CN101711880B

CN101711880B - 超顺磁性碳纳米管造影剂的制备和应用

Info

Publication number: CN101711880B
Application number: CN2009102004148A
Authority: CN
Inventors: 贾能勤; 殷敏; 田忠
Original assignee: Shanghai Normal University
Current assignee: Shanghai Normal University; University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2009-12-22
Filing date: 2009-12-22
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2029-12-22
Also published as: CN101711880A

Abstract

本发明属于磁共振成像技术，一种超顺磁性碳纳米管造影剂的制备和应用。现有磁共振成像在良、恶肿瘤组织与正常组织之间，信号强度相差不大，达不到准确诊断的目的。本发明将多壁碳纳米管和二茂铁混合均匀通过高温热分解法制备了超顺磁性多壁碳纳米管，然后采用阴离子高聚物、阳离子高聚物层层组装包裹后，制成表面带有氨基的水溶性多壁磁性碳纳米管；与靶向试剂叶酸通过化学键连接进一步功能化，将其作为一种靶向核磁共振造影剂转染于体外培养的宫颈癌Hela细胞，增强MRI成像效果。本发明的优点是：造影剂制备方法简单；毒性小、弛豫效率高；具有良好的生物相容性，适合各种于各种生物体系；成像效果好，便于准确诊断。

Description

超顺磁性碳纳米管造影剂的制备和应用

技术领域

本发明属于磁共振成像技术，具体地说是一种超顺磁性碳纳米管造影剂的制备和应用。

背景技术

磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)是现有医学影像技术中成像的最好方法。MRI利用生物体不同组织在外磁场影响下产生不同的共振信号来成像，信号的强弱取决于组织内水的含量和水分子中质子的弛豫时间，具有组织分辨率高、成像参数多、使用安全等突出优点，在肿瘤诊断和基础研究方面有着重要的意义。虽然MRI有以上诸多优点，但是经过大量临床病例显示，磁共振成像在良、恶肿瘤组织与正常组织之间，信号强度相差不大，达不到准确诊断的目的。为了改变病变局部的信号强度，提高MRI诊断的敏感性和特异性，使良、恶肿瘤组织与正常组织之间，信号强度差别大，造影效果好，肿瘤组织诊断准确，发明一种高灵敏度和良好生物相容性的磁共振造影剂是十分重要的。

磁共振造影剂是用来缩短成像时间、提高成像对比度和清晰度的一种成像增强对比剂，它可以有效地改变病变组织中水质子的自旋-自旋弛豫时间，提高正常与患病部位的成像对比度，从而清晰显示体内器官的功能与状态。按照物质的磁化特性可将造影剂分为顺磁性和超顺磁性两类，超顺磁性造影剂的磁距远远大于顺磁性物质，弛豫效能高，可通过尺寸选择或特异性表面分子修饰实现对特定组织的靶向，并有独特的跨膜机理，实现细胞内分子靶向。造影剂分为阳性和阴性两类：阳性可缩短T₁弛豫时间，使信号强度增强；阴性可缩短T₂及T₂ ^*弛豫时间，使信号强度降低。目前应用较多的是超顺磁性氧化铁造影剂(superparamagnetic iron oxide，SPIO)，该造影剂主要是用缩短组织的T₂及T₂ ^*弛豫时间来增强健康组织与病变组织之间的对比。绝大多数超顺磁性氧化铁造影剂是球形的纳米粒子，粒径为10～14纳米。这种造影剂经静脉给药后主要被体内的单核巨噬细胞所清除，不能有效的到达病变组织以达到高效的显影作用。因此合成具有高弛豫效率、对组织或器官有靶向性的造影剂是十分重要的。

发明内容

本发明的目的是：发明一种能够改变病变局部信号强度，提高MRI诊断的敏感性和特异性，使良、恶肿瘤组织与正常组织之间，信号强度差别大，造影效果好，肿瘤组织诊断准确，高灵敏度和良好生物相容性的磁共振造影剂。

本发明的目的是这样实现的：

超顺磁性碳纳米管造影剂的制备方法，步骤如下：

(1)配制混酸溶液：将3倍体积的98％浓硫酸与1体积的浓硝酸混合；

(2)制备短碳纳米管：将微米级长度的多壁碳纳米管置于混酸中；功率350W超声16小时；二次蒸馏水离心，多次漂洗至中性；干燥得长度100～300nm的粉末状短碳纳米管；

(3)制备超顺磁性多壁碳纳米管：将步骤(2)制得的短碳纳米管与等质量的二茂铁置于坩埚中混合均匀；将坩埚密封于不锈钢钢瓶中，放入马弗炉350℃～425℃条件下反应1～2小时；冷却至室温；

