CN103143043A - 一种Fe3O4/Au复合纳米颗粒的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种Fe3O4/Au复合纳米颗粒的制备方法，包括：PEI的PEG化修饰；PEG化修饰的PEI包裹合成金纳米颗粒；水热法合成PEI包覆的Fe3O4/Au复合纳米颗粒；PEI包覆的Fe3O4/Au复合纳米颗粒的表面乙酰化修饰。本发明反应条件温和，合成步骤简单；并且制备的Fe3O4/Au复合纳米颗粒具有良好的胶体稳定性、生物相容性、T2弛豫效应和X-射线衰减特性，在MR/CT双模态成像诊断领域具有潜在的应用价值。

Description

一种Fe3O4/Au复合纳米颗粒的制备方法
技术领域
本发明属于复合纳米材料的制备领域，特别涉及一种Fe3O4/Au复合纳米颗粒的制备方法。
背景技术
近几十年来，随着纳米技术的不断发展，各种纳米颗粒应运而生，尤其是磁性四氧化三铁纳米颗粒，因为其本身的生物相容性和特殊的磁学性能，使其在生物医学领域有着广泛的应用，比如：药物载体、细胞分离和核磁共振成像等。另外，金纳米颗粒由于其具有很好的化学稳定性、催化活性、生物相容性以及特殊的光学特性，使其可以很好的应用于蛋白质检测、光热治疗和体内疾病诊断等领域。然而单一的纳米颗粒有自身的缺点和局限性，因此寻找合适的方法合成多功能的复合纳米颗粒成为了当今纳米颗粒领域研究的重点。
Fe3O4/Au复合纳米颗粒作为多功能复合纳米颗粒中的一种，已被验证了可以成功应用于细胞分离、抗菌和体内双模态成像等方面。蔡等人成功合成了用于生物体内MR/CT双模态成像的Fe3O4/Au复合纳米颗粒，但该法合成步骤复杂，并且制得的纳米颗粒中金的含量较少，从而限制了其进一步的应用（Cai,et al.J.Mater.Chem.2012,22,15110-15120）。就Fe3O4/Au复合纳米颗粒的合成方法而言，目前广泛应用的大都是热分解法和层层自组装法，然而热分解法需要在高温条件下完成，层层自组装反应过程复杂。水热合成法是一种比较温和的纳米颗粒合成方式，并且合成的纳米颗粒具有很好的水溶性和稳定性。Ge等人提出了一种简单的水热合成磁性氧化铁纳米颗粒的方法（Ge et al.,J.Phys.Chem.C2009,113,13593-13599）。本课题组前期的专利（专利公开号201110104443.1和201210277624.9）成果显示硅烷和聚乙烯亚胺（PEI）修饰的磁性氧化铁纳米颗粒也可以通过水热法合成。近年来，随着水热合成技术的成熟，通过一步水热合成法制备多功能Fe3O4/Au复合纳米颗粒成为了可能。
PEI是一种水溶性聚胺，其大分子链上拥有大量的氨基可以为磁性四氧化三铁纳米颗粒或金纳米颗粒提供稳定存在的屏障（Wen et al.Colloids Surf.A-Physicochem.Eng.Aspects2013,419,80-86;专利公开号201210277624.9）。聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)是高亲水性聚合物，它对纳米颗粒的修饰可以提高纳米颗粒的水溶性、生物相容性，并延长其在体内的血液循环时间（Peng et al.,Biomaterials2012,33,1107-1119；Wen et al.,Biomaterials2013,34,1570-1580）。通过一步水热合成法制备PEI和mPEG稳定的Fe3O4/Au复合纳米颗粒不仅具有很好的稳定性和生物相容性，并且将四氧化三铁纳米颗粒和金纳米颗粒的功能结合起来，使其在生物医学领域有着广泛的应用前景，特别是在体内MR/CT双模态成像方面。
检索国内外文献，尚没有发现关于一步水热合成法制备PEI包覆的Fe3O4/Au复合纳米颗粒的合成及其用于体内MR/CT双模态成像的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种Fe3O4/Au复合纳米颗粒的制备方法，该方法反应条件温和，合成步骤简单；并且制备的Fe3O4/Au复合纳米颗粒具有良好的胶体稳定性、生物相容性、T2弛豫效应和X-射线衰减特性，在MR/CT双模态成像诊断领域具有潜在的应用价值。
本发明的一种Fe3O4/Au复合纳米颗粒的制备方法，包括：
（1）将甲氧基聚乙二醇mPEG-COOH、EDC和NHS混合，溶于水中，搅拌反应3-5h，然后加入聚乙烯亚胺PEI水溶液中，搅拌反应2-3d，透析，除去副产物和杂质，冷冻干燥，得到mPEG-PEI；其中mPEG-COOH、EDC、NHS的摩尔比为1:5:5，mPEG-COOH和PEI的摩尔比为15:1；
（2）将上述mPEG-PEI溶于溶于水中，加入HAuCl4溶液，搅拌30-60min，然后加入冰浴处理的NaBH4溶液，搅拌2-4h，透析，得到mPEG-PEI-Au纳米颗粒；其中PEI和HAuCl4的摩尔比为1:200；
（3）将Fe(II)盐溶解在水中，加入NH3·H2O，在空气气氛条件下，搅拌10-20min，使二价铁充分被氧化，加入mPEG-PEI-Au水溶液，搅拌混合后进行水热反应，反应温度为130-135℃，反应时间为2-4h，自然冷却至室温，离心洗涤，除去过量的反应试剂，得到PEI包裹的Fe3O4/Au复合纳米颗粒Fe3O4-PEI-mPEG-Au；其中Fe(II)盐、水、NH3·H2O的配比为125mg:2mL:0.625mL，Fe(II)盐和mPEG-PEI-Au中PEI的质量比为2.5:1；
