CN108414495B - 氧化铁协同纳米银/氧化石墨烯sers基底的制备方法 - Google Patents

氧化铁协同纳米银/氧化石墨烯sers基底的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氧化铁协同纳米银/氧化石墨烯SERS基底的制备方法。所述方法通过将银溶胶和氧化铁与氧化石墨烯混合，在盐的作用下，银纳米粒子和氧化铁团聚并被氧化石墨烯捕捉负载在氧化石墨烯上，得到氧化铁协同纳米银/氧化石墨烯SERS基底，基底酸化后，对蛋白质进行拉曼检测。本发明引入氧化石墨烯提高了基底的悬浮性，同时能稳定银和氧化铁的团聚状态，引入氧化铁与银纳米粒子一同负载在氧化石墨烯上，使得银纳米粒子分散在氧化铁周围，能够形成产生高SERS活性的热点，增加SERS信号强度。本发明方法制备的SERS基底能够实现鸡蛋白的快速检测，且结果准确，灵敏度高，可用于生物体内的活体检测。

Description

氧化铁协同纳米银/氧化石墨烯SERS基底的制备方法
技术领域
本发明属于化学分析、生物分子检测领域，涉及一种氧化铁协同纳米银/氧化石墨烯SERS基底的制备方法。
背景技术
增强拉曼光谱技术可直接分析水相生物分子的结构状态且用量少，是一种无损非接触检测技术，具有高效灵敏，性价比高，便于现场快速检测的特点。增强拉曼光谱技术的非破坏性和指纹式的分辨能力被广泛用于研究蛋白质、DNA等生物分子药品之间的相互作用。
SERS效应最初被发现是在粗糙化的银电极表面检测吡啶的拉曼信号。金属基底表面必须经过粗糙化的处理才能产生SERS效应，这种粗糙化处理其实是让金属表面形成纳米尺度下的微观结构。纳米技术的快速发展，能够获得不同形状和大小的纳米材料，用于SERS基底的制备，极大地推动了SERS技术的发展。
传统的蛋白质检测方法，包括质谱，X-射线晶体，核磁共振和酶联免疫吸附试验等，但使用方式复杂，难以实现现场快速检测。拉曼检测法检测蛋白，通过分析蛋白质拉曼图普的峰强信息以及特征峰位置，不但可以得到蛋白质分子的结构、肽链骨架的振动，而且可以获得测验环境的化学信息以及蛋白质受外界环境的影响信息，具有对样品无损、样品制备简单和所需样品量少等优点。表面增强拉曼光谱技术使其检测限度提高了4至10个数量级，不仅在物质结构分析方面，而且在痕量检测方面也显示出巨大的潜力。免标记是一种不需要任何连接剂的技术，特点是能直接测得蛋白信号，是一种理想的检测技术。
氧化铁纳米粒子是一种半导体材料，具有独特的物理和化学特性，以其性质稳定、比表面积高、生物兼容性好、无毒性等特点在生物药学应用较多，如用于生物分子分离、药物靶向治疗、磁共振成像等。
蛋白质检测中，纳米银/氧化石墨烯SERS基底是一类可以悬浮在蛋白溶液中的活性基底。文献1(Jiao SJ,et al.Graphene oxide mediated surface-enhanced Ramanscattering substrate:Well-suspending and label-free detecting for protein[J].Journal of Molecular Structure,2014,1062:48-52.)报道了一种能够在蛋白溶液中悬浮存在的纳米银/氧化石墨烯SERS基底，实现了对牛血清白蛋白的快速检测。但是，此方法在检测的过程中存在着蛋白信号弱，SERS谱图的重现性不好等问题。文献2(Han X X,etal.Label-free highly sensitive detection of proteins in aqueous solutionsusing surface-enhanced Raman scattering[J].Analytical chemistry,2009,81(9):3329-3333.)报道了一种溶胶基底，以银溶胶做基底，以硫酸做聚集剂，但基底表面不清洁，可能会出现杂峰，对探针分子SERS信号造成干扰。
