CN102911373A - 一种hpei包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种HPEI包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒的制备方法，包括：将Fe源加入超纯水中，再加入NH₃·H₂O并于空气中搅拌，再加入HPEI，铁源与HPEI质量比为1-5:1，于134～140℃反应3小时；冷却，将沉淀洗涤磁分离后，即得HPEI包裹的四氧化三铁纳米颗粒Fe₃O₄/HPEI；然后对Fe₃O₄/PEI纳米颗粒进行不同的表面修饰，如聚乙二醇（PEG）化、乙酰化和羧基化，增加其生物相容性用于MRI成像诊断。本发明工艺简单，反应条件温和，易于操作分离；制备的氧化铁磁性纳米颗粒具有良好的生物相容性和T₂弛豫效应，在MRI成像诊断领域具有潜在的应用价值。

Description

一种HPEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法

技术领域

本发明属于氧化铁磁性纳米颗粒的制备领域，特别涉及一种HPEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备及改性方法。 

背景技术

近年来，四氧化三铁磁性纳米颗粒(Fe₃O₄)被广泛地应用于各种生物医学领域，如细胞分离与纯化、磁控抗癌药物输送、肿瘤磁热疗以及核磁共振成像（MRI）。迄今为止，Fe₃O₄大致可以分为液相法和固相法两种合成方法，其区别是液相法在液相中进行合成反应，而固相法则在没有溶液过程就能够生成目标产物。固相法又分为球磨法和高温热分解法。但所制备的样品产品纯度不高，颗粒分布杂乱，易发生氧化反应。液相法有水热合成法、溶胶-凝胶法、化学共沉淀法、水解法和电化学法四种类型。液相法制备的纳米微粒通常颗粒度不大，操作方法容易，且有着较低的生产成本。而近年来发展的水热法已被证明是合成高质量磁性晶粒的有效方法之一。在其反应和晶体生长过程中，水热条件下减少了聚集的发生，从而形成单晶的四氧化三铁晶粒。所合成的纳米粒子在溶液中具有良好分散性、粒径分布窄、晶形好和副产品少等优点。另外，在反应溶剂中添加表面活性剂，可以有效地分离晶核，并在随后的晶体生长过程中干预晶化过程，从而缩小颗粒大小分布范围和减小颗粒直径。裸露的四氧化三铁纳米颗粒因为高的化学反应活性非常容易氧化，同时大的比表面积使纳米颗粒容易聚集而导致磁性和分散性降低，此外，在与人体内pH值相当的环境中，纳米级的铁氧化物颗粒也易聚集，限制了其推广及应用。迄今为止，解决方法是：用物理、化学方法处理纳米颗粒表面，在粒子表面通常包覆一层无机或有机物，提升其稳定性、水分散性与生物相容性。现在通常的改性方法还有表面化学改性法、溶胶-凝胶改性法、沉淀反应改性法、聚合物包覆改性法、自组装改性法等。 

之前用一步水热合成法合成了一种APTS修饰的氧化铁磁性纳米材料，该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作分离；制备的氧化铁磁性纳米颗粒能够长时间地分散在水基溶液中，没有团聚现象发生，在MRI成像诊断中具有潜在的应用价值（沈明武，蔡红东，史向阳。一种APTS修饰的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法。中国发明专利，申请号：201110104443.1，申请日期：2011/4/26）。但制备的APTS修饰的氧化铁磁性纳米材料尺寸太小（6.5nm），颗粒直径难以控制。 

而超支化聚乙烯亚胺（Hyperbranched Polyethyleneimine，HPEI）不仅能够提高纳米颗粒的水溶液分散性，而且有众多的表面氨基，可用于纳米材料表面的进一步官能化修饰。Shen 等用HPEI修饰羧基化的多壁碳纳米管，改善了碳纳米管的水溶液分散性，同时又通过乙酰化和羧基化，以改变其表面电荷性能，得到表面电中性和携带负电荷的碳纳米管材料，并研究了其体外细胞毒性，结果表明HPEI修饰的碳纳米管由于氨基的作用显示出细胞毒性，而经过乙酰化和羧基化后的衍生物则没有明显的细胞毒性（Shen,J.Phys.Chem.C 2009.MWCNTs）。 

PEG(聚乙二醇)是一种生物相容良好的聚合物，作为包覆材料修饰纳米颗粒表面可以减少蛋白质的吸附和巨噬细胞的摄取，从而延长纳米颗粒在体内的半衰期，PEG已被广泛地应用于生物医学领域。PEG的引入能增强纳米颗粒的亲水性及水溶性，提升其生物相容性及延长血液循环时间。Peng等利用PEG修饰树状大分子，以此为模板，制备树状大分子包裹金纳米颗粒用于CT成像，有效地提高了金的上载量，并改善了材料的生物相容性，能较好地用于荷瘤鼠体内CT成像（Peng,Biomaterials，2011，[(Au⁰)_n-G5.NHAc-mPEG₂₀]DENPs）。 

检索国内外有关HPEI保护的Fe₃O₄纳米颗粒合成的文献和专利结果表明，用一步水热合成法合成HPEI保护的Fe₃O₄纳米粒子并对其表面有效地修饰和改性的研究还未见相关报道。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种HPEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法，该法工艺简单，反应条件温和，易于操作分离，制备的氧化铁磁性纳米颗粒能够长时间地分散在水溶液中，没有团聚现象发生；所用的修饰剂HPEI为廉价和环境友好材料，具有产业化实施的前景；此法形成的Fe₃O₄/HPEI表面还可进一步功能化和改性，提高其稳定性以及生物相容性，在MRI成像诊断中有潜在的应用价值。 

本发明的一种HPEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法，包括： 

（1）将Fe源加入超纯水中，再加入NH₃·H₂O并于空气中搅拌，再加入0.02-0.12g/mL的超支化聚乙烯亚胺HPEI水溶液，于134~140℃反应3小时；反应结束后，自然冷却至室温，将沉淀洗涤磁分离后，即得HPEI包裹的四氧化三铁纳米颗粒Fe₃O₄/HPEI； 