(4)步骤(3)制得的黑色粉末状的物质用无水乙醇溶液重复漂洗，除去未反应的二茂铁；

(5)将步骤(4)所得物质真空干燥得粉末状超顺磁性多壁碳纳米管；

(6)准确称取步骤(5)所得超顺磁性多壁碳纳米管，加入到1wt％聚苯磺酸钠溶液中，65℃下搅拌6～12小时，过滤、磁性分离得到碳纳米管聚苯磺酸钠复合物；(7)将步骤(6)所得复合物分散到20ml 1wt％聚乙酰亚胺溶液中，摇床反应3小时后离心除去过量的聚乙酰亚胺，得到具有良好的水溶性的碳纳米管聚苯磺酸钠聚乙酰亚胺复合物(MAGCNTs-PSS-PEI)；

(8)准确称取叶酸FA，溶解于二甲亚砜(DMSO)中，加入碳二亚胺(EDC)，摇床反应3～4小时，将叶酸的羧基活化；

(9)将上述羧基活化了的叶酸溶液加入铁浓度为0.08μM的MAGCNTs-PSS-PEI水溶液中，摇床反应6～12h后离心除去未反应的叶酸，用0.9％的生理盐水分散，得到靶向磁共振造影剂，灭菌待用。

超顺磁性碳纳米管造影剂的应用，步骤如下：

(1)培养宫颈癌(Hela)细胞：

选用对数生长期宫颈癌细胞，在含10％小牛血清的DMEM培养基，37℃5％CO₂饱和温度下培养；

(2)MAGCNTs-PSS-PEI细胞毒性测试：

A、取对数生长期的宫颈癌细胞，胰酶常规消化制成单细胞悬液，计数，均匀接种细胞于96孔细胞培养板，每孔加细胞悬液200μL(含5000～6000个细胞)，每个浓度组设六个复孔，37℃5％CO₂饱和温度下培养24h使其贴壁并进入对数生长期；

B、24h后吸出原培养液，每孔加180μl含10％小牛血清的DMEM培养基；加20ul不同浓度梯度的MAGCNTs-PSS-PEI纳米复合物(每个浓度组的终浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL)，对照组只含细胞和细胞培养液；

C、在37℃5％CO₂饱和温度下连续孵育20小时后，每孔加入20μLMTT溶液继续孵育4小时后终止培养，弃去上清液，每孔加入150μL二甲亚砜(DMSO)，震荡10min，使MTT蓝紫色结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪于540nm处检测各孔的吸光值；

D、以未接种细胞只加培养基孔的吸光值为空白对照调零，取六孔平均值，得到细胞存活率与样品浓度的关系图；

(3)功能化磁性碳纳米管造影剂作用于宫颈癌细胞后T^* ₂信号强度测定：

A、将同浓度的MAGCNTs-PSS-PEI、MAGCNTs-PSS-PEI-FA分别加入到对数生长期的Hela细胞中，在37℃5％CO₂饱和温度下培养6h；

B、取未经任何处理的对数生长期的Hela细胞，作为阴性对照；6小时后胰酶消化、离心成团，用0.5％琼脂糖均匀分散；

C、临床磁共振诊断仪在1.5T下分别检测其T^* ₂信号下降强度。

本发明的要点是：

(1)混酸共同作用于多壁碳纳米管，连续超声将之裁剪成短管。将截断的多壁碳纳米管与二茂铁乙酸混合均匀，高温作用2小时后自然冷却得到粉末状的超顺磁性多壁碳纳米管。

(2)将阴离子高聚物(如聚苯磺酸钠(PSS)、)和阳离子高聚物(如聚乙酰亚胺(PEI)、聚酰胺胺(PAMAM)、壳聚糖(Chitosan)、聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)等)分别修饰到超顺磁性多壁碳纳米管上，得到表面连有氨基在水、生理盐水中都能均匀分散的功能化水溶性磁性多壁碳纳米管。

(3)将靶向试剂叶酸(FA)的羧基活化与水溶性多壁磁性碳纳米管表面的氨基进行酰胺反应，从而使叶酸负载到经聚合物包裹的水溶性多壁磁性碳纳米管上，制得靶向磁共振造影剂。

(4)将未连接靶向试剂和连有FA靶向试剂的磁性多壁碳纳米管溶液分别加入到对数生长期的Hela等叶酸受体高表达的肿瘤细胞中继续培养6h后，用医用磁共振仪进行扫描检测到明显的T^* ₂信号下降强度。