发明内容
本发明的目的是提供一种氧化铁协同纳米银/氧化石墨烯SERS基底的制备方法，该方法将银溶胶和氧化铁纳米粒子与氧化石墨烯(GO)混合，在氯化钠的作用下，使银纳米粒子和氧化铁团聚并且负载在GO上，得到氧化铁协同纳米银/氧化石墨烯SERS基底。基底酸化后与蛋白溶液混合，能够实现蛋白质在水相中的免标记检测并且SERS信号增强，进行定性分析。
实现本发明目的的技术方案如下：
氧化铁协同纳米银/氧化石墨烯SERS基底的制备方法，具体步骤如下：
步骤1，银溶胶的制备：采用晶种法合成银溶胶，在柠檬酸三钠溶液中加入硼氢化钠溶液和硝酸银溶液，得到银纳米粒子晶种1，将柠檬酸钠溶液煮沸后，加入银纳米粒子晶种1和硝酸银，得到银纳米粒子晶种2，将柠檬酸钠溶液加热至80～82℃，加入银纳米粒子晶种2和硝酸银，得到银纳米粒子晶种3，在银纳米粒子晶种3加水，加热至80～82℃，加入柠檬酸钠和硝酸银，反应结束后，得到银溶胶；
步骤2，氧化铁的制备：通过水热法，将氯化铁和尿素在磁力搅拌下溶解，然后将溶液在500～600℃下煅烧，水洗醇洗，干燥，得到氧化铁；
步骤3，按银溶胶、氧化铁与氧化石墨烯的质量比为140:45:9～140:135:9，将银溶胶和氧化铁与氧化石墨烯混合均匀，超声条件下加入NaCl溶液，NaCl在混合溶液中的终浓度为0.15～0.2M，超声混合均匀，离心去除上清液，将沉淀分散于水中，得到纳米银-氧化铁/氧化石墨烯/氯化钠的基底溶液。
优选地，步骤1中，所述的银溶胶中的银纳米粒子的尺寸为50～60nm。
优选地，步骤4中，所述的银溶胶、氧化铁与氧化石墨烯的质量比为140:90:9。
本发明中，GO作为表面活性剂，在溶液中呈现相对舒展的平面结构，可作为双面负载平台。引入氧化铁与银纳米粒子一同负载在氧化石墨烯上，使得银纳米粒子分散在氧化铁周围，在NaCl的作用下，银纳米粒子和氧化铁纳米粒子团聚并被GO捕捉，GO将纳米粒子团聚体稳定在其表面上，使纳米粒子大部分表面裸露，实现和蛋白的直接结合。一方面，NaCl作为纳米粒子表面清洁剂，氯离子和银极易结合，去除银溶胶表面的柠檬酸三钠，得到了表面清洁的基底，使蛋白检测没有杂峰的干扰。另一方面，银纳米粒子分散在氧化铁周围，能够形成产生高SERS活性的“热点”，增加SERS信号强度。
本发明通过引入GO和氧化铁，得到了表面清洁、团聚体大小可控、悬浮性好的基底，结合表面拉曼增强技术，实现了蛋白质在液相中的痕量、无损、免标记检测。本发明的检测方法操作简单，快速、灵敏，且不需要连接剂，增加了检测的可靠性，为后续的蛋白质的结构和功能及疾病的诊断研究提供了重复性良好的方法。
附图说明
图1是制备的Ag溶胶的TEM图；
图2是制备的Ag溶胶和Ag-Fe2O3/GO的UV-vis图；
图3是Ag-Fe2O3/GO活性基底的TEM图；
图4是Ag-Fe2O3/GO(b)和Ag/GO(a)基底材料来检测鸡蛋白蛋白的表面增强拉曼图；
图5是银溶胶、氧化铁与氧化石墨烯的质量比为140:45:9的Ag-Fe2O3/GO活性基底的TEM图；
