达抑制或减少程序性细胞死亡。与对照物相比,程序性死亡细胞量的减少,说明突变体具有降低的进行程序性细胞死亡的能力。在这些情况中,在它们非突变体形式中的一种或多种基因的表达增强程序性细胞死亡。对照物可以是不含有进行测试的突变的线虫(如野生线虫),并进行如同突变体一样的处理,除了诱导突变的那些处理。对照物可以是与活体染料接触的野生线虫,以使程序性死亡细胞染色,并检测程序性死亡细胞。对照物的程序性死亡细胞的数量可与在突变体中染色的那些程序性死亡细胞量相比较。
例如,称为op152的突变体被制备出来,并使用本发明的方法评定。将op152突变体暴露在吖啶橙活体染料中,染色程序性死亡细胞。使用显微镜检测并评定程序性死亡细胞。通过将突变体暴露在辐射中,将突变体保持在诱导程序性细胞死亡的条件下。与对照物相比,op152诱导大量生殖细胞程序性细胞死亡(参看实例3)。可观察到程序性死亡细胞数量增加。这样,突变体诱导DNA损伤诱导程序性细胞死亡。因此,可使用已知方法分离并克隆基因。
另外,本发明能用来筛查含有经历改变的程序性细胞死亡的细胞的一种或多种突变体。经历改变的程序性细胞死亡的细胞是指与对照物相比,程序性死亡细胞增加了或减少了(如调节)。将突变体保持在诱导程序性细胞死亡(如辐射)的条件下,然后将它们与活体染料接触。检测并评定染色的程序性死亡细胞。与对照物相比,程序性死亡细胞量的增加或减少,说明线虫含有调节程序性细胞死亡的一种或多种突变。对突变量的筛查可以快速并有效地进行。这些突变体也可用来筛查调节程序性细胞死亡的试剂。如,制成几种突变体并进行筛查。分离称为rid-2的突变体,其对辐射诱导DNA损伤程序性细胞死亡表现出超敏感性(参看实例6)。依据本文和Epstein,H.F.等人在1995年,生物体的现代生物学分析48卷,4-6页“Caenorhabditiselegans”中所描述的方法制成rid-2突变体。在用1.6kRad辐射的野生Caenorhabditis elegans线虫时,获得6.6+/-0.6个死亡细胞,而在相同辐射量下rid-2产生26+/-3.6个死亡细胞,或3-4倍的程序性细胞死亡量。这种突变体可用来筛查抑制程序性细胞死亡的试剂,如本文所描述的。辐射不敏感性突变体可用来筛查增加或增强程序性细胞死亡的试剂。
总而言之,Caenorhabditis elegans的简单及其强有力的遗传学特性对辐射-诱导程序性细胞死亡的认识作了重要的贡献,并提供了预防癌细胞中基因失调的作用。通过程序性细胞死亡检测,本发明可用来确定在Caenorhabditis elegans中调节损伤-诱导程序性细胞死亡的基因,如本文所描述的。涉及重要信号转导途径的虫子基因的同源基因在人类中会起到相似的作用,因为在进化过程中这样的途径保持保守。本文所讨论的其他应用有:基因筛查预防或增强程序性细胞死亡的突变,因此预防或增强损伤-诱导细胞死亡;筛查预防或产生辐射诱导或DNA损伤诱导程序性细胞死亡的化合物;监测或检测化合物的毒性。这种程序性细胞死亡检测可在纯的化合物上实施,或在从环境中获得的样品上实施。虽然对损伤诱导程序性细胞死亡的检测是在种系细胞上实施,但没有什么可阻止程序性细胞死亡检测法使用在体组织中的损伤-诱导程序性细胞死亡的检测中。
因此,本发明包括突变体线虫,具体地,包括辐射敏感性或不敏感性突变体。本发明还包括含有野生线虫、或本文描述的筛查的及制成的突变体、和活体染料的试剂盒。
本发明进一步由下列不以任何方式限制发明的实例演示,在这篇文件中所引证的所有参考文献的内容完整地通过在此引述而合并于本文。
实施例
实施例1:辐射诱导程序性细胞死亡的遗传控制物料和方法:
品系:Caenorhabditis elegans品系保持在20℃,如Brenner所描述的[Brenner,S.,“Caenorhabditis elegans的遗传学”遗传学77:71-94(1995)]。除另有说明,所有使用的品系为JonathanHodgkin所描述的。Ced-2(n2438)为Hengartner,M.O.和Horvitz,H.R.所描述的,“由Bcl-2保守区域中氨基酸替换激活Caenorhabditis elegans细胞死亡蛋白质CED-9”,自然399:318-320(1994)。Eg1-1(n3082)由Conradt,B.和Horvitz,R.R.描述,“Caenorhabditis elegans蛋白质EGL-1是程序性细胞死亡所需要的并与Bcl-2-类蛋白质CED-9相互作用”,细胞93:519-29(1998)。
