CN102590174A - 用Fe3O4@Au核壳纳米探针检测生物分子的方法 - Google Patents
用Fe3O4@Au核壳纳米探针检测生物分子的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102590174A CN102590174A CN201210032482XA CN201210032482A CN102590174A CN 102590174 A CN102590174 A CN 102590174A CN 201210032482X A CN201210032482X A CN 201210032482XA CN 201210032482 A CN201210032482 A CN 201210032482A CN 102590174 A CN102590174 A CN 102590174A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- biomolecule
- solution
- detecting
- probe
- peg
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
用Fe3O4Au核壳纳米探针检测生物分子的方法,涉及一种基于表面增强拉曼光谱。先制备Fe3O4Au探针;再制备金探针;最后拉曼检测。优点:可方便利用外加磁场将目标生物分子从复杂的生物样品基质中进行提取、洗涤和浓缩,省去离心,过滤等繁杂的操作,大大提高生物分子检测的效率。具有很好的化学稳定性和生物相容性,可安全使用在生物分子检测中。该探针结合表面增强拉曼光谱,检测体系具有很强的表面增强拉曼信号,通过检测标记分子的增强拉曼信号,实现了对生物分子的快速高灵敏度检测,在实验中检测灵敏度为10-7M。相对于传统的生物方法,该方法操作简单快捷。该方法重现性好,可实现临床样品的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于表面增强拉曼光谱,尤其是涉及一种采用Fe3O4Au核壳纳米探针快速检测生物分子的方法。
背景技术
在生物样品中进行生物分子的快速、准确检测,对获取生命过程中的化学与生物信息、进行生物医学疾病的诊断以及化学分析具有重要的研究意义和实际价值。对生物分子的检测,包括对器官、组织、细胞,甚至DNA、蛋白质等生物大分子的探测。这就要求我们的检测器件必须逐步微型化,同时也要保证检测的高效和灵敏度,这是目前许多传统的生物分析方法所面临的极大挑战。
随着纳米科学技术的飞速发展,采用纳米材料所构成的纳米生物探针成为新一代的生物检测微型器件。其中,磁性纳米粒子和贵金属纳米粒子由于具有独特的物理化学性质和巨大的应用潜力,已经引起了人们广泛的研究兴趣。磁性纳米粒子,如纳米氧化铁(Fe3O4)具有独特的磁学性能和较好的生物相容性,在细胞和生物分子分离,磁共振成像、药物靶向传输和干细胞标记等生物医学领域表现出潜在的应用前景。金纳米粒子具有独有的光学性质(表面等离子体吸收和共振光散射),可以极大地增强表面吸附分子的拉曼散射信号。此外,金纳米粒子具有良好的化学稳定性、生物相容性以及易于对其表面进行生物分子修饰的特点,因而在生物医学领域尤其是结合表面增强拉曼光谱进行生物分子如核酸、蛋白质及其组分等的超灵敏检测中越来越受到重视。然而,由于磁性Fe3O4纳米粒子具有较高的比表面积和强烈的聚集倾向,且化学稳定性不高,易被氧化,在一定程度上限制了其直接应用于生物体系。而以Fe3O4和Au为基本单元构筑的复合纳米材料不仅可以将纳米氧化铁的磁学特性和纳米金的等离子体发光特性和生物相容性集合于一体,赋予其增强的物理化学性能和多元化的功能;而且,更重要的是,核/壳结构的Fe3O4/Au纳米复合物可进一步将“核”和“壳”的优势结合起来,改善磁性纳米材料的分散稳定性并促进表面修饰和生物功能化,进而拓展其在生物医学检测领域的应用潜力。
本申请人在中国专利CN101773810A中公开一种金包覆四氧化三铁纳米颗粒的合成方法,将FeSO4·7H2O、KNO3溶液、NaOH溶液和PEI溶液混溶,放入微波反应器反应,再分散于水中,得四氧化三铁纳米颗粒;将HAuCl4溶液加入超纯水中,再加入柠檬酸三钠,搅拌后加入含NaBH4的柠檬酸三钠,继续搅拌,得金纳米颗粒溶液;在Fe3O4-PEI溶液中加入金纳米颗粒溶液,搅拌,再加入PEI溶液,置于烘箱中,磁性分离洗涤后再分散于去离子水中,加入NaOH,再第一次加入NH2OH·HCl和HAuCl4,其后间隔加入NH2OH·HCl和HAuCl4共4次,每次间隔至少10min。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方便快捷的用Fe3O4Au核壳纳米探针检测生物分子的方法。
本发明采用Fe3O4Au核壳纳米探针,结合表面增强拉曼光谱,方便快捷地检测生物分子的方法。
本发明包括以下步骤:
1)制备Fe3O4Au探针;
2)制备金探针:取Au胶体溶液,加入孔雀石绿(MGITC)溶液,得混合溶液A,再加入HS-PEG-COOH和HS-PEG第1次混合,再离心洗涤悬浮于MES中,接着加入EDC和NHS-Sulfo第2次混合,并加入生物分子B(某一可与检测分子特异性结合的生物分子B),温孵,最后离心洗涤重新分散于PBS缓冲液中;
3)拉曼检测:各取分别修饰有生物分子A和生物分子B的Fe3O4Au和Au溶液混合,加入待检测的生物分子,温孵,磁性分离,重新分散于超纯水中,采用拉曼光谱仪进行检测。
在步骤1)中,所述制备Fe3O4Au探针的具体方法可为:
先制备Fe3O4Au纳米颗粒,在Fe3O4Au溶液中加入HS-PEG-COOH和HS-PEG混合,再离心洗涤,悬浮于2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)中,接着加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(NHS-Sulfo),并加入生物分子A(某一可与检测分子特异性结合的生物分子A),温孵,最后离心洗涤,重新分散于磷酸盐缓冲液(PBS)中;
所述HS-PEG-COOH即为一端修饰羧基的巯基聚乙二醇,HS-PEG即为巯基聚乙二醇。
所述制备Fe3O4Au纳米颗粒可按照中国专利CN101773810A所公开的方法制备,具体方法如下:
(1)四氧化三铁纳米颗粒的制备:称取0.26g FeSO4·7H2O溶于2.5ml 2M/L的KNO3溶液中,加入2.5ml 1M/L的NaOH溶液,搅拌,加入20ml 1~5g/L的分子量为1,800~25,000的PEI溶液,放入微波反应器90℃,反应时间30~120min,反应完后,磁性分离用去离子水洗涤5次,分散于25ml水中保存,最终所得溶液四氧化三铁含量浓度为0.012M(物质量比为FeSO4·7H2O∶KNO3∶NaOH=1.87∶10∶5);
(2)2.6nm金纳米颗粒的制备:参照文献(Brown,K.R.;Walter,D.G.;Natan,M.J.Chem.Mater.2000,12(2),306-313)方法,具体步骤为,量取1ml 1%HAuCl4溶液滴入90ml超纯水中磁力搅拌1min,再滴加2ml柠檬酸三钠(38.8mM)搅拌1min。最后加入1ml新鲜配制含0.075%NaBH4的柠檬酸三钠(38.8mM)。继续磁力搅拌5min。然后置于4℃冰箱保存。
(3)Fe3O4Au纳米颗粒的合成:量取2ml Fe3O4-PEI溶液与金种子溶液机械搅拌90~120min,转速300~600rpm。再加入5g/L PEI 20ml置于50~60℃烘箱60min,磁性分离洗涤5次,最终分散于20ml去离子水中,加入110ml 0.01M的NaOH,第一次加入0.75ml NH2OH·HCl(盐酸羟胺)、0.5ml 1%HAuCl4,其后间隔加入0.5ml NH2OH·HCl、0.5ml 1%HAuCl4共4次,每次间隔10min。最终离心洗涤3次,每次6000rpm 10min。
所述Fe3O4Au溶液的摩尔浓度可为12.3pmol/L,所述Fe3O4Au溶液:HS-PEG-COOH和HS-PEG的摩尔比可为1∶(1~6)∶(1~6),所述HS-PEG-COOH的Mw=486,所述HS-PEG的Mw=2000;所述混合的时间可为0.5~2h;所述MES的摩尔浓度可为10mM;所述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)的摩尔浓度可为0.1M,所述NHS-Sulfo的摩尔浓度可为0.5M;所述生物分子A的摩尔浓度可为6.7μM;所述温孵的条件可于37℃下,温孵3h;所述MES、EDC、NHS、生物分子A和PBS缓冲液的体积比可为1000∶(3~5)∶(1~3)∶(4~6)∶200。
在步骤2)中,所述Au胶体的粒径可为30nm;所述Au溶胶和孔雀石绿溶液的物质量比可为(10-3~10-2)∶1;所述混合溶液A与HS-PEG-COOH和HS-PEG的摩尔比可为1∶(1~6)∶(1~6)),所述HS-PEG-COOH的Mw=486,所述HS-PEG的Mw=2000;所述第1次混合的时间可为0.5~2h;所述MES、EDC、NHS-Sulfo、生物分子B和PBS缓冲溶液的体积比可为1000∶(3~5)∶(1~3)∶(4~6)∶200;所述MES的摩尔浓度可为10mM,所述EDC的摩尔浓度可为0.1M,所述NHS-Sulfo的摩尔浓度可为0.5M;所述第2次混合的时间可为15min~2h;所述生物分子B的摩尔浓度可为6.7μM;所述温孵的条件可为于37℃下温孵3h。
在步骤3)中,所述修饰生物分子之后的Fe3O4Au与Au溶液的体积比可为1∶1;所述温孵的条件可为37℃下温孵1~3h;所述拉曼光谱仪可采用LabRam I型共焦显微拉曼光谱仪,所述检测的条件可为633nm,4mW下进行检测。
本发明提供一种采用Fe3O4Au核壳纳米探针,结合表面增强拉曼光谱,方便快捷地检测检测生物分子的方法。Fe3O4Au纳米颗粒进行表面羧基化修饰后,通过羧基和生物分子A相连接形成捕获探针。而直径为30nm的纳米金颗粒在经过修饰拉曼信号分子后,同样经过羧基化与生物分子B相连形成检测探针。通过捕获探针捕获待检测的生物分子,并与检测探针组成“夹心”结构,即带有拉曼标记分子的Au纳米颗粒就和Fe3O4Au通过目标检测生物分子结合。这样,经过磁性分离,目标生物分子被快速分离收集,并采用拉曼光谱仪进行检测,通过表面增强拉曼信号检测。与其他制备方法相比,该方法具有以下显著的优点:
1)该探针可以方便地利用外加磁场将目标生物分子从复杂的生物样品基质中进行提取、洗涤和浓缩,省去离心,过滤等繁杂的操作,大大提高生物分子检测的效率。
2)该探针具有很好的化学稳定性和生物相容性,可以安全的使用在生物分子检测中。
3)该探针结合表面增强拉曼光谱,检测体系具有很强的表面增强拉曼信号,通过检测标记分子的增强拉曼信号,实现了对生物分子的快速高灵敏度检测,在实验中检测灵敏度为10-7M。
4)相对于传统的生物方法,该方法操作简单快捷。
5)该方法重现性好,可实现临床样品的检测。
附图说明
图1为Fe3O4Au的扫描电镜图片。在图1中,标尺为1μm;由图1中可见单分散性较好,颗粒直径范围在100nm左右。
图2为Au(30nm)颗粒扫描电镜图片。在图2中,标尺为200nm。
图3为Au(30nm)颗粒透射电镜图片。在图3中,标尺为50nm。
由图2和3可见,单分散性较好,颗粒直径范围在30nm左右。
图4为在没有待检测生物分子的空白溶液中,经磁性分离出来的Fe3O4Au-A纳米颗粒、拉曼信号分子的拉曼图谱以及经过磁性分离所检测到的生物分子的拉曼图谱。在图4中,横坐标为拉曼位移Rama shift(cm-1);标尺为500counts s-1mW-1;曲线(a)是在没有待检测生物分子的空白溶液中,经磁性分离出来的Fe3O4Au-A纳米颗粒;曲线(b)代表拉曼信号分子的拉曼图谱;曲线(c)是经过磁性分离,所检测到的生物分子的拉曼图谱。将谱线(c)对照(a)可以明显看出,在检测到目标生物分子后,有明显的拉曼增强信号;而没有检测到目标生物分子时,几乎没有拉曼信号。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1
1)Fe3O4Au探针的制备:首先可按照中国专利CN101773810A所公开的方法制备,具体方法如下:
(1)四氧化三铁纳米颗粒的制备:称取0.26g FeSO4·7H2O溶于2.5ml 2M/L的KNO3溶液中,加入2.5ml 1M/L的NaOH溶液,搅拌,加入20ml 1~5g/L的分子量为(1,800-25,000)的PEI溶液,放入微波反应器90℃,反应时间30~120min。反应完后,磁性分离用去离子水洗涤5次,分散于25ml水中保存,最终所得溶液四氧化三铁含量浓度为0.012M(物质量比为FeSO4·7H2O∶KNO3∶NaOH=1.87∶10∶5)。