图6是银溶胶、氧化铁与氧化石墨烯的质量比为140:45:9的Ag-Fe2O3/GO(b)和Ag/GO(a)基底材料来检测鸡蛋白蛋白的表面增强拉曼图；
图7是银溶胶、氧化铁与氧化石墨烯的质量比为140:135:9的Ag-Fe2O3/GO活性基底的TEM图；
图8是银溶胶、氧化铁与氧化石墨烯的质量比为140:135:9的Ag-Fe2O3/GO(b)和Ag/GO(a)基底材料来检测鸡蛋白蛋白的表面增强拉曼图；
图9是分别以40-50nm(a)和50-60nm(b)的银溶胶制备的Ag-Fe2O3/GO基底材料来检测鸡蛋白蛋白的表面增强拉曼图；
图10是分别以60-70nm(a)和50-60nm(b)的银溶胶制备的Ag-Fe2O3/GO基底材料来检测鸡蛋白蛋白的表面增强拉曼图；
图11是银溶胶、氧化铁与氧化石墨烯的质量比为140:27:9的Ag-Fe2O3/GO(a)和Ag/GO(b)基底材料来检测鸡蛋白蛋白的表面增强拉曼图；
图12是银溶胶、氧化铁与氧化石墨烯的质量比为140:180:9的Ag-Fe2O3/GO(a)和Ag/GO(b)基底材料来检测鸡蛋白蛋白的表面增强拉曼图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
实施例1
银溶胶的合成：
(1)合成平均粒径为4nmAgNPS:将20ml 1％的柠檬酸三钠和75ml去离子水加入到250ml三口烧瓶中，将其加热至70℃，15分钟后再加入1.7ml1％的AgNO3溶液，然后快速加入2ml 0.1％的新制备的NaBH4，在70℃下搅拌1小时，冷却至室温。
(2)合成平均粒径为28.5nmAgNPS：2ml 1％的柠檬酸三钠和75ml去离子水加入到250ml三口烧瓶中，煮沸，沸腾后15分钟加入10ml4nmAgNPS晶种，然后加入1.7ml1％的AgNO3溶液，保持回流搅拌1小时后，再加入2ml 1％的柠檬酸三钠和1.7ml1％的AgNO3溶液，回流搅拌1小时，冷却至室温。
(3)合成平均粒径为45nmAgNPS：2ml 1％的柠檬酸三钠和80ml去离子水加入到250ml三口烧瓶中，加热至80℃，15分钟后再加入10ml28.5nmAgNPS晶种，然后加入1.7ml1％的AgNO3溶液，在80℃保持回流搅拌2小时后，冷却至室温。
(4)合成平均粒径为58nmAgNPS：50ml45nmAgNPS和40ml去离子水加入到250ml三口烧瓶中，加热至80℃，15分钟后再加入2ml 1％的柠檬酸三钠和1.7ml1％的AgNO3溶液，在80℃保持回流搅拌2小时后，冷却至室温，得到银溶胶。
由图1可以看出，最终合成的平均粒径58nm银纳米粒子棒状极少且形貌，尺寸比较均匀。由图2的UV-vis的a曲线可以看出，峰型尖锐，说明银纳米粒子尺寸和形貌比较均匀；由b曲线可以看出，引入氧化铁和氧化石墨烯，吸收峰蓝移，说明氧化铁和银纳米粒子发生了适当的团聚。
基底的制备：取2份10mL银溶胶在7000rpm下离心15min，标记为1#JD、2#JD，去除上清液，将固体分散于7.5mL去离子水中，向2#中加入0.5ml Fe2O3，再分别加入1.5mL0.017mg/mL的GO，混合均匀后在超声的条件下分别加入1.59mL，1.68mL浓度为1M的NaCl，使NaCl的最终浓度为0.15M，至颜色不再变化时，停止超声。在7000rpm下离心15min，去除上清液，分散于7.5mL去离子水中，超声分散均匀。此时基底中银溶胶、氧化铁与氧化石墨烯的质量比为140:90:9。