本发明设计了经聚合物功能化修饰的超顺磁性多壁碳纳米管作为靶向磁共振造影剂。首先将多壁碳纳米管和二茂铁混合均匀通过高温热分解法制备了超顺磁性多壁碳纳米管，然后采用阴离子高聚物、阳离子高聚物层层组装包裹后，制成表面带有氨基的水溶性多壁磁性碳纳米管。水溶性的多壁磁性碳纳米管与靶向试剂叶酸通过化学键连接进一步功能化，将其作为一种新型的靶向核磁共振造影剂转染于体外培养的宫颈癌Hela细胞，显示了其增强MRI成像效果。这种超顺磁性碳纳米管(MAGCNTs)靶向造影剂有很好的弛豫效率，且磁粒子负载在一维长度的多壁碳纳米管上增大了其与靶细胞的接触面积，更有利于其达到特定组织，缩短靶向组织的T₂及T₂ ^*弛豫时间来提高成像的对比度。

现有技术纳米材料在生物领域方向的研究以零维的纳米颗粒为主，碳纳米管因其特殊的一维管状结构，大的比表面积，较强的吸附能力，管壁易进行表面修饰或功能化等特点，许多有机或无机分子可以共价或非共价地结合于碳纳米管的内外壁表面，对碳纳米管进行表面修饰或功能化，形成具有良好生物相容性和管壁表面带有不同功能的官能团的多功能碳纳米管，在生物医学方面应用有独特的优势。

本发明的优点是：

1、造影剂制备方法简单，快速、成本低。

2、超顺磁性多壁碳纳米管具有毒性小、弛豫效率高、靶向成像等特点。

3、具有良好的生物相容性，适合各种于各种生物体系。

4、成像效果好，便于准确诊断。

本发明针对不同的生物体系以超顺磁性多壁碳纳米管为造影剂，为肿瘤及疾病的诊断开辟了一种新途径。

附图说明

图1A为未经修饰的磁性碳纳米管TEM图；B为经阴阳离子聚合物修饰后的磁性碳纳米管图。

图2为磁性碳纳米管在不同溶液中稳定性；A为未经修饰的磁性碳纳米管分散在蒸馏水中，几分钟就聚沉下来；B为MAGCNTs-PSS-PEI分散在蒸馏水中；C为MAGCNTs-PSS-PEI分散在0.9％的生理盐水中；D为MAGCNTs-PSS-PEI分散在PBS中；E为MAGCNTs-PSS-PEI分散在细胞培养液MEM中；图中显示经过数天后还能均匀分散，保持稳定。

图3为MTT法测试MAGCNTs-PSS-PE复合物的生物相容性。从图中与控制组的比较中可以明显看出MAGCNTs-PSS-PE具有良好的生物相容性，适合各种于各种生物体系。

图4为control Hela cells，MAGCNTs-PSS-PEI、MAGCNTs-PSS-PEI-FA与Hela cells共同孵育6h后的MRI T^* ₂加权图像。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明。

本发明实施方式中选用的材料：

多壁碳纳米管(MWNTs)、二茂铁、聚苯磺酸钠(PSS)、聚乙酰亚胺(PEI)、叶酸(FA)、二甲亚砜(DMSO)、乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺(EDC)。

实施例1：制备短碳纳米管。

将长度在微米级的MWNTs置于混酸之中(H₂SO₄与HNO₃的体积比为3∶1)，超声16小时。用二次蒸馏水离心多次漂洗直至中性。干燥得到长度分布在100~300nm之间的粉末状的短MWNTs。

实施例2：高温热分解法制备超顺磁性多壁碳纳米管。

将截短了的MWNTs与二茂铁等质量置于30ml坩埚中混合均匀，密封于不锈钢钢瓶中，将其放入马弗炉中在350℃～425℃条件下反应1～2h，之后冷却至室温。将收集到的黑色粉末状的样品用纯乙醇溶液重复漂洗几次除去过量的未反应的二茂铁。最后真空干燥得到粉末状的磁性碳纳米管(MAGCNTs)。

实施例3：制备水溶性MAGCNTs复合物。

制备原理：层层组装。

称取一定量的MAGCNTs加入到1wt％PSS溶液中，65℃下搅拌6～12h。通过过滤、磁性分离得到MAGCNTs-PSS复合物。将上述复合物分散到20ml 1wt％PEI溶液中，摇床反应3h后离心除去过量的PEI，得到MAGCNTs-PSS-PEI复合物(TEM图1)。经聚合物包裹的多壁磁性碳纳米管具有良好的水溶性，能够很好的分散在不同的盐溶液中(图2)。

实施例4：羧基与氨基的酰胺化耦合反应制备靶向磁共振造影剂。

称取3.5mgFA溶解于DMSO中，加入9.0～9.3mgEDAC摇床反应3～4h，将FA的羧基活化。将上述羧基活化了的FA溶液加入铁浓度为0.08uM的MAGCNTs-PSS-PEI水溶液中，摇床反应6～12h后离心除去未反应的FA，用0.9％的生理盐水分散，得到靶向磁共振造影剂，灭菌待用。