（4）将Fe3O4-PEI-mPEG-Au纳米颗粒水溶液中加入三乙胺，搅拌30-60min，然后加入乙酸酐，搅拌反应24-48h，离心洗涤，即得乙酰化的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒，其中三乙胺、乙酸酐与Fe3O4/Au复合纳米颗粒表面的PEI上伯氨基摩尔比为5:5:1。
所述步骤（1）中mPEG-COOH的分子量为2000。
所述步骤（1）中聚乙烯亚胺PEI的分子量为25000。
所述步骤（2）中HAuCl4溶液的浓度为30mg/mL。
所述步骤（1）和（2）中透析为用截留分子量14000的透析袋对蒸馏水透析2-5天。
所述步骤（2）中NaBH4溶液的溶剂为体积比为1:2的乙醇和超纯水混合液。
所述步骤（3）中Fe(II)盐为FeCl2·4H2O。
所述步骤（3）中离心洗涤方法为：磁分离除去上清液，再加超纯水超声分散，再离心分离，重复超纯水洗涤3-5次。
所述步骤（4）中三乙胺的密度为0.726～0.729g/mL，体积百分浓度为99.0%。
所述步骤（4）中乙酸酐的密度为1.08g/mL，体积百分浓度为98.5%。
本发明先利用PEG化的聚乙烯亚胺包裹合成金纳米颗粒，然后通过一步水热法合成mPEG-PEI包裹的Fe3O4/Au复合纳米颗粒，最后对纳米颗粒表面的剩余氨基进行乙酰化修饰。
本发明反应条件温和，合成步骤简单。制备的Fe3O4/Au复合纳米颗粒具有良好的胶体稳定性、生物相容性、T2弛豫效应和X射线衰减特性，在MR/CT双模态成像诊断领域具有潜在的应用价值。
本发明使用X-射线衍射（XRD）、电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）、紫外可见吸收光谱（UV-Vis）、热重分析（TGA）、Zeta电势及动态光散射和透射电子显微镜（TEM）等方法表征制备的复合纳米颗粒，并测定了纳米颗粒的T2弛豫性能和X-射线衰减特性。然后利用溶血实验、MTT法和相差显微镜来评价纳米颗粒的血液相容性和细胞毒性，最后通过尾静脉注射评价纳米颗粒在小鼠体内的MR/CT成像效果及其在体内的组织分布情况。具体测试结果如下：
（1）X-射线衍射（XRD）的测试结果
通过分析X-射线衍射图谱（如图1）可知，水热法合成的复合纳米材料在相应的谱峰处分别与Fe3O4和Au纳米颗粒的标准谱峰一致，表明水热法合成的产物为Fe3O4/Au复合纳米颗粒。（2）紫外吸收（UV-Vis）测试结果
图2所示为mPEG-PEI-Au(a)、Fe3O4-PEI-mPEG-Au(b)、Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au(c)和Fe3O4-PEI(d)在300到800nm的紫外吸收图谱。从图中我们可以看出，Fe3O4-PEI在400到800nm没有明显的紫外吸收峰，而mPEG-PEI-Au在520nm处有一个明显的吸收峰，证明金纳米颗粒的成功制备。合成的Fe3O4-PEI-mPEG-Au纳米颗粒在乙酰化前后的紫外吸收峰红移到540nm，表示合成的纳米颗粒中有金的存在。
（3）热重分析（TGA）测试结果
图3所示是乙酰化前后纳米颗粒的TG变化曲线，从图中可以看出乙酰化前纳米颗粒的失重量为15.14%（图3a），乙酰化后纳米颗粒的失重量为17.71%。经过计算，乙酰化前后纳米颗粒的TG变化量为2.57%。由此表明Fe3O4/Au复合纳米颗粒的成功乙酰化修饰。
（4）纳米颗粒Zeta电势及水动力直径测试结果
通过Zeta电势的测量来进一步确定纳米颗粒的成功乙酰化，电势测量结果（表1）表明，由于大量表面氨基的存在，Fe3O4-PEI-mPEG-Au纳米颗粒的表面电势是+27.4mV，经过乙酰化反应之后，得到的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒表面电势降到了+12.8mV。结果显示，纳米颗粒的表面氨基已乙酰化成功。但是，乙酰化后纳米颗粒的表面电势未达到中性，这可能是因为表面部分用来稳定金纳米颗粒和四氧化三铁纳米颗粒的氨基不能进行乙酰化反应。乙酰化前后，纳米颗粒的水动力直径的测试结果同样如表1所示，乙酰化前后纳米颗粒的水动力直径没有发生很大的变化，并且能长时间保持几乎不变，说明了制备的复合纳米颗粒具有良好的胶体稳定性。
（5）透射电子显微镜（TEM）测试结果
制备的PEI-mPEG-Au纳米颗粒和Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au复合纳米颗粒的形态和粒径是通过TEM观察的（如图4所示）。如图4（a）、（b）和（c）分别是制备的PEI-mPEG-Au纳米颗粒的TEM图、粒径分布图和Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au复合纳米颗粒的TEM图。TEM测试结果显示复合纳米颗粒中四氧化三铁的结构为球形或者不规则球形，粒径约为16.7nm，并且颗粒外围有一层大分子壳层包围；金纳米颗粒的平均粒径为3.5nm，不均匀地分布在四氧化三铁的外围，说明合成的复合纳米颗粒是以四氧化三铁为核、金纳米颗粒为壳的核壳结构。（6）T2弛豫率测量结果