(2)2.6nm金纳米颗粒的制备:参照文献【Brown,K.R.;Walter,D.G.;Natan,M.J.Chem.Mater.2000,12(2),306-313.】方法,具体步骤为,量取1ml 1%HAucl4溶液滴入90ml超纯水中磁力搅拌1min,再滴加2ml柠檬酸三钠(38.8mM)搅拌1min。最后加入1ml新鲜配制含0.075%NaBH4的柠檬酸三钠(38.8mM)。继续磁力搅拌5min。然后置于4℃冰箱保存。
(3)Fe3O4Au纳米颗粒的合成:量取2ml Fe3O4-PEI溶液与金种子溶液机械搅拌90~120min,转速300~600rpm。再加入5g/L PEI 20ml置于50~60℃烘箱60min,磁性分离洗涤5次。最终分散于20ml去离子水中,加入110ml 0.01M的NaOH,第一次加入0.75mlNH2OH·Hcl(盐酸羟胺)、0.5ml 1%HAuCl4,其后间隔加入0.5ml NH2OH·HCl、0.5ml 1%HAuCl4共4次,每次间隔10min。最终离心洗涤3次,每次6000rpm 10min。
取所制备的Fe3O4Au溶液1mL(12.3pmol/L),分别加入50HS-PEG-COOH(Mw=486,10μM)和50μL HS-PEG(Mw=2000,10μM),混合2h,并离心洗涤最终悬浮于1mL MES(10mM)中。接着加入EDC 4.75μL(0.1M)和NHS-Sulfo 3.0μL(0.5M)混合2h并加入Biotin-PEO-Amine 5.6μL(6.7μM)。于37℃条件下,温孵3h。最后离心洗涤重新分散于200μL PBS缓冲溶液中。
2)金探针的制备:首先取新制备的粒径为30nm的Au胶体溶液,向其中滴加新配制的孔雀石绿溶液。Au溶胶和孔雀石绿溶液的物质量比为(1.65*10-3∶1)。然后取1ml上述溶液,分别加入15μL HS-PEG-COOH(Mw=486,10μM)和85μL HS-PEG(Mw=2000Da,10μM),混合0.5h,并离心洗涤悬浮于1mL MES(10m M)中。接着加入EDC 3.75μL(0.1M)和NHS-Sulfo 1.89μL(0.5M)混合15min并加入Biotin-PEO-Amine 4.4μL(6.7μM),于37℃条件下,温孵3h。最后离心洗涤重新分散于200μL PBS缓冲溶液中。
3)拉曼检测:各取修饰生物分子之后的Fe3O4Au和Au溶液100μL混合。加入Streptavidin 4.5μL(10.5μM),置于37℃温孵1h。磁性分离,重新分散于200μL超纯水中,采用LabRam I型共焦显微拉曼光谱仪,在633nm,4mW条件下进行检测。
实施例2
1)Fe3O4Au探针的制备:首先可按照中国专利CN101773810A所公开的方法制备,具体方法如下:
(1)四氧化三铁纳米颗粒的制备:称取0.26g FeSO4·7H2O溶于2.5ml 2M/L的KNO3溶液中,加入2.5ml 1M/L的NaOH溶液,搅拌,加入20ml 1~5g/L的分子量为(1,800-25,000)的PEI溶液,放入微波反应器90℃,反应时间30~120min。反应完后,磁性分离用去离子水洗涤5次,分散于25ml水中保存,最终所得溶液四氧化三铁含量浓度为0.012M(物质量比为FeSO4·7H2O∶KNO3∶NaOH=1.87∶10∶5)。
(2)2.6nm金纳米颗粒的制备:参照文献(Brown,K.R.;Walter,D.G.;Natan,M.J.Chem.Mater.2000,12(2),306-313)方法,具体步骤为,量取1ml 1%HAuCl4溶液滴入90ml超纯水中磁力搅拌1min,再滴加2ml柠檬酸三钠(38.8mM)搅拌1min。最后加入1ml新鲜配制含0.075%NaBH4的柠檬酸三钠(38.8mM)。继续磁力搅拌5min。然后置于4℃冰箱保存。
(3)Fe3O4Au纳米颗粒的合成:量取2ml Fe3O4-PEI溶液与金种子溶液机械搅拌90~120min,转速300~600rpm。再加入5g/L PEI 20ml置于50~60℃烘箱60min,磁性分离洗涤5次。最终分散于20ml去离子水中,加入110ml 0.01M的NaOH,第一次加入0.75mlNH2OH·HCl(盐酸羟胺)、0.5ml 1%HAuCl4,其后间隔加入0.5ml NH2OH·HCl、0.5ml 1%HAuCl4共4次,每次间隔10min。最终离心洗涤3次,每次6000rpm 10min。
取所制备的Fe3O4Au溶液1mL(12.3pmol/L),分别加入15HS-PEG-COOH(Mw=486,10μM)和85μL HS-PEG(Mw=2000,10μM),混合0.5h,并离心洗涤最终悬浮于1mL MES(10mM)中。接着加入EDC 3.75μL(0.1M)和NHS-Sulfo 1.89μL(0.5M)混合15min并加入free-PSA抗体(Monoclonal Antibody to H Man free-PSA)4.4μL(6.7μM)。于37℃条件下,温孵3h。最后离心洗涤重新分散于200μL PBS缓冲溶液中。
2)金探针的制备:首先取新制备的粒径为30nm的Au胶体溶液,向其中滴加新配制的孔雀石绿溶液。Au溶胶和孔雀石绿溶液的物质量比为(1.65*10-3∶1)。然后取1ml上述溶液,分别加入15μL HS-PEG-COOH(Mw=486,10μM)和85μL HS-PEG(Mw=2000Da,10μM),混合0.5h,并离心洗涤悬浮于1mL MES(10mM)中。接着加入EDC 3.75μL(0.1M)和NHS-Sulfo 1.89μL(0.5M)混合15min并加入McAb PSA(Monoclonal Antibody to H Man PSA)4.4μL(6.7μM),于37℃条件下,温孵3h。最后离心洗涤重新分散于200μL PBS缓冲溶液中。
3)拉曼检测:各取修饰抗体之后的Fe3O4Au和Au溶液100μL混合。加入free-PSA抗原4.5μL(10.5μM),置于37℃温孵1h。磁性分离,重新分散于200μL超纯水中,采用LabRam I型共焦显微拉曼光谱仪,在633nm,4mW条件下进行检测。
实施例3
1)Fe3O4Au探针的制备:首先可按照中国专利CN101773810A所公开的方法制备,具体方法如下:
(1)四氧化三铁纳米颗粒的制备:称取0.26g FeSO4·7H2O溶于2.5ml 2M/L的KNO3溶液中,加入2.5ml 1M/L的NaOH溶液,搅拌,加入20ml 1~5g/L的分子量为(1,800-25,000)的PEI溶液,放入微波反应器90℃,反应时间30~120min。反应完后,磁性分离用去离子水洗涤5次,分散于25ml水中保存,最终所得溶液四氧化三铁含量浓度为0.012M(物质量比为FeSO4·7H2O∶KNO3∶NaOH=1.87∶10∶5)。