实施例5：Hela细胞的培养及MAGCNTs-PSS-PEI细胞毒性测试。

Hela宫颈癌细胞株购自中国科学院上海细胞库。Hela细胞在含10％小牛血清的DMEM培养基，37℃5％CO₂饱和温度下培养。实验选用对数生长期细胞。

取对数生长期的Hela，胰酶常规消化制成单细胞悬液，计数，均匀接种细胞于96孔细胞培养板，每孔加细胞悬液200μL(含5000～6000个细胞)，每个浓度组设六个复孔，37℃5％CO₂饱和温度下培养24h使其贴壁并进入对数生长期。24h后吸出原培养液，每孔加180ul含10％小牛血清的DMEM培养基，之后加20ul不同浓度梯度的MAGCNTs-PSS-PEI纳米复合物(每个浓度组的终浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL)，对照组只含细胞和细胞培养液。接下来37℃5％CO₂饱和温度下连续孵育20h后，每孔加入20μLMTT溶液继续孵育4h后终止培养，弃去上清液，每孔加入150μLDMSO，震荡10min，使MTT蓝紫色结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪于540nm处检测各孔的吸光值(OD值)，并以未接种细胞只加培养基孔的吸光值为空白对照调零，取六孔平均值，得到细胞存活率与样品浓度的关系图3。从图中可以看出MAGCNTs-PSS-PEI浓度在12.5μg/mL以下具有良好的生物相容性，适用于各种生物体系。

实施例6：功能化磁性碳纳米管造影剂作用于Hela细胞后T^* ₂信号下降强度的测定

将同浓度的MAGCNTs-PSS-PEI、MAGCNTs-PSS-PEI-FA分别加入到对数生长期的Hela细胞中，在37℃5％CO₂饱和温度下培养6h。取未经任何处理的对数生长期的Hela细胞，作为阴性对照。作用6h后胰酶消化、离心成团，用0.5％琼脂糖均匀分散。临床磁共振诊断仪在1.5T下分别检测其T^* ₂信号下降强度。从图4可以看出，与未经任何处理的Hela细胞和经MAGCNTs-PSS-PEI、MAGCNTs-PSS-PEI-FA作用的Hela细胞相比，与MAGCNTs-PSS-PEI-FA作用的Hela细胞T^* ₂图像明显变黑，呈现出显著的信号差异。同时通过T₂ ^*Mapping序列测试对照组Hela细胞和经MAGCNTs-PSS-PEI、MAGCNTs-PSS-PEI-FA作用的Hela细胞T₂ ^*值分为36.430ms、24.268ms、12.145ms。由此说明MAGCNTs可以作为一种很好靶向磁共振造影剂，用于肿瘤或癌病组织的磁共振成像诊断。

上述实施例仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，凡在本发明的原则之内，所做的任何修改、变化、变通或替换方案，均在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种超顺磁性碳纳米管造影剂的制备方法，步骤如下：

(6)准确称取步骤(5)所得超顺磁性多壁碳纳米管，加入到1wt％聚苯磺酸钠溶液中，65℃下搅拌6～12小时，过滤、磁性分离得到碳纳米管聚苯磺酸钠复合物；

(7)将步骤(6)所得复合物分散到20ml 1wt％聚乙酰亚胺溶液中，摇床反应3小时后离心除去过量的聚乙酰亚胺，得到具有良好的水溶性的碳纳米管聚苯磺酸钠聚乙酰亚胺复合物；

(8)准确称取叶酸FA，溶解于二甲亚砜中，加入碳二亚胺，摇床反应3～4小时，将叶酸的羧基活化；

(9)将上述羧基活化了的叶酸溶液加入铁浓度为0.08μM的MAGCNTs-PSS-PEI水溶液中，摇床反应6～12h后离心除去未反应的叶酸，用0.9％的生理盐水分散，得到超顺磁性碳纳米管造影剂，灭菌待用。

2.根据权利要求1制备方法得到的超顺磁性碳纳米管造影剂在宫颈癌细胞后T^＊ ₂信号强度测定中的应用，步骤如下：

(1)培养宫颈癌细胞：

(2)MAGCNTs-PSS-PEI细胞毒性测试：

A、取对数生长期的宫颈癌细胞，胰酶常规消化制成单细胞悬液，计数，均匀接种细胞于96孔细胞培养板，每孔加细胞悬液200μL，含5000～6000个细胞，每个浓度组设六个复孔，37℃5％CO₂饱和温度下培养24h使其贴壁并进入对数生长期；

B、24h后吸出原培养液，每孔加180μl含10％小牛血清的DMEM培养基；加20ul不同浓度梯度的MAGCNTs-PSS-PEI纳米复合物，每个浓度组的终浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL，对照组只含细胞和细胞培养液；

(3)超顺磁性碳纳米管造影剂作用于宫颈癌细胞后T^＊ ₂信号强度测定：

C、临床磁共振诊断仪在1.5T下分别检测其T^＊ ₂信号下降强度。