良好的弛豫率(r2)是Fe3O4纳米材料用作核磁共振（MR）成像阴性造影剂的重要因素，弛豫率可通过不同铁浓度下的弛豫时间（T2）的倒数拟合计算得到。图5a表示在不同铁浓度下的T2MR成像信号图片，从图可以看出，随着铁浓度的增加，MR信号强度随之减弱。图5b是Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au复合纳米颗粒的T2弛豫时间倒数随铁浓度变化的线性拟合图，可以看出Fe3O4纳米材料的T2弛豫时间的倒数随着铁浓度的增加（在0-0.16mM浓度范围内）具有很好的线性关系，通过计算可得该复合纳米颗粒的r2弛豫率是146.07mM-1s-1。因此，本发明所合成的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米材料可作为MRI分子影像学诊断中的优良T2信号衰减造影剂。
（7）X-射线衰减特性测量结果
为了检测制备的Fe3O4/Au复合纳米颗粒的CT成像效应，我们使用CT成像仪测定了复合纳米颗粒的X-射线衰减特性（如图6）。在图6a中，随着金浓度的增加，纳米颗粒的CT信号强度也随之增加。图6b表示CT值随金浓度变化的线性拟合图，可以看出复合纳米颗粒的CT值随着金浓度的变化具有很好的线性关系。说明了本发明的复合纳米颗粒作为造影剂在CT成像中的应用潜力。
（8）血液相容性
为了安全地应用于生物体内的成像诊断，我们通过溶血实验评价了制备的Fe3O4/Au复合纳米材料的血液相容性。图7中显示了Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au在浓度分别为50、100、200和400μg/mL下的溶血性测试结果。通过测量上层清液的吸光光谱来定量评价纳米材料的溶血性。如图7右上角紫外图谱显示，在浓度达到400μg/mL条件下，Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au的溶血率仅为1.9%，说明制备的纳米材料具有很好的血液相容性，因而可以安全地用于生物体内成像。
（9）MTT细胞活力和相差显微镜测试结果
通过MTT比色法测定KB细胞（一种人类上皮癌的细胞株）的活力来检测所合成纳米颗粒的细胞毒性（如图8）。KB细胞与Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒在浓度为10、25、50、75和100μg/mL和37℃下孵化24小时。然后，经MTT处理后在570nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的活力。不同浓度的材料对细胞增殖的影响以缓冲液PBS处理细胞为对照进行比较。与对照组相比，不同浓度的纳米材料处理后的细胞存活率均在80%以上。这充分说明合成的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au具有很低的生物毒性，可以应用到生物体内成像诊断。我们进一步通过相差显微镜来确定了材料对细胞的毒性大小。如图9所示，被不同浓度的纳米材料处理24小时后的细胞形态和PBS处理的细胞相比，没有明显的变化，进一步说明了合成的材料的低毒性。
（10）生物体内MR成像和CT成像
通过尾静脉注射Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒来评价体内的MR成像效果（如图10所示），与注射前的对照组相比较，在注射后0.5小时，小鼠的肝脏明显变暗，在注射后1、2和4小时，肝脏较0.5小时稍微的变亮，说明纳米颗粒已经逐渐从肝脏部位代谢出去（图10a）。图10b是相应肝脏MR信号值随注射后时间的变化，在注射后0.5小时，信号值较注射前明显降低，而随后又逐渐缓慢上升，这与图10a的结果一致。这些结果说明该制备的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒能成功应用于体内MR成像的造影剂。
我们进一步通过尾静脉注射Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒来评价体内CT成像效果（如图11所示）。与未注射纳米颗粒的对照组相比，注射后1分钟，大鼠的主动脉血管明显变亮；注射后20分钟，主动脉血管的亮度稍微减少，而肝脏的亮度明显增加（图11a），说明这段时间纳米颗粒从主动脉血管逐渐代谢到肝脏区域。图11b是相应注射时间的主动脉血管和肝脏CT值变化，我们发现主动脉血管的CT值在注射后1分钟显著增加，在注射后20分钟稍微降低。肝脏的CT值在注射后1分钟较对照组有所增加，在注射后20分钟又进一步的增加，说明纳米颗粒随着血液的循环从主动脉血管逐渐代谢到肝脏区域。这些结果说明该制备的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒是良好的CT成像造影剂。
（11）生物体内组织分布