（2）Fe₃O₄/HPEI与甲氧基聚乙二醇羧酸（mPEG-COOH）进行PEG化反应：将甲氧基聚乙二醇羧酸（mPEG-COOH）和1-（3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐（EDC）分别溶解于3-6mL DMSO中，搅拌活化3h后，再加入步骤（1）制备的Fe₃O₄/HPEI，振荡3天，再用水磁分离洗涤，再分散入水或PBS中，得到PEG化的Fe₃O₄/HPEI.PEG纳米颗粒； 

或Fe₃O₄/HPEI与乙酸酐进行乙酰化反应：将步骤（1）制备的Fe₃O₄/HPEI纳米颗粒均匀分散在水中，与三乙胺充分混合后，逐滴加入乙酸酐。搅拌反应24~48小时，用水磁分离洗涤，制得乙酰化的Fe₃O₄/HPEI.Ac纳米颗粒； 

或Fe₃O₄/HPEI与琥珀酰酐进行羧基化反应：将步骤（1）制备的Fe₃O₄/HPEI纳米颗粒均匀分散在DMSO中，逐滴加入含琥珀酸酐的DMSO溶液，搅拌反应24~48小时，用水磁分离洗涤，制得羧基化的表面为负电荷的Fe₃O₄/HPEI.SAH纳米颗粒。 

所述步骤（1）中的Fe源为FeCl₂·4H₂O。 

所述步骤（1）中的Fe源、超纯水、NH₃·H₂O的配比为1g:6-51mL:5mL。 

所述步骤（1）中的铁源与超支化聚乙烯亚胺HPEI质量比为1-5:1。 

所述步骤（1）中的NH₃·H₂O质量百分比浓度为25-28%。 

所述步骤（1）中的超支化聚乙烯亚胺HPEI的分子量Mw=25000。 

所述步骤（2）中的甲氧基聚乙二醇羧酸（mPEG-COOH）的分子量为2000。 

所述步骤（2）中的甲氧基聚乙二醇羧酸（mPEG-COOH）与包裹在四氧化三铁磁性纳米颗粒表面的氨基的摩尔比为1:5-10。 

所述步骤（2）中的乙酸酐或琥珀酸酐与Fe₃O₄/PEI中的-NH₂的摩尔比为5-10:1。 

所述步骤（2）中的三乙胺、乙酸酐与Fe₃O₄/PEI中的-NH₂摩尔比为5:5:1。 

本发明利用聚乙烯亚胺进行一步水热法合成尺寸可控的HPEI包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒，并可进一步对其表面进行修饰和功能化。利用超支化聚合物超支化聚乙烯亚胺HPEI来修饰和稳定化氧化铁磁性材料，有望通过HPEI和铁盐的投料比控制合成纳米氧化铁颗粒的尺寸，同时利用聚乙烯亚胺HPEI的氨基可被修饰的优点可对氧化铁纳米颗粒表面进一步修饰改性。 

本发明研究不同参数对Fe₃O₄材料表面修饰、尺寸、形状、结构、以及稳定性的影响，如不同体积的水和氨水，不同质量比例的FeCl₂·4H₂O和超支化聚乙烯亚胺，首先将FeCl₂·4H₂O在空气中氧化后，在高压下于134℃并在HPEI存在下，水热合成HPEI保护的四氧化三铁纳米颗粒。合成的HPEI保护的Fe₃O₄纳米颗粒尺寸为11-22nm，随后将纳米颗粒外围HPEI的氨基进行PEG化、乙酰化和羧基化，以提高其生物相容性，该方法制备的氧化铁纳米颗粒可潜在用于MRI分子影像诊断。 

本发明使用透射电子显微镜（TEM）、X-射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、热重分析（TGA）、电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）以及Zeta电势及光散射动力学等方法表征制备的磁性纳米颗粒，纳米颗粒T₂弛豫性能通过磁共振成像仪测得，同时利用稳定性测试、血液相容性、MTT法来检验纳米颗粒的稳定性、血液相容性以及细胞毒性， 具体测试结果如下： 

（1）X-射线衍射（XRD）的测试结果 

通过对衍射图谱的比较和分析，所合成的材料和Fe₃O₄的图谱(ICSD 20-596)一致，表明HPEI修饰的Fe₃O₄晶体结构没有改变，产物为四氧化三铁。另外，根据Debye-Scherrer公式（D=kλ／βcosθ，λ=0.15406nm），取最大峰处（311）计算得到： 

Fe₃O₄/HPEI(1):11.5nm； 

Fe₃O₄/HPEI(2):17.5nm； 

Fe₃O₄/HPEI(3):18.3nm； 

Fe₃O₄/HPEI(4):18.9nm。 

参考附图1和表1； 

（2）热重分析（TGA）测试结果 

为了比较四种不同原料配比一步法所合成的Fe₃O₄纳米颗粒表面HPEI的修饰量，对水热法合成的Fe₃O₄和一步法合成的Fe₃O₄/HPEI进行了TGA测试。由图2可以看出，跟纯氧化铁比较，1号样品中HPEI的上载率最高，为9.69%，3号样品中HPEI的上载率最低，为7.34%，从图3可看出，1号和3号样品按HPEI表面氨基与PEG摩尔比例5:1反应后进行热重测试；1号Fe₃O₄/HPEI.PEG（图3a）失重为14.87%；3号Fe₃O₄/HPEI.PEG（图3b）失重为10.70%。因此可计算出，1号Fe₃O₄/HPEI.PEG和3号Fe₃O₄/HPEI.PEG的PEG的上载率分别为5.18%和3.36%，由此表明1和3号样品已成功地被PEG修饰上去。可见，由本法合成的HPEI修饰的纳米颗粒表面含有更加密集的氨基，可按照不同的生物医学应用要求进一步进行功能化或表面修饰。TGA测试结果表明HPEI和PEG成功地修饰在Fe₃O₄纳米颗粒表面上。参考附图2和3； 