(2)2.6nm金纳米颗粒的制备:参照文献【Brown,K.R.;Walter,D.G.;Natan,M.J.Chem.Mater.2000,12(2),306-313.】方法,具体步骤为,量取1ml 1%HAuCl4溶液滴入90ml超纯水中磁力搅拌1min,再滴加2ml柠檬酸三钠(38.8mM)搅拌1min。最后加入1ml新鲜配制含0.075%NaBH4的柠檬酸三钠(38.8mM)。继续磁力搅拌5min。然后置于4℃冰箱保存。
(3)Fe3O4Au纳米颗粒的合成:量取2ml Fe3O4-PEI溶液与金种子溶液机械搅拌90~120min,转速300~600rpm。再加入5g/L PEI 20ml置于50~60℃烘箱60min,磁性分离洗涤5次。最终分散于20ml去离子水中,加入110ml 0.01M的NaOH,第一次加入0.75mlNH2OH·HCl(盐酸羟胺)、0.5ml 1%HAucl4,其后间隔加入0.5ml NH2OH·HCl、0.5ml 1%HAucl4共4次,每次间隔10min。最终离心洗涤3次,每次6000rpm 10min。
取所制备的Fe3O4Au溶液1mL(12.3pmol/L),分别加入15HS-PEG-COOH(Mw=486,10μM)和85μL HS-PEG(Mw=2000,10μM),混合0.5h,并离心洗涤最终悬浮于1mL MES(10mM)中。接着加入EDC 3.75μL(0.1M)和NHS-Sulfo 1.89μL(0.5M)混合15min并加入Biotin-PEO-Amine 4.4μL(6.7μM)。于37℃条件下,温孵3h。最后离心洗涤重新分散于200μL PBS缓冲溶液中。
2)金探针的制备:首先取新制备的粒径为30nm的Au胶体溶液,向其中滴加新配制的孔雀石绿溶液。Au溶胶和孔雀石绿溶液的物质量比为(1.65*10-3∶1)。然后取1ml上述溶液,分别加入15μL HS-PEG-COOH(Mw=486,10μM)和85μL HS-PEG(Mw=2000Da,10μM),混合0.5h,并离心洗涤悬浮于1mL MES(10m M)中。接着加入EDC 3.75μL(0.1M)和NHS-Sulfo 1.89μL(0.5M)混合15min并加入Biotin-PEO-Amine 4.4μL(6.7μM),于37℃条件下,温孵3h。最后离心洗涤重新分散于200μL PBS缓冲溶液中。
3)拉曼检测:各取修饰生物分子之后的Fe3O4Au和Au溶液200μL混合。加入Streptavidin9μL(10μM),置于37℃温孵3h。磁性分离,重新分散于400μL超纯水中,采用LabRam I型共焦显微拉曼光谱仪,在633nm,4mW条件下进行检测。
实施例4
1)Fe3O4Au探针的制备:首先可按照中国专利CN101773810A所公开的方法制备,具体方法如下:
(1)四氧化三铁纳米颗粒的制备:称取0.26g FeSO4·7H2O溶于2.5ml 2M/L的KNO3溶液中,加入2.5ml 1M/L的NaOH溶液,搅拌,加入20ml 1~5g/L的分子量为(1,800~25,000)的PEI溶液,放入微波反应器90℃,反应时间30~120min。反应完后,磁性分离用去离子水洗涤5次,分散于25ml水中保存,最终所得溶液四氧化三铁含量浓度为0.012M(物质量比为FeSO4·7H2O∶KNO3∶NaOH=1.87∶10∶5)。
(2)2.6nm金纳米颗粒的制备:参照文献【Brown,K.R.;Walter,D.G.;Natan,M.J.Chem.Mater.2000,12(2),306-313.】方法,具体步骤为,量取1ml 1%HAuCl4溶液滴入90ml超纯水中磁力搅拌1min,再滴加2ml柠檬酸三钠(38.8mM)搅拌1min。最后加入1ml新鲜配制含0.075%NaBH4的柠檬酸三钠(38.8mM)。继续磁力搅拌5min。然后置于4℃冰箱保存。
(3)Fe3O4Au纳米颗粒的合成:量取2ml Fe3O4-PEI溶液与金种子溶液机械搅拌90~120min,转速300~600rpm。再加入5g/L PEI 20ml置于50~60℃烘箱60min,磁性分离洗涤5次。最终分散于20ml去离子水中,加入110ml 0.01M的NaOH,第一次加入0.75mlNH2OH·HCl(盐酸羟胺)、0.5ml 1%HAuCl4,其后间隔加入0.5ml NH2OH·HCl、0.5ml 1%HAucl4共4次,每次间隔10min。最终离心洗涤3次,每次6000rpm 10min。
取所制备的Fe3O4Au溶液1mL(12.3pmol/L),分别加入15HS-PEG-COOH(Mw=486,10μM)和85μL HS-PEG(Mw=2000,10μM),混合0.5h,并离心洗涤最终悬浮于1mL MES(10mM)中。接着加入EDC 3.75μL(0.1M)和NHS-Sulfo 1.89μL(0.5M)混合15min并加入free-PSA抗体(Monoclonal Antibody to H Man free-PSA)4.4μL(6.7μM)。于37℃条件下,温孵3h。最后离心洗涤重新分散于200μL PBS缓冲溶液中。
2)金探针的制备:首先取新制备的粒径为30nm的Au胶体溶液,向其中滴加新配制的孔雀石绿溶液。Au溶胶和孔雀石绿溶液的物质量比为(1.65*10-3∶1)。然后取1ml上述溶液,分别加入50μL HS-PEG-COOH(Mw=486,10μM)和50μL HS-PEG(Mw=2000Da,10μM),混合1h,并离心洗涤悬浮于1mL MES(10m M)中。接着加入EDC 5μL(0.1M)和NHS-Sulfo3μL(0.5M)混合2h并加入McAb PSA(Monoclonal Antibody to H Man PSA)6μL(6.7μM),于37℃条件下,温孵3h。最后离心洗涤重新分散于200μL PBS缓冲溶液中。
3)拉曼检测:各取修饰抗体之后的Fe3O4Au和Au溶液100μL混合。加入free-PSA抗原4.5μL(10.5μM),置于37℃温孵1h。磁性分离,重新分散于200μL超纯水中,采用LabRam I型共焦显微拉曼光谱仪,在633nm,4mW条件下进行检测。
Claims (10)
1.用Fe3O4Au核壳纳米探针检测生物分子的方法,其特征在于包括以下步骤:
1)制备Fe3O4Au探针;