为了研究Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒的生物组织分布情况，ICP-AES用来测量在注射后不同时间点各个重要器官中铁和金的含量。图12a和图12b分别是注射后不同时间点各个组织器官中铁的浓度和金的浓度。从图中可看出在注射纳米颗粒后，肝、脾和肺对铁和金的吞噬量较注射前明显增加，而在其他的器官，比如：心、肾、脑、胃和肌肉仅有少量的聚集。这些结果证明合成的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒可以很好的应用于一些重要器官的MR和CT成像。
有益效果
（1）本发明采用简单的“一步”水热法合成水溶性良好的mPEG-PEI包覆的Fe3O4/Au复合纳米颗粒，然后进行乙酰化修饰。此法合成流程简单，反应条件温和，成本较低，具有实施商业化的前景；
（2）本发明制备的Fe3O4/Au复合纳米颗粒能够长时间地稳定分散于水溶液中，没有出现团聚现象。PEI的包覆增加了纳米颗粒的稳定性，mPEG的表面修饰增加了纳米颗粒的生物相容性和亲水性，该复合纳米颗粒将四氧化三铁和金纳米颗粒的功能结合于一个纳米颗粒，使其成为体内MR/CT双模态成像的潜在造影剂。
附图说明
图1是本发明制备的Fe3O4-PEI-mPEG-Au的X-射线衍射图；
图2是本发明制备的PEI-mPEG-Au（a）、Fe3O4-PEI-mPEG-Au（b）、Fe3O4-PEI-Ac-m PEG-Au（c）和Fe3O4-PEI（d）纳米颗粒的紫外吸收图；
图3是本发明制备的Fe3O4-PEI-mPEG-Au（a）和Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au（b）的热重分析图；
图4是本发明制备的PEI-mPEG-Au纳米颗粒的透射电镜图（a）及其粒径分布图（b）和Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au复合纳米颗粒的透射电镜图（c）；
图5是本发明制备的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au在不同Fe浓度下的MR成像图片（a）和T2弛豫时间倒数与Fe浓度的线性关系图（b）；
图6是本发明制备的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au在不同Au浓度下的CT成像图片（a）和CT值随金浓度变化的线性关系图（b）；
图7是本发明制备的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au（浓度范围50-400μg/mL）的溶血实验紫外图谱，右上角插图显示的是图中放大的紫外吸收图谱，右下角插图从左到右依次是水、PBS、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au复合纳米颗粒处理2小时并离心后的人血红细胞图片；
图8是MTT法测试的KB细胞经过PBS缓冲液（对照）和Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au复合纳米颗粒（浓度范围在0-100μg/mL）处理24小时后的细胞活力；
图9是KB细胞经过PBS缓冲液（对照,a）和不同浓度的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au复合纳米颗粒（b:10μg/mL,c:25μg/mL,d:50μg/mL,e:75μg/mL,f:100μg/mL）处理24小时后的细胞形态；
图10是尾静脉注射Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au(0.3mL,[Fe]=129.17mM,[Au]=68.46mM)前和注射后不同时间点（0.5、1、2和4小时）小鼠肝脏的MR成像图片（a）和相应的MR信号强度变化（b）；
图11是尾静脉注射Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au(1.0mL,[Fe]=129.17mM,[Au]=68.46mM)前和注射后不同时间点（1和20分钟）小鼠肝脏和主动脉血管的CT成像图片（a）和相应的CT值变化（b）；
图12是尾静脉注射Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au(0.3mL,[Fe]=129.17mM,[Au]=68.46mM)前和注射后不同时间点（1、4、12和24小时）小鼠主要器官（心、肝、脾、肺、肾、胃、脑和肌肉）中铁（a）和金（b）的组织分布。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
取60mg mPEG-COOH、19.17mg EDC和11.51mg NHS于一反应瓶中，加入5mL超纯水使其溶解，然后磁力搅拌反应3h。取50mg PEI溶解于5mL超纯水。将活化的mPEG-COOH水溶液（5mL）逐滴加入到上述5mL的PEI水溶液中，并搅拌反应三天。将反应混合液用截留分子量14000的透析袋对蒸馏水透析三天（6次，2L/次），除去副产物和杂质，将产物mPEG-PEI冷冻干燥后储存在-20℃备用。将上述合成的mPEG-PEI溶解于10mL超纯水中。加入5.4mL HAuCl4溶液（30mg/mL），搅拌半小时。然后向其中加入冰浴处理的0.9mL NaBH4（45.4mg）溶液（乙醇/超纯水，v/v=1:2），继续搅拌两小时后，再用截留分子量14000的透析袋对蒸馏水透析三天（6次，2L/次），得到的mPEG-PEI-Au纳米颗粒水溶液（20.8mL）储存于4℃，用于下一步反应。