辐射虫子:用指定量的γ辐射照射晚期L4阶段的雌雄同体虫子并在0,12,24和36小时后评定。对于每一时间点,使用标准Nomaski光学仪器通过直接观察评定15只动物的生殖腺臂中生殖细胞的死亡。数据显示为平均数+/-平均标准误差。使用的品系是ced-3(n717),ced-4(n1162),ced-9(n1950),egl-1(n3082)和rad-5(mn159)。为了证实,ced-9(n1950)完全,及egl-1(n3082)部分阻碍辐射诱导细胞死亡,也对诱导生殖细胞死亡进行分析,如图2B中所描述的。
辐射后快速诱导生殖细胞死亡。用120 Gray照射同步动物(L4/成年蜕皮后24小时)并在照射后间隔1小时进行分析。评定生殖细胞死亡。
计数辐射诱导生殖细胞死亡数。将计数死亡细胞的同步动物置于标准条件下[Epstein,H.F.和Shakes,D.C.,细胞生物学方法(学术出版社,1995)],使用Nomaski光学仪器确定死亡细胞。对于照射,使用Cs光源(JL Shepherd和Associates,69A型照射器;每分钟3.984Gray)。为了在L4晚期阶段使用ENU诱导生殖细胞死亡,雌雄同体同步进行,在M9缓冲液中用指定浓度的ENU处理4小时。使用UV诱导生殖细胞死亡,使用Stratalinker(1800型)交联剂,将虫子用6000-24,000Joule/平方厘米的UV(254纳米)照射。为了确定辐射后多快的速度诱导生殖细胞死亡,同步动物(L4/成年蜕皮后24小时)用120Gray照射并以1小时间隔进行分析。
计数身体中程序性死亡细胞的量。在用60Gray照射后3小时,计数第一幼虫阶段ced-1(e1735)吞没作用缺损动物头部细胞死亡量。
图象时间差分析。将动物置于标准条件下含2mM左咪唑的M9缓冲液中(左咪唑防止动物移动但不影响种系或生殖腺)。对于图象分析,使用安装在Zeiss(Akioskope)显微镜上的Cohu4910系列相机。使用NIH图象程序处理图象。
rad-5(mn159):rad-5(mn159)可能是亚形态等位基因。然而,在20℃时,rad-5(mn159)的唯一显著显型是在辐射诱导死亡中的缺损。在20℃时rad-5(mn159)动物的数量约为50%的野生型,但当在较高温度下时由于在不同发育阶段(AG,SM和MOH)胚胎死亡而快速减少。在15℃培养的rad-5(mn159)动物(AG,SM和MOH)仍然阻止辐射诱导程序性细胞死亡。
ENU诱导程序性细胞死亡。ENU诱导生殖细胞程序性细胞死亡。雌雄同体在L4阶段同步进行,并在M9缓冲液中用指定浓度的ENU处理4小时。评定生殖细胞死亡。结果:
DNA-损伤-诱导程序性细胞死亡对除去可能变得对整个生物体有危害的基因损害细胞是很重要的。然而,可以相信认为由于缺少遗传模型体系损伤-诱导程序性细胞死亡受到妨碍。为了发展出这样的模型体系,对Caenorhabditis elegans生殖细胞经历诱导细胞死亡的潜在可能进行分析。Caenorhabditiselegans的生殖细胞,与体细胞比较起来,能在基因毒性应激作用后容易地诱导经历细胞死亡。辐射诱导生殖细胞死亡在形态上与身体内发育-调节程序性细胞死亡及种系中生理学上的程序性细胞死亡相同。与辐射诱导死亡的程序性细胞死亡性质相一致,其使用了核心程序性细胞死亡方式。然而,细胞死亡调节物egl-1和ced9中的突变对体细胞死亡,生理学上的生殖细胞死亡,和辐射诱导死亡有不同的影响。并且,辐射-敏感性突变体rad-5(mn159),其已显示具有增变基因显型,仅在损伤-诱导程序性细胞死亡有缺损。这样,分离信号途径加入到核心程序性细胞死亡方式中以调节Caenorhabditis elegans生理学上的和辐射诱导程序性细胞死亡。