（3）傅里叶变换红外光谱（FTIR）的测试结果 

Fe₃O₄/HPEI及纯Fe₃O₄的FTIR谱图如图4所示。对于Fe₃O₄/HPEI纳米颗粒来说，2930和2850cm^-1为C-H的伸缩振动，1126cm^-1为C-N键伸缩振动。此外，3450和1630cm^-1处的吸收峰则归因于-NH₂和样品中的残余水。和纯Fe₃O₄纳米颗粒相比，由于-NH₂的存在，Fe₃O₄/HPEI在3450和1630cm^-1处吸收峰面积较大。FTIR结果表明HPEI成功地修饰在Fe₃O₄纳米颗粒表面上。参考附图4； 

（4）透射电子显微镜（TEM）测试结果 

TEM测试结果显示Fe₃O₄/HPEI的形貌为球形或准球形，通过对Fe₃O₄/HPEI纳米颗粒分别随机测量200-300个纳米颗粒的直径计算得到1号样品的平均直径为11.50Hnm；2号样品平均直径为20.2nm；3号样品平均直径为16.7nm；4号样品平均直径为21.8nm。结果表明1 号样品的尺寸较小，2-4号样品的平均直径相对较大，不同用量的HPEI对材料的尺寸大小影响不大，但FeCl₂`4H₂O的用量对颗粒的结构和尺寸有一定的影响，相对1号样品，2-4号的结构晶型更规整均一，尺寸更大。这些尺寸结果与XRD测试结果相一致。TEM图中可以看出颗粒外围有一层大分子壳层包围，表明HPEI均匀地修饰在Fe₃O₄纳米颗粒表面。参考附图5和表1； 

1H相对于未修饰PEG的1和3号样品，因为颗粒外围的PEG的修饰，导致Fe₃O₄/HPEI.PEG尺寸略微增大，且从TEM图可以肉眼看出颗粒外围的大分子层增厚，结合TG（图2，3）结果，都证明了PEG成功修饰到颗粒表面。参考附图6和表2； 

（5）纳米颗粒Zeta电势及光散射测试结果 

纳米颗粒的外围氨基可产生细胞毒性并与细胞膜非特异性结合，从而限制了这些纳米颗粒的生物应用。我们以前的研究发现，中和修饰在多壁碳纳米管表面的聚乙烯亚胺的氨基，可以有效降低多壁碳纳米管的毒性（Shen,J.Phys.Chem.C 2009.MWCNTs，113(8):3150-3156）。同样，我们通过对Fe₃O₄/HPEI外围氨基进行PEG化、乙酰化和羧基化，使其表面电势呈中性或带负电荷，改善纳米颗粒的生物相容性。 

电势测定结果（表3）表明，由于外围存在大量的氨基，1号Fe₃O₄/HPEI的表面电势约为38mV。经过乙酰化反应之后，电势降至约为26mV，电势有明显下降，但是还未达到电中性，可能是由于HPEI部分氨基和氧化铁相互作用，使得他们的反应活性减弱，无法完全乙酰化，所以还呈现一部分正电性，但是由于他们和氧化铁作用，所以对细胞的毒性并不会像单纯的HPEI一样。而羧基化反应后颗粒表面电势呈负电，1号Fe₃O₄/HPEI电势从38.07mV降为-17.3mV，结果显示，羧基化反应成功，氨基充分反应。而经过PEG化反应后，Fe₃O₄/HPEI.PEG的电势也下降。这些结果说明了PEG化、乙酰化和羧基化反应的成功实施。参考附表3； 

（6）稳定性测试 

稳定性测试研究表面经过不同修饰及带不同电荷材料在不同介质中的稳定性。首先分别将1号的Fe₃O₄/HPEI、Fe₃O₄/HPEI.Ac、Fe₃O₄/HPEI.SAH以及Fe₃O₄/HPEI.PEG四种材料，放置于纯水、PBS缓冲液（pH 7.4）和培养基中放置一个星期后，Fe₃O₄/HPEI、Fe₃O₄/HPEI.Ac、Fe₃O₄/HPEI.PEG分散稳定，没有沉淀和聚集发生，说明Fe₃O₄/HPEI，乙酰化后及PEG化后的衍生物在溶液中具有良好的分散性和稳定性。而表面带负电的羧基化材料出现一定的聚集现象，但在水溶液中仍很容易地被分散。 

（7）T₂弛豫率测量结果 

Fe₃O₄纳米材料为一种MRI阴性造影剂，能降低信号强度。弛豫率(r₂)反映了纳米粒子作 为MRI造影剂的效率，为每毫摩尔铁的横向弛豫时间，可通过弛豫时间（T₂）的倒数计算得到。图7a和b分别为1号和3号Fe₃O₄/HPEI材料相应的线性拟合图，可以看出Fe₃O₄/HPEI材料的弛豫率随着铁浓度的增加（在0-0.02mM浓度范围内）具有很好的线性相关系数。从线性关系图可知，Fe₃O₄/HPEI材料即使外围修饰上PEG，也没有阻挡了其与质子的接触率，对弛豫率没太大影响，且都具有良好的弛豫率（130-160mM^-1s^-1）。因此，本发明所合成的Fe₃O₄/HPEI和Fe₃O₄/HPEI.PEG纳米材料可作为优良T₂信号衰减造影剂，有望应用于MRI分子影像学诊断；参考附图7。 

（8）血液相容性 

为了便于材料能更好地用于体内生物成像，本试验测定了1号Fe₃O₄/HPEI材料经过不同修饰和带不同电荷后的血液相容性。图8中显示了1号Fe₃O₄/HPEI（图8a）、Fe₃O₄/HPEI.PEG（图8b）、Fe₃O₄/HPEI.Ac（图8c）以及Fe₃O₄/HPEI.SAH（图8d）在不同浓度50、100、200、400μg/mL下的溶血性测试结果。通过对上层清液的吸光度进行测量来定量评价样品的溶血性。如图8右上角紫外图谱显示，在达到400μg/mL条件下，Fe₃O₄/HPEI、Fe₃O₄/HPEI.PEG和Fe₃O₄/HPEI.Ac的溶血百分率都小于5%，但Fe₃O₄/HPEI.SAH的溶血率为7.65%。而在低于200μg/mL时，所有材料的溶血率都非常低，因而可使它们成功地用于生物体内成像；参考附图8。 