将125mg FeCl2·4H2O溶解于2mL的超纯水，温和搅拌下，加入0.625mLNH3·H2O，将上述混合液在空气中连续搅拌10分钟，使二价铁充分被氧化，接着将混合溶液转移到反应釜中。将制备的PEI-mPEG-Au水溶液（20mL）加入反应釜中，与反应釜中溶液充分混匀，于134℃反应3小时。反应结束后，自然冷却至室温，将所得到的沉淀磁分离除去上清液，再加适量超纯水超声分散，再离心分离，如此重复超纯水洗涤五次，以除去过量的反应试剂，然后重新分散于10mL超纯水中，即得mPEG-PEI包覆的Fe3O4/Au复合纳米颗粒Fe3O4-PEI-mPEG-Au。取2mL的Fe3O4-PEI-mPEG-Au水溶液冷冻干燥用于X-射线衍射检测。XRD结果显示水热法合成的复合纳米材料在相应的谱峰处分别与Fe3O4和Au纳米颗粒的标准谱峰一致，表明水热法合成的产物为Fe3O4/Au复合纳米颗粒（见附图1）。
在5mL Fe3O4-PEI-mPEG-Au水溶液中加入12μL三乙胺（密度为0.726～0.729g/mL，浓度为99.0%）。振荡30分钟充分混合后，逐滴加入7μL乙酸酐（密度为1.08g/mL，浓度为98.5%）（三乙胺、乙酸酐与Fe3O4-PEI-mPEG-Au的表面氨基摩尔比=5:5:1），将混合溶液搅拌反应24小时，制得表面乙酰化的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒。分别取制备的mPEG-PEI-Au（对比例2）、Fe3O4-PEI-mPEG-Au（对比例3）、Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au和Fe3O4-PEI（对比例1）各70μL用超纯水配制成0.8mL的水溶液用来测紫外吸收光谱。如图2所示为mPEG-PEI-Au(a)、Fe3O4-PEI-mPEG-Au(b)、Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au(c)和Fe3O4-PEI(d)纳米颗粒在300到800nm的紫外吸收图谱。从图中我们可以看出，Fe3O4-PEI在400到800nm处没有明显的紫外吸收峰，而mPEG-PEI-Au在520nm处有一个明显的吸收峰，证明金纳米颗粒的成功制备。合成的Fe3O4-PEI-mPEG-Au纳米颗粒在乙酰化前后的紫外吸收峰红移到540nm，这表明合成的纳米颗粒中有金的存在。
实施例2
分别取0.5mL Fe3O4-PEI-mPEG-Au（对比例3）和Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au（实施例1）纳米颗粒冷冻干燥用于热重分析。如图3所示是乙酰化前后纳米颗粒的TG变化曲线，从图中可以看出乙酰化前纳米颗粒的失重量为15.14%（图3a），乙酰化后纳米颗粒的失重量为17.71%。经过计算，乙酰化前后纳米颗粒的TG变化量为2.57%。由此表明Fe3O4/Au复合纳米颗粒的成功乙酰化修饰。
实施例3
分别取0.1mL Fe3O4-PEI-mPEG-Au（对比例3）和Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au（实施例1）纳米颗粒用超纯水配制成1.5mL的水溶液，然后用于测表面电势和水动力直径（如表1）。通过Zeta电势的测量来进一步确定纳米颗粒的成功乙酰化。电势测量结果（表1）表明，由于大量表面氨基的存在，Fe3O4-PEI-mPEG-Au纳米颗粒的表面电势是+27.4mV，经过乙酰化反应之后，得到的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒表面电势降到了+12.8mV。结果显示，纳米颗粒的表面氨基已乙酰化成功。但是，乙酰化后纳米颗粒的表面电势未达到中性，这可能是因为表面的部分用来稳定金纳米颗粒和四氧化三铁纳米颗粒的氨基不能发生乙酰化反应。乙酰化前后，纳米颗粒的水动力直径的测试结果同样如表1所示，乙酰化前后纳米颗粒的水动力直径没有发生很大的变化，并且能长时间保持几乎不变，说明了制备的复合纳米颗粒具有良好的胶体稳定性。
表1.Fe3O4-PEI-mPEG-Au和Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒的电势和水动力直径。
样品 电势(mV) 水动力直径（nm） PDI
Fe3O4-PEI-mPEG-Au 27.4±0.45 263.1±2.82 0.54±0.013
Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au 12.8±0.34 262.7±3.06 0.29±0.021
实施例4