为了确定在Caenorhabditis elegans中基因毒性应激作用的影响,选取雌雄同体种系作为试验体系。在成年Caenorhabditiselegans雌雄同体的卵精巢内,生殖细胞发育经过不同的分化阶段,如图1中所示。在图1中,在U-形卵精巢远端,有丝分裂干细胞在虫子生命的整个过程扩增。当经过转换区域时,生殖细胞停止分裂并开始减数分裂。生殖细胞仅部分被细胞膜包裹,这样享有共同的细胞质。根据文献这些部分分离的核将称为细胞。减数分裂细胞的最充裕的群体停滞在减数分裂I的粗线期并停留在转换区域和生殖腺弯曲之间。从粗线期脱离,生殖细胞发育进入到减数分裂的双线期,生成细胞,经历卵子形成的最后阶段,并在经过受精囊受精后完成减数分裂。在正常生长条件下,约50%雌性生殖细胞经程序性细胞死亡最终死亡。由停滞在减数分裂I的粗线期的多核体的细胞核群产生程序性死亡生殖细胞,并通过吞没方式快速消除,在整个成年阶段产生稳定量0-4的程序性死亡生殖细胞。这些死亡细胞,称为“生理学上的生殖细胞死亡”可视为与它们在正常生长条件下出现时一样起到体内平衡的功能。
为了确定是否基因毒性应激作用能诱导Caenorhabditiselegans的程序性细胞死亡,将在第四(最终)幼虫阶段的虫子暴露在增加量的γ辐射中,并在照射后分析成熟成年虫子的种系。辐射导致程序性死亡生殖细胞量显著地增加,如照射过的虫子在种系的粗线期区域中含有多达45个死亡细胞(图1和图2A)。为了证实生殖细胞死亡量的增加是由于程序性细胞死亡量增加,而不是由于抑制了死亡细胞的吞没作用,将虫子进行照射,并通过图象时间差分析研究辐射诱导生殖细胞死亡的动力学。对正在死亡的细胞使用时间差图象显微镜。经1.5小时过程获得8副代表性图片。研究5个细胞的程序性细胞死亡的不同形态阶段。在从减数分裂核的环境多核体中修剪出后,正在死亡的生殖细胞经历了与在生理学上的生殖细胞死亡和体细胞程序性细胞死亡中观察到的相同的形态上的变化。在约20分钟内,正在死亡的细胞的细胞质的折射力增加并最终与细胞核融合形成均匀的高折射力的死亡细胞。这种改变之后,在失去折射特性前死亡细胞保持20到60分钟,并在不到1分钟内溶解。
为了确定辐射-诱导细胞死亡的基因需求,使用动物突变体重复研究Caenorhabditis elegans细胞死亡方式的关键组件。简单地,在Caenorhabditis elegans中程序性死亡需要caspase同源体CED-3和Apaf-1同源体CED-4的活性,其促使CED-3活化。CED-3和CED-4的杀伤活性由Bcl-2家族成员CED-9对抗,其已被计划在无活性的三元复合物中隐蔽CED-4和CED-3。在最终要死亡的细胞中,CED-9的促-生存活性被含BH3域的蛋白质EGL-1灭活,可能通过直接的蛋白质-蛋白质相互作用。图2A显示虽然在野生(N2)动物中生殖细胞能容易地以剂量依存方式用30到120Grayd的γ辐射诱导,但在失去功能等位基因ced-3(n717)或ced-4(n1162)动物纯合的种系内没有诱导细胞死亡。(图2)。在ced-9(n1950)功能增加突变体中也没有辐射-诱导细胞死亡,并显著地减少了功能突变体的egl-1(n3082)的损失,图2A-2C。在体细胞发育过程中,ced-9(n1950)和egl-1(n3082)完全地抑制了程序性细胞死亡,但对生理学上的生殖细胞死亡没有影响。这样,虽然发育的体细胞死亡,生理学上的生殖细胞死亡和损伤-诱导死亡使用相同的破坏方式,但ced-9(gf)和egl-1(1f)突变的差示行为说明在Caenorhabditis elegans中不同类型的程序性细胞死亡可能使用不同的机理来激活这种方式(图3)。
为了分析程序性细胞死亡能怎样快速地被诱导,在L4/成年蜕皮后24小时将野生成年虫子的同步群体进行照射,并以1小时间隔计数死亡细胞。照射2小时后程序性细胞死亡增加,照射3到4小时后达到峰值,然后在剩余的时间段稳定在稍低的水平上(图2B)。这种快速诱导,与在照射的哺乳动物胸腺细胞中观察到的程序性细胞死亡的动力学相似,说明诱导程序性细胞死亡可能是对方式诱导损伤的直接反应(图2B)。
为了证实辐射诱导程序性细胞死亡是由于DNA损伤,测试其他DNA修饰试剂诱导种系中程序性细胞死亡的能力。药物N-亚硝基-N-乙脲(ENU)显著地诱导程序性细胞死亡(图2C)。尽管作用较小并且由于UV处理(AG,SM和MOH)导致高致死率而很难评定,紫外线(UV)辐射也诱导程序性细胞死亡。
与雌雄同体种系的减数分裂区域相比,进行精子发生的年轻雌雄同体的种系中的或雄性种系中的任何辐射诱导程序性细胞死亡不能确定。在雌雄同体种系内,细胞死亡总是只出现粗线期区域,从不出现在有丝分裂区域。没有被程序性细胞死亡消除的生殖细胞完成卵子发生并成功受精。然而,许多产生的胚胎在胚胎发育的不同阶段死于剂量依存方式的辐射,推测为不可修复DNA损伤的延迟结果。体细胞也显示出对DNA损伤诱导程序性细胞死亡的抵抗,因为存在于年轻ced-1幼虫头部的程序性死亡细胞量,其缺乏死亡细胞吞没作用,没有受到辐射的影响(0Gray,18+/-0.4个死亡细胞;60Gray,17.6+/-0.4个死亡细胞;参考本实施例的物料和方法)。如果程序性细胞死亡当真在身体内出现,那么它不能是广泛的,因为成年虫子容易存活的辐射剂量不大于480Gray。