（9）MTT细胞活力测试结果 

通过MTT比色法测定KB细胞（一种人类上皮癌的细胞株）的活力检测所合成材料以及表面经过不同功能化修饰后的细胞毒性。KB细胞分别与Fe₃O₄/HPEI、Fe₃O₄/HPEI.PEG、Fe₃O₄/HPEI.Ac以及Fe₃O₄/HPEI.SAH在浓度为10、25、50和100μg/mL和37℃下共培养24小时。然后，经MTT处理后在570nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的增殖及活力。不同浓度下材料对细胞增殖的影响与对照组（缓冲液PBS，pH 7.4）的统计比较，则通过单因素方差分析方法实施。与对照组相比，表面经过修饰和功能化的Fe₃O₄/HPEI.PEG、Fe₃O₄/HPEI.Ac和Fe₃O₄/HPEI.SAH在试验浓度0到100μg/mL范围内对KB细胞的存活率没有显着性差异。而Fe₃O₄/HPEI在剂量达到50μg/mL时开始出现细胞毒性（p<0.05），这表明其在高浓度时不利于细胞的增殖，可能是由于表面的HPEI对细胞有毒性以及表面高正电荷对细胞生长有一定影响。而表面经过修饰和功能化的Fe₃O₄/HPEI.PEG、Fe₃O₄/HPEI.Ac和Fe₃O₄/HPEI.SAH则具有良好的生物相容性，便于各种生物医学应用；参考附图9。 

有益效果

（1）本发明采用简单的、HPEI辅助的“一步”水热法来合成水溶性良好的HPEI保护的Fe₃O₄纳米粒子，此法还可通过控制不同原料配比来合成不同尺寸的氧化铁磁性纳米颗粒， 工艺简单，反应条件温和，易于操作分离，所用的修饰剂为廉价和环境友好的聚乙烯亚胺材料，具有产业化实施的前景； 

（2）本发明制备的氧化铁磁性纳米颗粒能够长时间地分散在水基溶液中，没有团聚现象发生，且PEG化、乙酰化和羧基化的氧化铁磁性纳米颗粒具有良好的生物相容性和较高的T₂弛豫率，可潜在地应用于MRI成像诊断。 

附图说明

图1是本发明制备的Fe₃O₄/HPEI的X射线衍射图；Fe₃O₄/HPEI(1-4)分别为1-4号样品； 

图2是本发明制备的Fe₃O₄及Fe₃O₄/HPEI的热重分析图；Fe₃O₄/HPEI(1-4)分别为1-4号样品；Naked Fe₃O₄为对比例1制备的未保护的纯Fe₃O₄； 

图3是本发明制备的1和3号Fe₃O₄/HPEI经过PEG化后Fe₃O₄/HPEI.PEG的热重分析图；Fe₃O₄为对比例1制备的未保护的纯Fe₃O₄； 

图4是本发明制备的Fe₃O₄及Fe₃O₄/HPEI的傅里叶变换红外光谱图，a、b、c、d及e分别为1号，2号，3号，4号Fe₃O₄/HPEI的红外谱图及未保护的纯Fe₃O₄的红外谱图； 

图5是本发明制备的1(a),2(b),3(c)和4(d)号Fe₃O₄/HPEI的透射电镜图和尺寸分布图； 

图6是本发明制备的1(a)和3(b)号样品经PEG化得到Fe₃O₄/HPEI.PEG的透射电镜图和尺寸分布图； 

图7是本发明制备的1(a)和3(b)号Fe₃O₄/HPEI及Fe₃O₄/HPEI.PEG的弛豫率的线性关系图； 

图8是本发明制备的1号Fe₃O₄/HPEI（a）、Fe₃O₄/HPEI.PEG（b）、Fe₃O₄/HPEI.Ac（c）以及Fe₃O₄/HPEI.SAH（d）（浓度范围50-400μg/mL）的溶血实验紫外图谱； 

图9是MTT法测试的KB细胞经过PBS缓冲液（对照）、Fe₃O₄/HPEI、Fe₃O₄/HPEI.PEG、Fe₃O₄/HPEI.Ac和Fe₃O₄/HPEI.SAH纳米颗粒（浓度范围在0-100μg/mL）处理24小时后的细胞活力。 

图10是超支化聚乙烯亚胺HPEI的分子结构式。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

实施例1 

将1.2519g FeCl₂·4H₂O加入烧杯中，加入7.75mL的超纯水（电阻率大于18.2MΩ.cm），在不断搅拌中，加入6.25mL NH₃·H₂O，将上述混合液在空气中连续搅拌10分钟，从而保证二价铁充分被氧化，接着将反应物转移到反应釜中。将0.53879g HPEI溶于5mL水溶液中， 超声溶解后，用移液枪将其转入反应釜中，与反应釜中溶液充分混匀，于134~140℃反应约3小时；反应结束后，自然冷却至室温，将所得到的黑色沉淀Fe₃O₄/HPEI分散于超纯水中、磁分离，再次分散、磁分离，如此重复五次纯水洗涤，以去除过量的反应试剂，重新分散于水相中，即得聚乙烯亚胺保护的四氧化三铁纳米颗粒（1号Fe₃O₄/HPEI）；参考表1； 