分别取制备的PEI-mPEG-Au（对比例2）纳米颗粒和乙酰化后的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au（实施例1）纳米颗粒5μL用超纯水配制成100μL的纳米颗粒水溶液，然后取配制的纳米颗粒水溶液各5μL分别滴在铜网表面，并在空气中晾干后用于TEM测试（如图4所示）。图4（a）、（b）和（c）分别是制备的PEI-mPEG-Au纳米颗粒的TEM图、粒径分布图和Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au复合纳米颗粒的TEM图。TEM测试结果显示复合纳米颗粒中四氧化三铁的结构为球形或者不规则球形，粒径约为16.7nm，并且颗粒外围有一层大分子壳层包围，金纳米颗粒的平均粒径为3.5nm，不均匀地分布在四氧化三铁的外围。说明合成的复合纳米颗粒是以四氧化三铁为核、金纳米颗粒为壳的核壳结构。
实施例5
将上述实施例1制备的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒通过ICP-AES测得溶液中Fe、Au元素的含量，再在EP管中用超纯水配制Fe浓度依次为0.005、0.01、0.02、0.04、0.08和0.16mM的水溶液2mL，通过T2磁共振成像测定材料在不同的Fe浓度下的T2弛豫效应（如图5所示）。图5a表示在不同铁浓度下的T2MR成像图片，从图可以看出，随着铁浓度的增加，MR信号强度随之减弱。图5b是Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au复合纳米颗粒的T2弛豫时间倒数(s-1)随铁浓度变化的线性拟合图，可以看出纳米材料的弛豫时间倒数随着铁浓度的增加（在0-0.16mM浓度范围内）具有很好的线性关系。并且通过计算可得该复合纳米颗粒的r2弛豫率是146.07mM-1s-1。因此，本发明所合成的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米材料可作为MRI分子影像学诊断中的优良T2信号衰减造影剂。
实施例6
为了检测实施例1制备的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒的CT成像效应，在EP管中用超纯水配制Au浓度依次为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05和0.06M的纳米颗粒水溶液0.2mL，然后用CT成像仪测定复合纳米颗粒的X射线衰减特性（如图6）。在图6a中，随着金浓度的增加，纳米颗粒CT信号强度也随之增加。图6b表示CT值随金浓度变化的线性拟合图，可以看出复合纳米颗粒的CT值随着金浓度的变化具有很好的线性关系，证实了本发明的纳米材料作为造影剂在CT成像中的应用潜力。
实施例7
为了安全地应用于生物体内的成像检测，我们通过溶血实验评价了实施例1制备的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒的血液相容性。称取冻干的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米材料1mg，分散于PBS中配制成1mg/mL的浓度为母液，然后用PBS依次配制浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL的纳米颗粒悬浮液。取适量的人新鲜血液，首先离心(2000rpm/min，5min)去上清液，然后再将血红细胞用PBS洗涤5次，收集健康的红细胞并用PBS稀释10倍。再将Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米材料（50-400μg/mL）与红细胞混合均匀后静置2小时，10000rpm/min离心1min后，拍照并测上清液的紫外吸光光谱。该过程以PBS作为阴性对照，以超纯水作为阳性对照。图7中显示了Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au在浓度分别为50、100、200和400μg/mL下的溶血性测试结果。通过测量上层清液的吸光度来定量评价纳米材料的溶血性。如图7右上角紫外图谱显示，在浓度达到400μg/mL时，Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au的溶血率仅为1.9%，说明制备的纳米材料具有很好的血液相容性，因而它们可以安全地用于生物体内成像。
实施例8
以KB细胞为模型细胞检测实施例1制备的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒对细胞增殖的影响。称取冻干的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米材料1mg，分散于PBS中配制成1mg/mL的PBS溶液，并用紫外照射过夜杀菌。然后在超净工作台用无菌的PBS配制浓度为10、25、50、75和100μg/mL的无菌纳米颗粒悬浮液。KB细胞种植于96孔板后与Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒在浓度为10、25、50、75和100μg/mL和37℃下共培养24小时。然后，向培养板孔中加入20μL MTT，继续在37℃下培养4小时，然后弃去培养液，并加入150μL DMSO，振荡15分钟后在570nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的活力（如图8）。不同浓度的材料对细胞增殖的影响以缓冲液PBS处理细胞为对照进行比较。数据处理后发现不同浓度的纳米材料处理后的细胞存活率都在80%以上。这充分说明合成的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au具有很低的生物毒性，可以应用到生物体内成像诊断。我们进一步通过相差显微镜检测了材料对细胞的毒性大小。如图9所示，被不同浓度的纳米材料（10、25、50、75和100μg/mL）处理24小时后的细胞形态和PBS处理的细胞相比，没有明显的变化，进一步说明了合成的材料的低毒性。