给定上面的结果,基因可能存在感应DNA损伤并将这种信息转送给程序性细胞死亡方式。在Caenorhabditis elegans中预先的基因筛查已确定出九种辐射敏感性(Rad)突变体。根据对那些突变体的筛查,发现rad-5(ms159)对调节辐射诱导程序性细胞死亡有缺陷(图2A和图2B)。为了rad-5(mn159)显示特异地影响DNA损伤诱导生殖细胞程序性细胞死亡而不是所有程序性细胞死亡,将rad-5和两个ced-3等位基因预防辐射诱导生殖细胞程序性细胞死亡的能力与它们预防咽的发育细胞死亡的能力比较。如所预料的,ced-3突变在相同程度上预防两种细胞死亡。相反,rad-5(mn159)显著地预防辐射诱导程序性细胞死亡,但对发育细胞死亡只有边际作用(参考表1)。
表1
基因型 | 咽额外细胞平均+/-平均标准误差n | 死亡生殖细胞平均+/-平均标准误差n |
野生 | 0 15 | 22.9 +/-3.2 15 |
rad-5(mn159) | 0.8 +/-0.3 19 | 0.3 +/-0.2 15 |
ced-3(n717) | 12 +/-2.6 11 | 0.1 +/-0.1 15 |
ced-3(n2438) | 1.7 +/-1.2 12 | 15.4 +/-2.4 15 |
表1)rad-5(mn159)特异抑制DNA损伤诱导程序性细胞死亡。定量咽额外细胞(产生于程序性细胞死亡的抑制作用),如前面所述。确定晚期L4阶段照射后36小时生殖细胞死亡量。显示的结果是平均数+/-平均标准误差;平均标准误差是平均值的标准偏差;n是计数动物的数量。
本文所列出的数据与存在的感应DNA损伤并将信号传送到程序性细胞死亡方式以影响程序性细胞死亡的基因途径是一致的。这样的途径可能是进化保守的,因为在各种哺乳动物体系中程序性细胞死亡可通过DNA损伤试剂容易地诱导。损伤诱导程序性细胞死亡,其常常在肿瘤细胞中受到损害,认为它对于除去可能会变得对整个生物体有危害的损伤细胞是很重要的。如在哺乳动物体系中,只有一部分细胞类型有对DNA损伤引发的促-程序性细胞死亡信号反应的能力。这种对程序性细胞死亡潜在能力的限制在Caenorhabditis elegans中是特别明显的,因为只有在雌雄同体内产生卵母细胞的减数分裂生殖细胞有能力进行辐射-诱导程序性细胞死亡。有丝分裂细胞和进行精子发生的减数分裂生殖细胞(在雌雄同体及雄性种系中)对死亡有抵抗力。
粗线期细胞的辐射诱导程序性细胞死亡可能是通常感应未分离的重组中间体的部分依赖rad-5减数分裂关卡。确实,对这样的减数分裂关卡已作了描述在芽殖酵母孢子形成期间和哺乳动物精子发生期间起作用。在酵母中,损伤感应诱导瞬时减数分裂细胞周期停滞,而在哺乳动物精子发生中它引起程序性细胞死亡或细胞周期停滞。在Caenorhabditis elegans中,减数分裂关卡导致程序性细胞死亡的证据得到发现许多him突变体的支持,him突变体产生减数分裂缺损最终导致染色体未分离量增加,含有增加量的生殖细胞程序性细胞死亡(表2)。与在感应DNA更替中rad-5的作用一致,rad-5(mn159)也抑制由Him-8(e1489)产生的额外细胞死亡显型(表2)。除了能延迟将DNA损伤引起的细胞死亡信号传送给程序性细胞死亡方式,Rad-5还能作为DNA损伤更常见的感应器。这种额外的作用由rad-5(mn159)的增变基因显型展示,其在即使没有诱变的情况下产生突变积累。
表2
基因型 | 死亡生殖细胞 |
野生 | 0.4+/-0.1 |
Him-5(e1467) | 1.4+/-0.3 |
Him-5(e1490) | 4.4+/-1.6 |
Him-8(mn243) | 1.4+/-0.4 |
Him-8(e1489) | 3.1+/-0.5 |
Him-8(e1489),rad-5(mn159) | 0.4+/-0.1 |
Rad-5(mn159) | 0.3+/-0.1 |