取1.5mL制备好的基底，加入0.06mL浓度为1M的NaCl，再加入适量的盐酸，调节溶液的pH为2-3。加入0.75mL浓度为1mg/mL的鸡蛋白蛋白溶液，拉曼检测。
由图3可以看出，在NaCl的作用下，银纳米粒子和氧化铁纳米粒子团聚并被GO捕捉，a-1#JD，b-2#JD。图4是0.15M盐(NaCl)浓度下鸡蛋白蛋白的表面增强拉曼图，a-1#JD，b-2#JD。由图4可以看出在基底中引入Fe2O3，增大了蛋白检测的SERS信号强度。
实施例2
基底的制备：取2份10mL银溶胶在7000rpm下离心15min，标记为1#JD、2#JD，去除上清液，将固体分散于7.5mL去离子水中，向2#中加入0.25ml Fe2O3，再分别加入1.5mL0.017mg/mL的GO，混合均匀后在超声的条件下分别加入1.59mL，1.63mL浓度为1M的NaCl，使NaCl的最终浓度为0.15M，至颜色不再变化时，停止超声。在7000rpm下离心15min，去除上清液，分散于7.5mL去离子水中，超声分散均匀。此时基底中银溶胶、氧化铁与氧化石墨烯的质量比为140:45:9。
取1.5mL制备好的基底，加入0.06mL浓度为1M的NaCl，再加入适量的盐酸，调节溶液的pH为2-3。加入0.75mL浓度为1mg/mL的鸡蛋白蛋白溶液，拉曼检测。
由图5可以看出，在NaCl的作用下，银纳米粒子和氧化铁纳米粒子团聚并被GO捕捉，a-1#JD，b-2#JD。图6是0.15M盐(NaCl)浓度下鸡蛋白蛋白的表面增强拉曼图，a-1#JD，b-2#JD。由图6可以看出在基底中引入Fe2O3，增大了蛋白检测的SERS信号强度。
实施例3
基底的制备：取2份10mL合成好的银溶胶在7000rpm下离心15min，标记为1#JD、2#JD，去除上清液，将固体分散于7.5mL去离子水中，向2#中加入0.75ml Fe2O3，再分别加入1.5mL0.017mg/mL的GO，混合均匀后在超声的条件下分别加入1.59mL，1.72mL浓度为1M的NaCl，使NaCl的最终浓度为0.15M，至颜色不再变化时，停止超声。在7000rpm下离心15min，去除上清液，分散于7.5mL去离子水中，超声分散均匀。此时基底中银溶胶、氧化铁与氧化石墨烯的质量比为140:135:9。
取1.5mL制备好的基底，加入0.06mL浓度为1M的NaCl，再加入适量的盐酸，调节溶液的pH为2-3。加入0.75mL浓度为1mg/mL的鸡蛋白蛋白溶液，拉曼检测。
由图7可以看出，在NaCl的作用下，银纳米粒子和氧化铁纳米粒子团聚并被GO捕捉，a-1#JD，b-2#JD。图8是0.15M盐(NaCl)浓度下鸡蛋白蛋白的表面增强拉曼图，a-1#JD，b-2#JD。由图8可以看出在基底中引入Fe2O3，增大了蛋白检测的SERS信号强度。
对比例1
40-50nm银溶胶的合成：2ml 1％的柠檬酸三钠和80ml去离子水加入到250ml三口烧瓶中，加热至80℃，15分钟后再加入10ml28.5nmAgNPS晶种，然后加入1.7ml1％的AgNO3溶液，在80℃保持搅拌2小时后，冷却至室温。
基底的制备：分别取合成好的40-50nm的银溶胶和50-60nm的银溶胶10mL在7000rpm下离心15min，标记为1#JD、2#JD，去除上清液，将固体分散于7.5mL去离子水中，分别加入0.5ml Fe2O3，再分别加入1.5mL0.017mg/mL的GO，混合均匀后在超声的条件下分别加入1.68mL浓度为1M的NaCl，使NaCl的最终浓度为0.15M，至颜色不再变化时，停止超声。在7000rpm下离心15min，去除上清液，分散于7.5mL去离子水中，超声分散均匀。