实施例9
将实施例1制备的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒水溶液用PBS离心洗涤3次后重新分散于2mL PBS中，并用ICP-AES测定溶液中Fe、Au的浓度。分别以C57鼠和SD鼠为模型动物评价Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au复合纳米颗粒的体内成像特性。腹腔注射麻药迷昏小鼠，然后向C57鼠尾静脉注射Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au(0.3mL,[Fe]=129.17mM,[Au]=68.46mM)，用核磁共振成像仪测试小鼠肝脏在注射后不同时间点的T2成像。向SD鼠尾静脉注射Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au(1.0mL,[Fe]=129.17mM,[Au]=68.46mM)，用CT成像仪测试小鼠肝脏和主动脉血管在注射后不同时间点的CT成像情况。通过尾静脉注射Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒来评价体内的MR成像效果（如图10所示），与注射前的对照组相比较，在注射后0.5小时，小鼠的肝脏明显变暗，在注射后1、2和4小时，肝脏较0.5小时稍微的变亮，说明纳米颗粒已经逐渐从肝脏部位代谢出去（图10a）。图10b是相应肝脏MR信号值随注射后时间的变化，在注射后0.5小时，信号值较注射前明显降低，而随后又逐渐缓慢上升，这与图10a的结果一致，这些结果说明该制备的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒能成功应用于体内MR成像的造影剂。
我们进一步通过尾静脉注射实施例1制备的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒来评价体内的血池CT成像效果（如图11所示）。与未注射纳米颗粒的对照组相比，注射后1分钟，大鼠的主动脉血管明显变亮；注射后20分钟，主动脉血管的亮度稍微减少，而肝脏的亮度明显增加（图11a），说明这段时间纳米颗粒从主动脉血管逐渐代谢到肝脏区域。图11b是相应注射时间的主动脉血管和肝脏CT值变化，我们发现主动脉血管的CT值在注射后1分钟显著增加，在注射后20分钟稍微降低。肝脏的CT值在注射后1分钟较对照组有所增加，在注射后20分钟又进一步的增加，说明纳米颗粒随着血液的循环从主动脉血管逐渐代谢到肝脏区域。这些结果说明该制备的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒是良好的CT成像造影剂。
实施例10
以C57鼠为模型动物研究实施例1制备的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒尾静脉注射后不同时间点铁和金的组织分布。向C57鼠尾静脉注射Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au(0.3mL,[Fe]=129.17mM,[Au]=68.46mM)后，分别在注射后1、4、12和24小时处死小鼠，取出各个器官并称重，然后切成小片段，并加入3mL王水（盐酸/硝酸；体积比3:1）浸泡2天，然后用ICP-AES测定各个组织器官中铁和金的含量。图12a和图12b分别是注射后不同时间点各个器官的铁的浓度和金的浓度。在图中可看出在注射纳米颗粒后，肝、脾和肺对铁和金的吞噬量较注射前明显增加，而在其他的器官，比如：心、肾、脑、胃和肌肉仅有少量的聚集。这些结果证明合成的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒可以很好的应用于一些重要器官的MR和CT成像。
对比例1
用2mL超纯水将Fe(II)盐（125mg）溶解，再加入0.625mL NH3·H2O，并于空气气氛下搅拌10分钟，然后将混合溶液转移到高压反应釜中，并将10mg/mL的PEI水溶液（5mL）也加入到高压反应釜中。搅拌混合均匀后，于134℃反应3小时。反应结束后，自然冷却至室温。磁分离除去上清液，再用离心法清洗五次，即得对照材料Fe3O4-PEI纳米颗粒。其紫外吸收图谱见图2，表征说明见实施例1。
对比例2