表2)rad-5(mn159)抑制在强壮的未分离突变体中观察到的额外生殖细胞程序性细胞死亡。当同源染色体没有分离时出现未分离突变体。突变产生强壮的染色体未分离也致使可受到rad-5抑制的额外生殖细胞死亡。确定L4阶段后24小时生殖细胞死亡数。显示的结果是平均数+/-平均标准误差,n=15(Him-8(mn243)时n=12)及him-5(e1490)。
总之,本文以显示在Caenorhabditis elegans的种系中,DNA损伤-诱导信号导致对依赖rad-5的程序性细胞死亡的诱导。rad-5(mn159),egl-1(1f)和ced-9(gf)突变体的差示行为说明,在Caenorhabditis elegans中分离信号途径加入到核心程序性细胞死亡方式中以调节体细胞死亡,生理学上的生殖细胞死亡和辐射诱导生殖细胞死亡(图3)。对虫子辐射诱导程序性细胞死亡的基因分析能帮助阐述导致DNA-损伤诱导程序性细胞死亡的分子机理。
实施例2:实施程序性细胞死亡检测的方案
用来染色Caenorhabditis elegans的方案如下:
M9中浓度为30-50μg/毫升的吖啶橙(AO)(贮存物是10毫克/毫升,所以每毫升M9使用3-5μl)
在小平板上加入有150-200只不饿的虫子的0.5毫升溶液
旋转板以确保AO溶液分布均匀
在黑暗中在20℃放置2小时(较好是1.5-2.5小时)
用1.5毫升M9将虫子从板上洗掉,并使用巴氏吸液管将虫子转移到琥珀Eppendorf管中
旋转几分钟,并吸去M9
用M9冲洗两次
用巴氏吸液管重新将虫子放置在小平板上少于100-150μl的M9中
在黑暗中20℃退色2小时(1.5-6小时是可以接受的,取决于染色的强度)
检测:
对虫子F2代筛查如下:
使用标准方法用EMS使大平板上的许多L4阶段的N2发生突变。将虫子从板上冲洗到3毫升的M9中,并转移到15毫升含有溶解在1毫升M9中的20μl EMS的试管中。将试管在室温下旋转4小时,并用总量为12毫升的M9冲洗3次,然后重新放置在板上1-2小时。当虫子复原时,将L4阶段的虫子挑到新板上。
为了优化这种筛查,使用涉及筛查的时间花费/基因组,以及使用的物料的几种方案。基本方案是挑选L4,作为PO,使它们在盘上产卵24小时,然后将PO移放到新盘中2天。然后将F1代从这些板中移到新板上5-10个一组放置4-16小时,在它们移出之后,留下F2代胚胎。当F2代成年时,将它们用AO染色,并用能看到染料的解剖显微镜观察。当成年虫子较大时实施染色以保证如果突变发生导致发育延迟,虫子将有充分的时间生长。除此之外,在很多情况中,F2代已被产下16小时,在板上有相当大量的成年虫子。
虫子在它们退色的板上直接观察。如果它们看起来很好,就将它们移出,进行重新筛查。如果候选者不是不育的,那么重新筛查F3代,以保证纯合性。如果候选者是不育的,则选取同胞,以纯合形式克隆品系。
为了确保筛查对上面的检测有用,在用AO染色后用解剖显微镜检测对照物品系。尽管这些检测不定量,但观察到在解剖显微镜下可看到吞没突变体没有染色,而其他突变体如ced-9,ced-3和N2以根据它们的基因型能预计到的量染色。表3显示进行筛查及观察的线虫的数量。
表3
在5个独立的试验中筛查总量约6500个基因组 | |||
突变发生 | F1代/板 | F1代在板上的时间 | F2代/板 |
1 | 10 | 4小时 | 50-100 |
2 | 5 | 约16小时 | 100-150 |
3 | 10 | 约16小时 | 150-200 |
4 | 10 | 约16小时 | 150-200 |
5 | 5 | 约16小时 | 100-150 |
在突变发生1-3中,将染色超过背景的虫子从板中挑出。如果这些虫子不是不育的,则筛查F3代。如果它们是不育的,为了克隆品系,则挑出同胞和F3代进行筛查。在晚期筛查中,挑选虫子更严格。首先用显微镜将它们挑出,然后在Normarski和更高性能的荧光显微镜下观察。第二个方法更有效,可使大多数假性正对比在对F3代实施筛查前排除。
实施例3:发展Caenorhabditis elegans中的
生殖细胞程序性细胞死亡荧光检测
Caenorhabditis elegans种系发展成为有力的基因体系,以研究细胞如何控制程序性细胞死亡程序的活化。参看实施例1。与虫子的体组织相比,种系在整个生命期间持续扩增。除了产生分化的接合子,大部分生殖细胞通过程序性细胞死亡除去。生殖细胞死亡需要与体细胞死亡一样的程序性细胞死亡核心方式。如在身体中,死亡的生殖细胞很快地被吞没,这样通常在任何给定时间只有少量生殖细胞死亡可以观察到。为了简化种系死亡细胞的检测,发展了使用活体染料吖啶橙的检测方法,在有生命的虫子体内检测程序性死亡的生殖细胞(图4)。