通过XRD、TG、FTIR、TEM、Zeta测试方法表征1号Fe₃O₄/HPEI材料，XRD结果显示了1号Fe₃O₄/HPEI纳米颗粒的晶体结构没有改变，产物为四氧化三铁。另外，根据Debye-Scherrer公式（D=kλ／βcosθ，λ=0.15406nm），取最大峰处（311）计算得到1号Fe₃O₄/HPEI尺寸11.5nm（参考表1和附图1）；跟纯氧化铁比较，1号Fe₃O₄/HPEI中HPEI的上载率为9.69%，由此表明1号Fe₃O₄/HPEI的HPEI成功地修饰上去（参考附图2）。并进一步通过FTIR谱图表征1号Fe₃O₄/HPEI及纯Fe₃O₄样品，对于1号Fe₃O₄/HPEI纳米颗粒来说，2930和2850cm^-1为C-H的伸缩振动，1126cm^-1为C-N键伸缩振动。此外，3450和1630cm^-1处的吸收峰则归因于-NH₂和样品中的残余水。和纯Fe₃O₄纳米颗粒相比，由于-NH₂的存在，1号Fe₃O₄/HPEI在3450和1630cm^-1处吸收峰面积较大，定性地表明HPEI成功地修饰上去（参考附图4a和4e）。TEM结果显示Fe₃O₄/HPEI的形貌为球形或准球形，通过对1号Fe₃O₄/HPEI纳米颗粒随机测量200-300个纳米颗粒的直径，计算得到1号Fe₃O₄/HPEI的平均直径为11.53Hnm，尺寸结果与XRD结果相一致，氧化铁外围有层大分子透明物质包裹也进一步表明HPEI成功地修饰在氧化铁表面（参考附图5a和表1）。Zeta测试结果显示1号Fe₃O₄/HPEI带正电（38.07mV），水动力学直径约为310.4nm（参考附表3）。这些结果都表明HPEI均匀地修饰在Fe₃O₄纳米颗粒表面上。 

实施例2 

（1）将0.252g FeCl₂·4H₂O加入烧杯中，再加入12.75mL的超纯水（电阻率大于18.2MΩ.cm）中，在不断搅拌中，加入1.25mL NH₃·H₂O，将上述混合液在空气中连续搅拌10分钟，从而保证二价铁充分被氧化，接着将反应物转移到反应釜中。将0.05153g HPEI溶于5mL水溶液中，超声溶解后，用移液枪将其转入反应釜中，与反应釜中溶液充分混匀，于134~140℃反应约3小时；参考表1；反应结束后，自然冷却至室温，将所得到的黑色沉淀Fe₃O₄/HPEI分散于超纯水中、磁分离，再次分散、磁分离，如此重复五次纯水洗涤，以去除过量的反应试剂，重新分散于水相中。即得聚乙烯亚胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒2号Fe₃O₄/HPEI；参考附表1； 

通过XRD、TG、FTIR、TEM测试方法表征材料2号Fe₃O₄/HPEI，XRD结果显示了HPEI修饰的2号Fe₃O₄/HPEI纳米颗粒的晶体结构没有改变，产物为四氧化三铁。另外，根据Debye-Scherrer公式（D=kλ／βcosθ，λ=0.15406nm），取最大峰处（311）计算得到2号Fe₃O₄/HPEI 尺寸17.5nm（参考表1和附图1）；跟纯氧化铁比较，2号Fe₃O₄/HPEI中HPEI的上载率为8.13%，由此表明2号Fe₃O₄/HPEI的HPEI成功地修饰上去（参考附图2）。并进一步通过FTIR谱图表征2号Fe₃O₄/HPEI及纯Fe₃O₄样品，对于2号Fe₃O₄/HPEI纳米颗粒来说，2930和2850cm^-1为C-H的伸缩振动，1126cm^-1为C-N键伸缩振动。此外，3450和1630cm^-1处的吸收峰则归因于-NH₂和样品中的残余水。和纯Fe₃O₄纳米颗粒相比，由于-NH₂的存在，2号Fe₃O₄/HPEI在3450和1630cm^-1处吸收峰面积较大，定性地表明HPEI成功地修饰上去（参考附图4b和4e）。TEM结果显示Fe₃O₄/HPEI的形貌为球形或准球形，外围通过对2号Fe₃O₄/HPEI纳米颗粒随机测量200-300个纳米颗粒的直径，计算得到2号Fe₃O₄/HPEI的平均直径为20.24Hnm，氧化铁外围有层大分子透明物质包裹也进一步表明HPEI成功地包裹在氧化铁表面（参考附图5b和表1）。这些结果都表明HPEI均匀地修饰在Fe₃O₄纳米颗粒表面上。 

实施例3 

（1）将0.25294g FeCl₂·4H₂O加入烧杯中，在加入12.75mL的超纯水（电阻率大于18.2MΩ.cm）中，在不断搅拌中，加入1.25mLNH₃·H₂O，将上述混合液在空气中连续搅拌10分钟，从而保证二价铁充分被氧化，接着将反应物转移到反应釜中。将0.1037g HPEI溶于5mL水溶液中，超声溶解后，用移液枪将其转入反应釜中，与反应釜中溶液充分混匀，于134~140℃反应约3小时；参考表1； 

（2）反应结束后，自然冷却至室温，将所得到的黑色沉淀Fe₃O₄/HPEI分散于超纯水中、磁分离，再次分散、磁分离，如此重复五次纯水洗涤，以去除过量的反应试剂，重新分散于水相中。即得聚乙烯亚胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒3号Fe₃O₄/HPEI；参考附表1； 