2)制备金探针:取Au胶体溶液,加入孔雀石绿溶液,得混合溶液A,再加入HS-PEG-COOH和HS-PEG第1次混合,再离心洗涤悬浮于MES中,接着加入EDC和NHS-Sulfo第2次混合,并加入生物分子B,温孵,最后离心洗涤重新分散于PBS缓冲液中;
3)拉曼检测:各取分别修饰有生物分子A和生物分子B的Fe3O4Au和Au溶液混合,加入待检测的生物分子,温孵,磁性分离,重新分散于超纯水中,采用拉曼光谱仪进行检测。
2.如权利要求1所述的用Fe3O4Au核壳纳米探针检测生物分子的方法,其特征在于在步骤1)中,所述制备Fe3O4Au探针的具体方法为:
先制备Fe3O4Au纳米颗粒,在Fe3O4Au溶液中加入HS-PEG-COOH和HS-PEG混合,再离心洗涤,悬浮于2-(N-吗啉代)乙磺酸中,接着加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐,并加入生物分子A,温孵,最后离心洗涤,重新分散于磷酸盐缓冲液中。
3.如权利要求1所述的用Fe3O4Au核壳纳米探针检测生物分子的方法,其特征在于在步骤1)中,所述制备Fe3O4Au纳米颗粒的具体方法如下:
(1)四氧化三铁纳米颗粒的制备:称取0.26g FeSO4·7H2O溶于2.5ml 2M/L的KNO3溶液中,加入2.5ml 1M/L的NaOH溶液,搅拌,加入20ml 1~5g/L的分子量为1,800~25,000的PEI溶液,放入微波反应器90℃,反应时间30~120min,反应完后,磁性分离用去离子水洗涤5次,分散于25ml水中保存,最终所得溶液四氧化三铁含量浓度为0.012M,物质量比为FeSO4·7H2O∶KNO3∶NaOH=1.87∶10∶5;
(2)2.6nm金纳米颗粒的制备:量取1ml 1%HAuCl4溶液滴入90ml超纯水中磁力搅拌1min,再滴加2ml柠檬酸三钠搅拌1min,最后加入1ml新鲜配制含0.075%NaBH4的柠檬酸三钠,继续磁力搅拌5min。然后置于4℃冰箱保存;
(3)Fe3O4Au纳米颗粒的合成:量取2ml Fe3O4-PEI溶液与金种子溶液机械搅拌90~120min,转速300~600rpm,再加入5g/L PEI 20ml置于50~60℃烘箱60min,磁性分离洗涤5次,最终分散于20ml去离子水中,加入110ml 0.01M的NaOH,第一次加入0.75ml盐酸羟胺、0.5ml 1%HAuCl4,其后间隔加入0.5ml NH2OH·HCl、0.5ml 1%HAuCl4共4次,每次间隔10min,最终离心洗涤3次,每次6000rpm 10min。
4.如权利要求1所述的用Fe3O4Au核壳纳米探针检测生物分子的方法,其特征在于在步骤1)中,所述Fe3O4Au溶液的摩尔浓度为12.3pmol/L,所述Fe3O4Au溶液:HS-PEG-COOH和HS-PEG的摩尔比为1∶(1~6)∶(1~6),所述HS-PEG-COOH的Mw=486,所述HS-PEG的Mw=2000。
5.如权利要求1所述的用Fe3O4Au核壳纳米探针检测生物分子的方法,其特征在于在步骤1)中,所述混合的时间为0.5~2h;所述MES的摩尔浓度为10mM;所述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔浓度为0.1M,所述NHS-Sulfo的摩尔浓度为0.5M;所述生物分子A的摩尔浓度为6.7μM;所述温孵的条件于37℃下,温孵3h;所述MES、EDC、NHS、生物分子A和PBS缓冲液的体积比为1000∶(3~5)∶(1~3)∶(4~6)∶200。
6.如权利要求1所述的用Fe3O4Au核壳纳米探针检测生物分子的方法,其特征在于在步骤2)中,所述Au胶体的粒径为30nm;所述Au溶胶和孔雀石绿溶液的物质量比为(10-3~10-2)∶1;所述混合溶液A与HS-PEG-COOH和HS-PEG的摩尔比可为1∶(1~6)∶(1~6),所述HS-PEG-COOH的Mw=486,所述HS-PEG的Mw=2000。
7.如权利要求1所述的用Fe3O4Au核壳纳米探针检测生物分子的方法,其特征在于在步骤2)中,所述第1次混合的时间为0.5~2h;所述MES、EDC、NHS-Sulfo、生物分子B和PBS缓冲溶液的体积比为1000∶(3~5)∶(1~3)∶(4~6)∶200;所述MES的摩尔浓度可为10mM,所述EDC的摩尔浓度可为0.1M,所述NHS-Sulfo的摩尔浓度可为0.5M。
8.如权利要求1所述的用Fe3O4Au核壳纳米探针检测生物分子的方法,其特征在于在步骤2)中,所述第2次混合的时间为15min~2h;所述生物分子B的摩尔浓度为6.7μM;所述温孵的条件可为于37℃下温孵3h。
9.如权利要求1所述的用Fe3O4Au核壳纳米探针检测生物分子的方法,其特征在于在步骤3)中,所述修饰生物分子之后的Fe3O4Au与Au溶液的体积比为1∶1。
10.如权利要求1所述的用Fe3O4Au核壳纳米探针检测生物分子的方法,其特征在于在步骤3)中,所述温孵的条件为37℃下温孵1~3h;所述检测的条件可为633nm,4mW下进行检测。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210032482XA CN102590174A (zh) | 2012-02-14 | 2012-02-14 | 用Fe3O4@Au核壳纳米探针检测生物分子的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210032482XA CN102590174A (zh) | 2012-02-14 | 2012-02-14 | 用Fe3O4@Au核壳纳米探针检测生物分子的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102590174A true CN102590174A (zh) | 2012-07-18 |
Family
ID=46479114
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210032482XA Pending CN102590174A (zh) | 2012-02-14 | 2012-02-14 | 用Fe3O4@Au核壳纳米探针检测生物分子的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102590174A (zh) |