为了确定是否种系细胞死亡可用作为模型体系来研究DNA损伤-诱导程序性细胞死亡的机理,对基因毒性试剂对生殖细胞死亡的影响进行分析。不同于体细胞,在以剂量依存方式暴露在γ或UV辐射中或暴露在N-亚硝基-N-乙脲(ENU)中后,生殖细胞很容易经历程序性细胞死亡(图5-7)。辐射-诱导生殖细胞死亡需要ced-3和ced-4活性,证实了其性质上是程序性细胞死亡(图5-7)。在3小时内死亡诱导是显著的(图8),并能用微分干扰相差光学仪器和吖啶橙检测(图9)。
给定上面的结果,存在感应DNA损伤并将这种信息转导到程序性细胞死亡途径中的基因。根据对一组存在的候选突变的筛查,辐射-诱导细胞死亡在rad-5突变体中几乎完全被消除。而基础量与辐射无关的生殖细胞死亡没有受到影响(图10)。因为rad-5有增变基因显型,并在正常发育期间对程序性细胞死亡没有很大的影响,rad-5作为DNA损伤的感应物,而不是程序性细胞死亡的常用效应物(参看实施例1)。
为了确定Caenorhabditis elegans生殖细胞当暴露在病理条件下而不是DNA损伤条件下时是否能进行程序性细胞死亡,分离突变op152。Op152诱导大量的生殖细胞程序性细胞死亡(见表4)。在筛查有增加的生殖细胞程序性细胞死亡的突变中分离op152突变。使用标准方法[Anderson,P.诱变,细胞生物学方法48:31-58(1995)]用EMS诱变L4阶段野生雌雄同体,并将其转移到新接种的板上,持续3天每24小时重新放置。将成年F1代动物转移到新板上(5-10只虫子/板)并保持产卵4-16小时,产生同步的F2代动物的半克隆群体。在F2代动物在达到成年期后36小时检测生殖细胞程序性细胞死亡,使用如图4中所描述的活体染料吖啶染色方法。
有趣的是,当在op152虫子体内程序性细胞死亡受到抑制时(op152的一代;ced-3双突变体),没有观察到程序性死亡生殖细胞;然而,虫子仍然在繁殖,并在现在能观察到许多坏死性死亡(表4)。这样在op152背景中,生殖细胞变得衰弱,并不是坏死,其是一种“脏的死亡”(因为它损伤了环境组织,在哺乳动物体内产生炎症),它们激活了程序性细胞死亡途径并经历了一种干“净的死亡”(没有损伤或炎症)。除了DNA损伤,生殖细胞程序性细胞死亡也能被刺激诱导,这样它能被用作为多种毒性试剂的检测方法。
表4
ced-3中的突变预防op152诱导程序性细胞死亡,但不预防生殖细胞死亡
基因型 | 是否繁殖 | 生殖细胞死亡 | |
量 | 类型 | ||
野生(N2) | 是 | + | 程序性细胞死亡 |
Ced-3(n717)Ⅳ | 是 | NA | |
Ced-9(n2812)Ⅲ | 否 | +++ | 程序性细胞死亡 |
Ced-9(n2812)Ⅲ;ced-3(n717)Ⅳ | 是 | NA | |
Op152Ⅲ | 否 | +++ | 程序性细胞死亡 |
Op152Ⅲ;ced-3(n717)Ⅳ | 否 | +++ | 坏死性死亡 |
通过在DIC光学仪器下直接观察及通过吖啶橙染色确定生殖细胞死亡量。用吖啶只有效染色程序性死亡生殖细胞。通过评定至少6只动物的群体数量确定是否繁殖。繁殖的动物产出至少50只可看到的后代。不繁殖的动物仅产出少于2只的可看到的后代。NA:不可适用。
实施例4:吖啶橙活体染料染色Caenorhabditis
elegans体内的程序性死亡生殖细胞
为了使用活体染料吖啶橙(AO,分子探针,Eugene,OR)染色程序性死亡生殖细胞,将500Fl的在M9缓冲液中的30Fg/毫升AO的溶液平铺在60毫米含150-200只不饿的虫子的板上。在黑暗中将虫子染色2小时。随后将虫子用1.5毫升M9从板上冲洗掉,并用巴氏吸液管将虫子转移到琥珀microfuge试管中,在microfuge中简单旋转后沉淀虫子,将上清液除去,在虫子沉淀中加入新鲜的M9。两次冲洗后,将虫子冲洗放置在接种有E.Coli的60毫米琼脂板上,在黑暗中保持恢复并退色2小时。然后准备计数虫子并观察。