通过XRD、TG、FTIR、TEM、Zeta电势等测试方法表征材料3号Fe₃O₄/HPEI，XRD结果显示了HPEI修饰的3号Fe₃O₄/HPEI纳米颗粒的晶体结构没有改变，产物为四氧化三铁。另外，根据Debye-Scherrer公式（D=kλ／βcosθ，λ=0.15406nm），取最大峰处（311）计算得到3号Fe₃O₄/HPEI尺寸18.3nm（参考表1和附图1）；跟纯氧化铁比较，3号Fe₃O₄/HPEI中HPEI的上载率为7.34%，由此表明3号Fe₃O₄/HPEI的HPEI成功地修饰上去（参考附图2）。并进一步通过FTIR谱图表征3号Fe₃O₄/HPEI及纯Fe₃O₄样品，对于3号Fe₃O₄/HPEI纳米颗粒来说，2930和2850cm^-1为C-H的伸缩振动，1126cm^-1为C-N键伸缩振动。此外，3450和1630cm^-1处的吸收峰则归因于-NH₂和样品中的残余水。和纯Fe₃O₄纳米颗粒相比，由于-NH₂的存在，3号Fe₃O₄/HPEI在3450和1630cm^-1处吸收峰面积较大，定性地表明HPEI成功地修饰上去（参考附图4c和4e）。TEM结果显示Fe₃O₄/HPEI的形貌为球形或准球形，外围通过对3号Fe₃O₄/HPEI纳米颗粒随机测量200-300个纳米颗粒的直径，计算得到3号Fe₃O₄/HPEI的平均直径为16.75Hnm，尺寸结果与XRD结果相一致，氧化铁外围有层大分子透明物质包裹也进一 步表明HPEI成功地包裹在氧化铁表面（参考附图5c和表1）。Zeta测试结果显示3号Fe₃O₄/HPEI带正电（39.2mV），水动力学直径约为116.3nm。这些结果都表明HPEI均匀地修饰在Fe₃O₄纳米颗粒表面上。 

实施例4 

（1）将0.25278g FeCl₂·4H₂O加入烧杯中，在加入12.75mL的超纯水（电阻率大于18.2MΩ.cm）中，在不断搅拌中，加入1.25mLNH₃·H₂O，将上述混合液在空气中连续搅拌10分钟，从而保证二价铁充分被氧化，接着将反应物转移到反应釜中。将0.21512g HPEI溶于5mL水溶液中，超声溶解后，用移液枪将其转入反应釜中，与反应釜中溶液充分混匀，于134~140℃反应约3小时；参考表1； 

（2）反应结束后，自然冷却至室温，将所得到的黑色沉淀Fe₃O₄/HPEI分散于超纯水中、磁分离，再次分散、磁分离，如此重复五次纯水洗涤，以去除过量的反应试剂，重新分散于水相中。即得聚乙烯亚胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒4号Fe₃O₄/HPEI；参考表1； 

通过XRD、TG、FTIR、TEM等测试方法表征材料4号Fe₃O₄/HPEI，XRD结果显示了HPEI修饰的4号Fe₃O₄/HPEI纳米颗粒的晶体结构没有改变，产物为四氧化三铁。另外，根据Debye-Scherrer公式（D=kλ／βcosθ，λ=0.15406nm），取最大峰处（311）计算得到4号Fe₃O₄/HPEI尺寸18.9nm（参考表1和附图1）；跟纯氧化铁比较，4号Fe₃O₄/HPEI中HPEI的上载率为8.31%，由此表明4号Fe₃O₄/HPEI的HPEI成功地修饰上去（参考附图2）。并进一步通过FTIR谱图表征4号Fe₃O₄/HPEI及纯Fe₃O₄样品，对于4号Fe₃O₄/HPEI纳米颗粒来说，2930和2850cm^-1为C-H的伸缩振动，1126cm^-1为C-N键伸缩振动。此外，3450和1630cm^-1处的吸收峰则归因于-NH₂和样品中的残余水。和纯Fe₃O₄纳米颗粒相比，由于-NH₂的存在，4号Fe₃O₄/HPEI在3450和1630cm^-1处吸收峰面积较大，定性地表明HPEI成功地修饰上去（参考附图4d和4e）。TEM结果显示4号Fe₃O₄/HPEI的形貌为球形或准球形，与1-3号Fe₃O₄/HPEI比较，4号Fe₃O₄/HPEI晶体结构更加规整，均一。并通过对4号Fe₃O₄/HPEI纳米颗粒随机测量200-300个纳米颗粒的直径，计算得到4号Fe₃O₄/HPEI的平均直径为21.86Hnm（参考附图5d和表1）。这些结果都表明HPEI均匀地修饰在Fe₃O₄纳米颗粒表面上。 

表1不同材料配比合成不同尺寸的Fe₃O₄/HPEI 

注：a为TEM结果，b为XRD结果。 

实施例5 

取1号Fe₃O₄/HPEI进行PEG化反应，按Fe₃O₄/HPEI表面氨基与mPEG-COOH的摩尔比例（5:1）进行PEG化反应，如表2，首先称取22.03mg的mPEG-COOH和23.00mg EDC分别溶解于3-6mL DMSO中，搅拌活化3h后，再加入至上述制备的1号Fe₃O₄/HPEI 2mL水溶液(24.44mg)，摇床反应3天，再用水磁分离洗涤5遍，再分散入水或PBS中，得到1号Fe₃O₄/HPEI.PEG。 

通过TG、TEM、Zeta电势等测试方法表征材料1号Fe₃O₄/HPEI.PEG，结果表明1号Fe₃O₄/HPEI.PEG的失重为14.87%，跟1号Fe₃O₄/HPEI（失重为9.69%）比较，PEG的上载率为5.18%，由此表明1号Fe₃O₄/HPEI.PEG的PEG成功地修饰上去（参考附图3）。TEM结果显示Fe₃O₄/HPEI.PEG的形貌为球形或准球形，通过对1号Fe₃O₄/HPEI.PEG纳米颗粒随机测量200-300个纳米颗粒的直径，计算得到1号Fe₃O₄/HPEI.PEG的平均直径为127Hnm。与未修饰PEG的1号Fe₃O₄/HPEI比较，因为颗粒外围的PEG的修饰，导致Fe₃O₄/HPEI.PEG尺寸略微增大，且从TEM图可以肉眼看出颗粒外围的大分子层增厚，因此进一步证明了PEG成功修饰到颗粒表面（参考附图6a和表2）；Zeta测试结果表明，经过PEG化反应后，显示1号Fe₃O₄/HPEI.PEG仍带正电（30.9mV），与Fe₃O₄/HPEI相比，电势有所下降，水动力学直径约为161.9nm，材料分散更稳定（参考附表3）。这些结果都表明PEG均匀地修饰在Fe₃O₄纳米颗粒表面上。 