Cited By (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102911373A (zh) * | 2012-08-06 | 2013-02-06 | 东华大学 | 一种hpei包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法 |
CN103105386A (zh) * | 2013-01-29 | 2013-05-15 | 福州大学 | 一种水体及水产品中孔雀石绿的检测方法 |
CN103134932A (zh) * | 2013-01-29 | 2013-06-05 | 南昌大学 | 一种基于γ-Fe2O3@Au纳米材料免疫磁分离的食源性致病菌快速检测方法 |
CN103149333A (zh) * | 2013-03-17 | 2013-06-12 | 南昌大学 | 一种基于Fe3O4@Au纳米粒子间接富集免疫磁分离的食源性致病菌快速检测方法 |
CN104122249A (zh) * | 2014-07-03 | 2014-10-29 | 上海师范大学 | 一种唾液中毒品代谢物现场的检测方法 |
CN104977287A (zh) * | 2014-04-10 | 2015-10-14 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种基于磁性纳米颗粒的多环芳烃检测方法 |
CN105108171A (zh) * | 2015-09-24 | 2015-12-02 | 厦门大学 | 一种强拉曼信号的纳米颗粒的制备方法 |
CN105903979A (zh) * | 2016-05-13 | 2016-08-31 | 吉林师范大学 | 一种Fe3O4@Au核壳功能材料的制备方法 |
CN106680345A (zh) * | 2016-12-20 | 2017-05-17 | 深圳大学 | 磁性复合纳米材料、电化学生物传感器及制备、构建方法 |
CN107234238A (zh) * | 2017-05-03 | 2017-10-10 | 太原理工大学 | 一种核壳结构Au@Co(OH)2纳米微球的制备方法 |
CN107941779A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-04-20 | 中国人民解放军总医院 | 基于万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒和纳米标签表面增强拉曼散射检测细菌的方法 |
CN105842229B (zh) * | 2016-06-15 | 2018-09-04 | 吉林大学 | 一种核壳sers探针、制备方法及其在痕量砷酸根离子检测方面的应用 |
CN117250345A (zh) * | 2023-11-20 | 2023-12-19 | 重庆医科大学绍兴柯桥医学检验技术研究中心 | 一种器官芯片中生物分子的原位检测方法 |
Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1510148A (zh) * | 2002-12-26 | 2004-07-07 | 华中科技大学同济医学院附属同济医院 | 建立乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸的探测系统的方法 |
CN101101263A (zh) * | 2007-07-20 | 2008-01-09 | 苏州大学 | 高活性表面增强拉曼光谱的核壳纳米粒子及其制备方法 |
CN101323022A (zh) * | 2008-07-11 | 2008-12-17 | 中山大学 | 一种金磁核壳纳米粒子的制备方法 |
CN101694492A (zh) * | 2009-10-21 | 2010-04-14 | 陕西北美基因股份有限公司 | 金磁微粒表面功能化修饰方法及其在生物分子检测中的应用 |
CN101817960A (zh) * | 2010-03-17 | 2010-09-01 | 中国石油大学(华东) | 一种核壳结构磁性复合纳米粒子的制备方法 |
US7829140B1 (en) * | 2006-03-29 | 2010-11-09 | The Research Foundation Of The State University Of New York | Method of forming iron oxide core metal shell nanoparticles |
WO2011031478A1 (en) * | 2009-08-27 | 2011-03-17 | Brown University | Fe3o4-m(au-like)-nanoparticles for antibody-conserving target-specific platin delivery |
WO2011071343A2 (ko) * | 2009-12-11 | 2011-06-16 | 한국화학연구원 | 라만 활성분자가 나노입자 이합체의 접합부에 위치한 이합체 코어쉘 나노 입자, 이의 용도 및 이의 제조방법 |
US20110206619A1 (en) * | 2011-03-01 | 2011-08-25 | Morteza Mahmoudi | Gold coated super paramagnetic iron oxide nano-particles (spions) and a method of synthesizing the same |
CN102221542A (zh) * | 2011-03-24 | 2011-10-19 | 华南师范大学 | 应用竞争性表面增强拉曼散射检测克伦特罗的方法及应用 |
WO2011130937A1 (zh) * | 2010-04-19 | 2011-10-27 | 福建师范大学 | 一种体液表面增强拉曼光谱的检测方法 |
-
2012
- 2012-02-14 CN CN201210032482XA patent/CN102590174A/zh active Pending
Patent Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1510148A (zh) * | 2002-12-26 | 2004-07-07 | 华中科技大学同济医学院附属同济医院 | 建立乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸的探测系统的方法 |