使用微分干扰相差(DIC)光学仪器检测程序性死亡细胞,并与用活体染料染色的程序性死亡细胞比较。通过将动物放置在含30mM NaN3的M9盐溶液滴中,并使用DIC光学仪器观察动物来研究线虫种系中死亡细胞的数量和外观。死亡细胞是细胞化的,并且比含胞体的核或卵母细胞有更强的折射力,并能在高倍数下识别。
使用AO染色的程序性死亡细胞能快速有效地检测程序性死亡细胞。使用DIC光学仪器检测更节省时间。与使用DIC光学仪器检测的程序性死亡细胞相比,大约有80%-90%的程序性死亡细胞被AO染色,并被检测。
实施例5:可检测γ辐射,试剂,和UV辐射诱导
程序性细胞死亡,和辐射敏感性突变体
图5显示在成年Caenorhabditis elegans雌雄同体种系中γ辐射诱导程序性细胞死亡。将L4阶段的幼虫转移到接种有E.Coli的琼脂板上,并暴露到Cs光源(MarkⅠ型68A辐射器,JLShepherd & Associates,San Fernando,CA)中,使用如实施例4中所描述的DIC显微镜视觉检测确定生殖细胞死亡量。
图8显示γ射线辐射后在成年Caenorhabditis elegans雌雄同体种系中程序性细胞死亡的动力学。将成年阶段的雌雄同体转移到接种有E.Coli的琼脂板上,并暴露在如上所述的γ辐射中。使用如实施例4中所描述的DIC显微镜视觉检测确定辐射后各时间点的生殖细胞死亡量。
图9显示γ辐射诱导生殖细胞程序性死亡可通过吖啶橙染色检测。将L4阶段的幼虫或成年雌雄同体转移到接种有E.Coli的琼脂板上,并暴露到Cs光源(MarkⅠ型68A辐射器,JL Shepherd& Associates,San Fernando,CA)中,使用如实施例4中所描述的DIC显微镜及吖啶橙染色视觉检测确定生殖细胞死亡量。
图6显示化学诱变剂N-乙基-N-亚硝基脲诱导成年Caenorhabditis elegans雌雄同体种系中的程序性细胞死亡。使用确定的方案用N-亚硝基-N-乙脲(ENU)诱变L4阶段幼虫。De Stasio E,等人,遗传学,147:597-608(1997)。使用如实施例4中所描述的DIC显微镜视觉检测确定生殖细胞死亡量。
图7显示UV辐射诱导成年Caenorhabditis elegans雌雄同体种系中的程序性细胞死亡。将L4阶段的幼虫或成年雌雄同体转移到接种有E.Coli的琼脂板上,并暴露使用UVStratalinker1800光源的UV辐射(Stratagene,CA)中,使用如实施例4中所描述的DIC显微镜视觉检测确定生殖细胞死亡量。
图10显示rad-5突变体抵抗γ射线-诱导程序性细胞死亡。将L4阶段雌雄同体幼虫转移到接种有E.Coli的琼脂板上,并暴露到Cs光源(MarkⅠ型68A辐射器,JL Shepherd & Associates,San Fernando,CA)中,使用如实施例4中所描述的DIC显微镜视觉检测确定生殖细胞死亡量。实施例6:使用吖啶橙活体染料检测法筛查辐射诱导死亡突变体
使用AO活体染料染色由辐射产生的程序性死亡细胞发现另一种辐射敏感性突变体,rid-2。使用本文和Epstein,H.F.等人在“Caenorhabditis elegans”生物体的现代生物学分析,第48卷,4-6页(1995)中所描述的方法制成突变体。RID代表辐射诱导死亡。用1.6KRad辐射N2(野生)产生6.6+/-0.8个死亡细胞,而用相同剂量辐射rid-2产生26+/-3.6个死亡细胞。在L4幼虫阶段的虫子用1.6KRad的剂量辐射,24小时后通过用Normaski光学仪器观察计数死亡细胞(n=10)。这种突变体对辐射有超敏感性,并能应用在程序性细胞死亡检测中来筛查减少rid-2突变体中程序性细胞死亡的试剂。
虽然本发明就其较好的的实施方案已作了具体的演示和说明,但此领域的技术人员可以理解认为,在没有背离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围的情况下,可作各种形式和细节上的改变。
Claims (33)
1.一种在有生命的线虫体内确定存在或不存在一种或多种程序性死亡细胞的方法,包括:
(a)将有生命的线虫与活体染料接触染色线虫体内的程序性死亡细胞;
(b)检测存在或不存在被染料染色的程序性死亡细胞。
2.根据权利要求1的方法,其中线虫是Caenorhabditis elegans。
3.根据权利要求2的方法,其中Caenorhabditis elegans是成年的。
4.根据权利要求3的方法,其中活体染料是吖啶橙或SYTO染料。