取60mg mPEG-COOH、19.17mg EDC和11.51mg NHS于一反应瓶中，加入5mL超纯水使其溶解，然后磁力搅拌反应3h。取50mg PEI溶解于5mL超纯水。将活化的mPEG-COOH水溶液（5mL）逐滴加入到上述5mL的PEI水溶液中，并搅拌反应三天。将反应混合液用截留分子量14000的透析袋对蒸馏水透析三天（6次，2L/次），除去副产物和杂质，将产物mPEG-PEI冷冻干燥后储存在-20℃备用。取HAuCl450mg，溶于超纯水中，磁力震荡使之充分溶解均匀，配制成浓度为30mg/mL的溶液。将上述合成的mPEG-PEI溶解于10mL超纯水中。加入5.4mL HAuCl4溶液（30mg/mL），搅拌半小时。然后向其中加入冰浴处理的0.9mLNaBH4（45.4mg）溶液（乙醇/超纯水，v/v=1:2），继续搅拌两小时后，再用截留分子量14000的透析袋对蒸馏水透析三天（6次，2L/次），即得到对照材料mPEG-PEI-Au纳米颗粒。其紫外吸收图谱见图2，TEM图片见图4，表征说明见实施例1，4。
对比例3
用2mL超纯水将Fe(II)盐（125mg）溶解，再加入0.625mLNH3·H2O，并于空气气氛下搅拌10分钟。将混合溶液转移到高压反应釜中，并将对比例2中制备的mPEG-PEI-Au水溶液（20mL）也加入到高压反应釜中，搅拌混合均匀后，于134℃下反应3小时。反应结束后，产物自然冷却至室温，磁分离除去上清液，再用离心法清洗五次，即得到对照材料Fe3O4-PEI-mPEG-Au，材料表征见实施例1-3。

Claims (10)

1.一种Fe3O4/Au复合纳米颗粒的制备方法，包括：
（1）将甲氧基聚乙二醇mPEG-COOH、EDC和NHS混合，溶于水中，搅拌反应3-5h，然后加入聚乙烯亚胺PEI水溶液中，搅拌反应2-3d，透析，冷冻干燥，得到mPEG-PEI；其中mPEG-COOH、EDC、NHS的摩尔比为1:5:5，mPEG-COOH和PEI的摩尔比为15:1；
（2）将上述mPEG-PEI溶于溶于水中，加入HAuCl4溶液，搅拌30-60min，然后加入冰浴处理的NaBH4溶液，搅拌2-4h，透析，得到mPEG-PEI-Au纳米颗粒；其中PEI和HAuCl4的摩尔比为1:200；
（3）将Fe(II)盐溶解在水中，加入NH3·H2O，在空气气氛条件下，搅拌10-20min，加入mPEG-PEI-Au水溶液，搅拌混合后进行水热反应，反应温度为130-135℃，反应时间为2-4h，自然冷却至室温，离心洗涤，得到PEI包裹的Fe3O4/Au复合纳米颗粒Fe3O4-PEI-mPEG-Au；其中Fe(II)盐、水、NH3·H2O的配比为125mg:2mL:0.625mL，Fe(II)盐和mPEG-PEI-Au中PEI的质量比为2.5:1；
（4）将Fe3O4-PEI-mPEG-Au纳米颗粒水溶液中加入三乙胺，搅拌30-60min，然后加入乙酸酐，搅拌反应24-48h，离心洗涤，即得乙酰化的Fe3O4-PEI-Ac-mPEG-Au纳米颗粒，其中三乙胺、乙酸酐与Fe3O4/Au复合纳米颗粒表面的PEI上伯氨基摩尔比为5:5:1。
2.根据权利要求1所述的一种Fe3O4/Au复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中mPEG-COOH的分子量为2000。
3.根据权利要求1所述的一种Fe3O4/Au复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中聚乙烯亚胺PEI的分子量为25000。
4.根据权利要求1所述的一种Fe3O4/Au复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中HAuCl4溶液的浓度为30mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种Fe3O4/Au复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）和（2）中透析为用截留分子量14000的透析袋对蒸馏水透析2-5天。
6.根据权利要求1所述的一种Fe3O4/Au复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中NaBH4溶液的溶剂为体积比为1:2的乙醇和超纯水混合液。
7.根据权利要求1所述的一种Fe3O4/Au复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中Fe(II)盐为FeCl2·4H2O。
8.根据权利要求1所述的一种Fe3O4/Au复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中离心洗涤方法为：磁分离除去上清液，再加超纯水超声分散，再离心分离，重复超纯水洗涤3-5次。
9.根据权利要求1所述的一种Fe3O4/Au复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中三乙胺的密度为0.726～0.729g/mL，体积百分浓度为99.0%。
10.根据权利要求1所述的一种Fe3O4/Au复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中乙酸酐的密度为1.08g/mL，体积百分浓度为98.5%。
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