US7829140B1 (en) * | 2006-03-29 | 2010-11-09 | The Research Foundation Of The State University Of New York | Method of forming iron oxide core metal shell nanoparticles |
CN101101263A (zh) * | 2007-07-20 | 2008-01-09 | 苏州大学 | 高活性表面增强拉曼光谱的核壳纳米粒子及其制备方法 |
CN101323022A (zh) * | 2008-07-11 | 2008-12-17 | 中山大学 | 一种金磁核壳纳米粒子的制备方法 |
WO2011031478A1 (en) * | 2009-08-27 | 2011-03-17 | Brown University | Fe3o4-m(au-like)-nanoparticles for antibody-conserving target-specific platin delivery |
CN101694492A (zh) * | 2009-10-21 | 2010-04-14 | 陕西北美基因股份有限公司 | 金磁微粒表面功能化修饰方法及其在生物分子检测中的应用 |
WO2011071343A2 (ko) * | 2009-12-11 | 2011-06-16 | 한국화학연구원 | 라만 활성분자가 나노입자 이합체의 접합부에 위치한 이합체 코어쉘 나노 입자, 이의 용도 및 이의 제조방법 |
CN101817960A (zh) * | 2010-03-17 | 2010-09-01 | 中国石油大学(华东) | 一种核壳结构磁性复合纳米粒子的制备方法 |
WO2011130937A1 (zh) * | 2010-04-19 | 2011-10-27 | 福建师范大学 | 一种体液表面增强拉曼光谱的检测方法 |
US20110206619A1 (en) * | 2011-03-01 | 2011-08-25 | Morteza Mahmoudi | Gold coated super paramagnetic iron oxide nano-particles (spions) and a method of synthesizing the same |
CN102221542A (zh) * | 2011-03-24 | 2011-10-19 | 华南师范大学 | 应用竞争性表面增强拉曼散射检测克伦特罗的方法及应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
XI ZHOU,WENLONG XU,YAN WANG: "Fabrication of Cluster/Shell Fe3O4/Au Nanoparticles and Application in Protein Detection via a SERS Method", 《J.PHYS.CHEM.C》, vol. 114, no. 46, 28 October 2010 (2010-10-28) * |
石延峰,周樨,钟鹭斌,徐文龙,王艳,张其清: "Fe3O4@Au核壳纳米颗粒的制备及其形成机制探讨", 《东南大学学报(医学版)》, vol. 30, no. 1, 28 February 2011 (2011-02-28) * |
Cited By (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102911373B (zh) * | 2012-08-06 | 2014-10-15 | 东华大学 | 一种hpei包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法 |
CN102911373A (zh) * | 2012-08-06 | 2013-02-06 | 东华大学 | 一种hpei包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法 |
CN103105386B (zh) * | 2013-01-29 | 2015-05-20 | 福州大学 | 一种水体及水产品中孔雀石绿的检测方法 |
CN103105386A (zh) * | 2013-01-29 | 2013-05-15 | 福州大学 | 一种水体及水产品中孔雀石绿的检测方法 |
CN103134932A (zh) * | 2013-01-29 | 2013-06-05 | 南昌大学 | 一种基于γ-Fe2O3@Au纳米材料免疫磁分离的食源性致病菌快速检测方法 |
CN103134932B (zh) * | 2013-01-29 | 2015-01-28 | 南昌大学 | 一种基于γ-Fe2O3@Au纳米材料免疫磁分离的食源性致病菌快速检测方法 |
CN103149333A (zh) * | 2013-03-17 | 2013-06-12 | 南昌大学 | 一种基于Fe3O4@Au纳米粒子间接富集免疫磁分离的食源性致病菌快速检测方法 |
CN104977287A (zh) * | 2014-04-10 | 2015-10-14 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种基于磁性纳米颗粒的多环芳烃检测方法 |
CN104977287B (zh) * | 2014-04-10 | 2018-07-03 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种基于磁性纳米颗粒的多环芳烃检测方法 |
CN104122249A (zh) * | 2014-07-03 | 2014-10-29 | 上海师范大学 | 一种唾液中毒品代谢物现场的检测方法 |
CN105108171A (zh) * | 2015-09-24 | 2015-12-02 | 厦门大学 | 一种强拉曼信号的纳米颗粒的制备方法 |
CN105108171B (zh) * | 2015-09-24 | 2017-07-18 | 厦门大学 | 一种强拉曼信号的纳米颗粒的制备方法 |
CN105903979A (zh) * | 2016-05-13 | 2016-08-31 | 吉林师范大学 | 一种Fe3O4@Au核壳功能材料的制备方法 |