5.根据权利要求1的方法,其中程序性死亡细胞是DNA损伤诱导程序性死亡细胞。
6.根据权利要求4的方法,其中步骤(b)通过视觉检测程序性死亡细胞实施。
7.根据权利要求1的方法,其中线虫在步骤(a)前暴露在要测试的试剂中或条件下。
8.根据权利要求1的方法,其中线虫含有改变程序性细胞死亡的突变。
9.一种在有生命的线虫体内确定试剂或条件对程序性细胞死亡的影响的方法,包括:
(a)将有生命的线虫暴露在要测试的试剂中或条件下;
(b)将线虫与活体染料接触染色线虫体内程序性死亡细胞;
(c)检测存在或不存在被染料染色的程序性死亡细胞。
10.根据权利要求9的方法,进一步包括确定程序性死亡细胞的量及与对照物的量相比。
11.根据权利要求10的方法,其中与对照物相比,程序性死亡细胞的量增加,说明试剂或条件诱导程序性细胞死亡。
12.根据权利要求10的方法,其中与对照物相比,程序性死亡细胞的量减少,说明试剂或条件抑制或减少程序性细胞死亡。
13.一种如权利要求9的方法所确定的调节程序性细胞死亡的试剂。
14.一种在有生命的线虫体内确定要测试的至少一种基因表达的程序性细胞死亡作用,其中在基因的至少一个区域已制成突变,包括:
(a)将有生命的线虫与活体染料接触染色线虫体内的程序性死亡细胞;
(b)检测存在或不存在被染料染色的程序性死亡细胞。
15.根据权利要求14的方法,进一步包括确定程序性死亡细胞的量及与对照物的量相比。
16.根据权利要求15的方法,其中与对照物相比,程序性死亡细胞的量增加或减少,说明基因表达影响程序性细胞死亡。
17.根据权利要求16的方法,其中程序性死亡细胞量的增加说明基因表达增强程序性细胞死亡。
18.根据权利要求16的方法,其中程序性死亡细胞量的减少说明基因表达抑制或减少程序性细胞死亡。
19.一种如权利要求14的方法所确定的调节程序性细胞死亡的基因。
20.一种在有生命的Caenorhabditis elegans线虫体内确定存在或不存在一种或多种DNA损伤诱导程序性死亡细胞的方法,包括:
(a)将有生命的线虫与吖啶橙接触染色线虫体内的程序性死亡细胞;
(b)在有生命的线虫体内视觉检测被吖啶橙染色的程序性死亡细胞,从而确定存在或不存在程序性死亡细胞。
21.一种在有生命的线虫体内确定存在或不存在程序性死亡细胞的方法,包括:
(a)提供对辐射具有改变的敏感性的线虫;
(b)将有生命的线虫与活体染料接触染色线虫体内的程序性死亡细胞;
(c)在有生命的线虫体内检测存在或不存在被染料染色的程序性死亡细胞。
22.根据权利要求21的方法,其中将线虫暴露在要测试的试剂中或条件下。
23.根据权利要求22的方法,其中线虫对辐射敏感,与对照物相比。
24.根据权利要求22的方法,其中线虫对辐射不敏感,与对照物相比。
25.根据权利要求22的方法,包括确定存在的程序性死亡细胞的量及与对照物的量相比。
26.一种在有生命的线虫体内确定存在或不存在一种或多种程序性死亡细胞的方法,包括:
(a)将有生命的线虫保持在调节程序性细胞死亡的条件下;
(b)将线虫与活体染料接触染色线虫体内的程序性死亡细胞;
(c)在有生命的线虫体内检测存在或不存在被染料染色的程序性死亡细胞。
27.一种确定突变的,含有经历改变的程序性细胞死亡的细胞的有生命生物体的方法,包括:
(a)将生物体与调节程序性细胞死亡的试剂或条件接触,从而产生突变的有生命的生物体;
(b)将突变的生物体与活体染料接触染色生物体内的程序性死亡细胞;
(c)在有生命的突变的生物体内检测存在或不存在被染料染色的程序性死亡细胞;
(d)选取含有经历改变的程序性细胞死亡的细胞的突变生物体,与对照物相比。
28.根据权利要求27的方法,其中突变体对诱导程序性细胞死亡的辐射具有较强的敏感性,与对照物相比。
29.根据权利要求27的方法,其中突变体对诱导程序性细胞死亡的辐射具有较弱的敏感性,与对照物相比。
30.一种如权利要求27的方法所确定的突变的线虫。
31.一种试剂盒,其包括:
(a)至少一种Caenorhabditis elegans线虫;
(b)一种活体染料。
32.根据权利要求31的试剂盒,其中活体染料是吖啶橙或SYTO染料。
33.根据权利要求31的试剂盒,其中线虫是突变的,这样线虫对诱导程序性细胞死亡的辐射是敏感的或是不敏感的。
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