实施例6 

取3号Fe₃O₄/HPEI进行PEG化反应，按Fe₃O₄/HPEI表面氨基与mPEG-COOH的摩尔比例（5:1）进行PEG化反应，如表2，首先称取4.124mg的mPEG-COOH和6.82mg EDC分别溶解于3-6mL DMSO中，搅拌活化3h后，再加入上述制备的3号Fe₃O₄/HPEI 2mL水溶液(6.04mg,)，摇床反应3天，再用水磁分离洗涤5遍，再分散入水或PBS中，得到3号Fe₃O₄/HPEI.PEG。 

通过TG、TEM、Zeta电势等测试方法表征材料3号Fe₃O₄/HPEI.PEG，结果表明3号Fe₃O₄/HPEI.PEG的失重为10.70%，跟3号Fe₃O₄/HPEI（失重为7.34%）比较，PEG的上载率为3.36%，由此表明3号Fe₃O₄/HPEI.PEG的PEG成功地修饰上去（参考附图3）。TEM结果显示Fe₃O₄/HPEI.PEG的形貌为球形或准球形，通过对3号Fe₃O₄/HPEI.PEG纳米颗粒随机测量200-300个纳米颗粒的直径，计算得到3号Fe₃O₄/HPEI.PEG的平均直径为18.79Hnm。10H与未修饰PEG的3号Fe₃O₄/HPEI比较，因为颗粒外围的PEG的修饰，导致Fe₃O₄/HPEI.PEG尺寸略微增大，且从TEM图可以肉眼看出颗粒外围的大分子层增厚，因此进一步证明了PEG成功修饰到颗粒表面（参考附图6b和表2）；Zeta测试结果表明，经过PEG化反应后，显示3号Fe₃O₄/HPEI.PEG仍带正电（30.4mV），与Fe₃O₄/HPEI相比，电势有所下降，水动力学直径约为133.93nm，材料分散更稳定。这些结果都表明PEG均匀地修饰在Fe₃O₄纳米颗粒表面上。 

表2PEG化反应合成Fe₃O₄/HPEI.PEG 

注：a为TEM结果。 

实施例7 

取上述制备的1号Fe₃O₄/HPEI水溶液2mL，加入80μL三乙胺（密度为0.726~0.729g/mL，浓度为99.0%）。振荡30分钟充分混合后，逐滴加入60μL乙酸酐（密度为1.08g/mL，浓度为98.5%）（三乙胺、乙酸酐与Fe₃O₄/HPEI中的-NH₂摩尔比=5：5：1），将玻璃瓶放置在TS-2型摇床（金坛市晨阳电子仪器厂）上，摇床反应24~32小时，制得表面乙酰化的1号Fe₃O₄/HPEI.Ac纳米颗粒。 

通过Zeta电势测试方法监控材料1号Fe₃O₄/HPEI.Ac的乙酰化反应，乙酰化反应之后电势降至约为26mV，电势有明显下降，但是还未达到电中性，可能是由于HPEI部分氨基和氧化铁相互作用，使得他们的反应活性减弱，无法完全乙酰化，所以还呈现一部分正电性，但是由于它们和氧化铁作用，所以对细胞的毒性并不会像单纯的HPEI一样。参考附表3； 

实施例8 

取上述制备的1号Fe₃O₄/HPEI 2mL DMSO溶液，通过磁分离，去掉上层溶液，加2mLDMSO，通过超声将纳米颗粒均匀分散在DMSO中，取27.7mg琥珀酸酐溶于4mL DMSO(二甲基亚砜)中，向装有Fe₃O₄/HPEI的玻璃瓶中逐滴加入含琥珀酸酐的DMSO溶液，其中，琥 珀酸酐与Fe₃O₄/HPEI氨基的摩尔比为5:1，摇床反应24~32小时，离心洗涤，制得表面为负电荷的Fe₃O₄/HPEI.SAH纳米颗粒。 

通过Zeta电势测试方法监控材料1号Fe₃O₄/HPEI.SAH的羧基化反应，反应后颗粒表面电势呈负电，1号Fe₃O₄/HPEI电势从38.07mV降为-17.3mV，结果显示，羧基化反应成功，氨基充分反应。参考附表3； 

表31号Fe₃O₄-HPEI以及表面修饰后产物的表面电势与水动力学直径（平均值±标准偏差） 

实施例9 

将上述制备的1号Fe₃O₄/HPEI、1号Fe₃O₄/HPEI.PEG、3号Fe₃O₄/HPEI以及3号Fe₃O₄/HPEI.PEG材料通过ICP-AES测试法测得溶液中Fe元素的含量，再用EP管配制Fe浓度依次为0.002、0.005、0.01以及0.02mM/L的水溶液2mL，通过T₂磁共振成像研究材料的T₂弛豫效应。结果表明这4种材料的弛豫率在铁浓度0-0.05mM浓度范围内随着铁浓度的增加具有很好的线性相关系数。1号Fe₃O₄/HPEI（137.11mM^-1s^-1）、1号Fe₃O₄/HPEI.PEG（157.61mM^-1s^-1）、3号Fe₃O₄/HPEI（156.23mM^-1s^-1）以及3号Fe₃O₄/HPEI.PEG（139.54mM^-1s^-1）四种材料都具有良好的T₂弛豫效应和r₂弛豫率。且Fe₃O₄/HPEI材料即使修饰上高分子层PEG，也没有阻挡了其与质子的接触率，对弛豫率没太大影响，且都具有良好的弛豫率（130-160mM^-1s^-1）。因此，本发明所合成的Fe₃O₄/HPEI和Fe₃O₄/HPEI.PEG纳米材料可作为优良T₂信号衰减造影剂，有望应用于MRI分子影像学诊断，参考附图7。 