CN105842229B (zh) * | 2016-06-15 | 2018-09-04 | 吉林大学 | 一种核壳sers探针、制备方法及其在痕量砷酸根离子检测方面的应用 |
CN106680345A (zh) * | 2016-12-20 | 2017-05-17 | 深圳大学 | 磁性复合纳米材料、电化学生物传感器及制备、构建方法 |
CN107234238A (zh) * | 2017-05-03 | 2017-10-10 | 太原理工大学 | 一种核壳结构Au@Co(OH)2纳米微球的制备方法 |
CN107941779A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-04-20 | 中国人民解放军总医院 | 基于万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒和纳米标签表面增强拉曼散射检测细菌的方法 |
CN117250345A (zh) * | 2023-11-20 | 2023-12-19 | 重庆医科大学绍兴柯桥医学检验技术研究中心 | 一种器官芯片中生物分子的原位检测方法 |
CN117250345B (zh) * | 2023-11-20 | 2024-02-13 | 重庆医科大学绍兴柯桥医学检验技术研究中心 | 一种器官芯片中生物分子的原位检测方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102590174A (zh) | 用Fe3O4@Au核壳纳米探针检测生物分子的方法 | |
Xie et al. | Bio-imaging, detection and analysis by using nanostructures as SERS substrates | |
Swierczewska et al. | High-sensitivity nanosensors for biomarker detection | |
Ranzoni et al. | One-step homogeneous magnetic nanoparticle immunoassay for biomarker detection directly in blood plasma | |
Jarockyte et al. | Multiplexed nanobiosensors: current trends in early diagnostics | |
Kho et al. | Clinical SERS: are we there yet? | |
CN107621493B (zh) | 一种用于重金属铅污染物检测的电化学传感器制备方法 | |
Hu et al. | Aptamer-based novel Ag-coated magnetic recognition and SERS nanotags with interior nanogap biosensor for ultrasensitive detection of protein biomarker | |
Wang et al. | Magnetic plasmonic particles for SERS-based bacteria sensing: A review | |
JP6788686B2 (ja) | 超常磁性ナノ複合体の製造方法およびこれを用いて製造された超常磁性ナノ複合体 | |
CN108414495B (zh) | 氧化铁协同纳米银/氧化石墨烯sers基底的制备方法 | |
CN106290873B (zh) | 一种基于具有拉曼和荧光双重信号的金‑上转换空间四面体结构的制备及应用 | |
CN101019019A (zh) | 表面强化的光谱学活性复合纳米颗粒 | |
Liu et al. | Ultrasensitive and facile detection of multiple trace antibiotics with magnetic nanoparticles and core-shell nanostar SERS nanotags | |
Zhong et al. | Expanding the scope of chemiluminescence in bioanalysis with functional nanomaterials | |
CN109239046B (zh) | 一种c反应蛋白检测试剂及sers检测方法 | |
CN110186902A (zh) | 一种检测汞离子的表面增强拉曼传感器 | |
Wu et al. | A portable magnetic particle spectrometer for future rapid and wash-free bioassays | |
KR20210019767A (ko) | 자성-광학 복합 나노구조체 | |
CN104625044B (zh) | 一种四氧化三铁/银复合材料及其制备方法和应用 | |
Shi et al. | Highly catalysis MOFCe supported Ag nanoclusters coupled with specific aptamer for SERS quantitative assay of trace dopamine | |
Zhang et al. | Self-assembled 1D nanostructures for direct nanoscale detection and biosensing | |
Yang et al. | Enhanced imaging of glycan expressing cancer cells using poly (glycidyl methacrylate)-grafted silica nanospheres labeled with quantum dots | |
CN108580919B (zh) | 银核介孔金纳米结构材料的制备方法、表面增强拉曼检测探针及其应用 | |
Ponsanti et al. | Synthesis of mesoporous silica nanoparticles (MSNs)/silver nanoparticles (AgNPs): promising hybrid materials for detection of breast cancer cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120718 |