实施例10 

为了便于材料能更好地用于体内生物成像，本试验测定了1号Fe₃O₄/HPEI材料经过不同修饰和带不同电荷后的血液相容性。取人血，首先离心(2000rpm/min，5min)并用PBS洗涤5次，收集健康的红细胞。再将1号的Fe₃O₄/HPEI、Fe₃O₄/HPEI.PEG、Fe₃O₄/HPEI.Ac以及Fe₃O₄/HPEI.SAH材料（50-400μg/mL）与红细胞混合静置2小时后，10000rpm/min离心1min后，拍照并测上清液的紫外吸光度。 

图8中显示了1号Fe₃O₄/HPEI（图8a）、Fe₃O₄/HPEI.PEG（图8b）、Fe₃O₄/HPEI.Ac（图 8c）以及Fe₃O₄/HPEI.SAH（图8d）在不同浓度50、100、200、400μg/mL下的溶血结果。对上层清液的吸光度进行测量来定量评价样品的溶血效果。如图8右上角紫外图谱显示，在达到400μg/mL条件下，Fe₃O₄/HPEI、Fe₃O₄/HPEI.PEG和Fe₃O₄/HPEI.Ac的溶血百分率都小于5%，但当材料浓度达到400μg/mL时，Fe₃O₄/HPEI.SAH的溶血率为7.65%。这表明它们在给定浓度范围内具有良好的血液相容性，因而可使它们成功地用于生物体内成像；参考附图8。 

实施例11 

以KB细胞为模型细胞，通过MTT比色法测定KB细胞（一种人类上皮癌的细胞株）的活力检测所合成材料以及表面经过不同功能化修饰后的细胞毒性。KB细胞分别与1号的Fe₃O₄/HPEI、Fe₃O₄/HPEI.PEG、Fe₃O₄/HPEI.Ac以及Fe₃O₄/HPEI.SAH四种材料在浓度为10、25、50和100μg/mL和37℃下共培养24小时。然后，经MTT处理后在570nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的增殖及活力。不同浓度下材料对细胞增殖的影响与对照组（PBS缓冲液，pH 7.4）进行统计比较，通过单因素方差分析方法实施。与对照组相比，表面经过修饰和功能化的Fe₃O₄/HPEI.PEG、Fe₃O₄/HPEI.Ac和Fe₃O₄/HPEI.SAH在试验铁浓度0到100μg/mL范围内对KB细胞的存活率没有显着性差异。而Fe₃O₄/HPEI在剂量达到50μg/mL时开始出现细胞毒性（p<0.05），这表明其在高浓度时不利于细胞的增殖，可能是由于表面的HPEI对细胞有毒性以及表面高正电荷对细胞生长有一定影响。而表面经过修饰和功能化的Fe₃O₄/HPEI.PEG、Fe₃O₄/HPEI.Ac和Fe₃O₄/HPEI.SAH则具有良好的生物相容性，可用于医学应用，参考附图9。 

对比例 

按照文献（Ge等人，J.Phys.Chem.C 2009,113,13593-13599）将1.25g FeCl₂·4H₂O与7.5mL超纯水超声处理后，再加6.5mL NH₃·H₂O在空气中搅拌10min，在高压反应釜中于134℃条件下反应3小时，进行洗涤和磁分离，获得18.5nm直径的Fe₃O₄磁性纳米颗粒； 

Claims (10)

1.一种HPEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法，包括：

（1）将Fe源加入超纯水中，再加入NH₃·H₂O并于空气中搅拌，再加入0.02-0.12g/mL的超支化聚乙烯亚胺HPEI水溶液，于134~140℃反应3小时；反应结束后，自然冷却至室温，将沉淀洗涤磁分离后，即得HPEI包裹的四氧化三铁纳米颗粒Fe₃O₄/HPEI；

（2）Fe₃O₄/HPEI与甲氧基聚乙二醇羧酸进行PEG化反应：将甲氧基聚乙二醇羧酸和1-（3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐分别溶解于3-6mL DMSO中，搅拌活化3h后，再加入步骤（1）制备的Fe₃O₄/HPEI，振荡，再用水磁分离洗涤，再分散入水或PBS中，得到PEG化的Fe₃O₄/HPEI.PEG纳米颗粒；

或Fe₃O₄/HPEI与乙酸酐进行乙酰化反应：将步骤（1）制备的Fe₃O₄/HPEI纳米颗粒均匀分散在水中，与三乙胺充分混合后，逐滴加入乙酸酐，搅拌反应24~48小时，用水磁分离洗涤，制得乙酰化的Fe₃O₄/HPEI.Ac纳米颗粒；

或Fe₃O₄/HPEI与琥珀酰酐进行羧基化反应：将步骤（1）制备的Fe₃O₄/HPEI纳米颗粒均匀分散在DMSO中，逐滴加入含琥珀酸酐的DMSO溶液，搅拌反应24~48小时，用水磁分离洗涤，制得羧基化的表面为负电荷的Fe₃O₄/HPEI.SAH纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的一种HPEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的Fe源为FeCl₂·4H₂O。

3.根据权利要求1所述的一种HPEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的Fe源、超纯水、NH₃·H₂O的配比为1g:6-51mL:5mL。

4.根据权利要求1所述的一种HPEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的Fe源与超支化聚乙烯亚胺HPEI质量比为1-5:1。

5.根据权利要求1所述的一种HPEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的NH₃·H₂O质量百分比浓度为25-28%。

6.根据权利要求1所述的一种HPEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的超支化聚乙烯亚胺HPEI的分子量Mw=25000。

7.根据权利要求1所述的一种HPEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的甲氧基聚乙二醇羧酸的分子量为2000。

8.根据权利要求1所述的一种HPEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的甲氧基聚乙二醇羧酸与包裹在四氧化三铁磁性纳米颗粒表面的氨基的摩尔比为1:5-10。

9.根据权利要求1所述的一种HPEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的乙酸酐或琥珀酸酐与Fe₃O₄/PEI中的-NH2的摩尔比为5-10:1。

10.根据权利要求1所述的一种HPEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的三乙胺、乙酸酐与Fe₃O₄/PEI中的-NH2摩尔比为5:5:1。

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