取1.5mL制备好的基底，加入0.06mL浓度为1M的NaCl，再加入适量的盐酸，调节溶液的pH为2-3。加入0.75mL浓度为1mg/mL的鸡蛋白蛋白溶液，拉曼检测。
图9是0.15M盐(NaCl)浓度下鸡蛋白蛋白的表面增强拉曼图，a-1#JD，b-2#JD。由图9可以看出尺寸小于50-60nm的银溶胶鸡蛋白蛋白的SERS信号强度很弱。
对比例2
60-70nm银溶胶的合成：40ml45nmAgNPS和50ml去离子水加入到250ml三口烧瓶中，加热至80℃，15分钟后再加入2ml 1％的柠檬酸三钠和1.7ml1％的AgNO3溶液，在80℃保持搅拌2小时后，冷却至室温。
基底的制备：分别取合成好的60-70nm的银溶胶和50-60nm的银溶胶10mL在7000rpm下离心15min，标记为1#JD、2#JD，去除上清液，将固体分散于7.5mL去离子水中，分别加入0.5ml Fe2O3，再分别加入1.5mL0.017mg/mL的GO，混合均匀后在超声的条件下分别加入1.68mL浓度为1M的NaCl，使NaCl的最终浓度为0.15M，至颜色不再变化时，停止超声。在7000rpm下离心15min，去除上清液，分散于7.5mL去离子水中，超声分散均匀。
取1.5mL制备好的基底，加入0.06mL浓度为1M的NaCl，再加入适量的盐酸，调节溶液的pH为2-3。加入0.75mL浓度为1mg/mL的鸡蛋白蛋白溶液，拉曼检测。
图10是0.15M盐(NaCl)浓度下鸡蛋白蛋白的表面增强拉曼图，a-1#JD，b-2#JD。由图10可以看出尺寸大于50-60nm的银溶胶鸡蛋白蛋白的SERS信号强度很弱。
对比例3
基底的制备：取2份10mL合成好的银溶胶在7000rpm下离心15min，标记为1#JD、2#JD，去除上清液，将固体分散于7.5mL去离子水中，向1#中加入0.15mlFe2O3，再分别加入1.5mL0.017mg/mL的GO，混合均匀后在超声的条件下分别加入1.61mL，1.59mL浓度为1M的NaCl，使NaCl的最终浓度为0.15M，至颜色不再变化时，停止超声。在7000rpm下离心15min，去除上清液，分散于7.5mL去离子水中，超声分散均匀。此时1#基底中银溶胶、氧化铁与氧化石墨烯的质量比为140:27:9。
取1.5mL制备好的基底，加入0.06mL浓度为1M的NaCl，再加入适量的盐酸，调节溶液的pH为2-3。加入0.75mL浓度为1mg/mL的鸡蛋白蛋白溶液，拉曼检测。
图11是0.15M盐(NaCl)浓度下鸡蛋白蛋白的表面增强拉曼图，a-1#JD，b-2#JD。由图11可以看出在基底中引入过少量的Fe2O3，减弱了蛋白检测的SERS信号强度。
对比例4
基底的制备：取2份10mL合成好的银溶胶在7000rpm下离心15min，标记为1#JD、2#JD，去除上清液，将固体分散于7.5mL去离子水中，向1#中加入1ml Fe2O3，再分别加入1.5mL0.017mg/mL的GO，混合均匀后在超声的条件下分别加入1.76mL，1.59mL浓度为1M的NaCl，使NaCl的最终浓度为0.15M，至颜色不再变化时，停止超声。在7000rpm下离心15min，去除上清液，分散于7.5mL去离子水中，超声分散均匀。此时1#基底中银溶胶、氧化铁与氧化石墨烯的质量比为140:180:9。
取1.5mL制备好的基底，加入0.06mL浓度为1M的NaCl，再加入适量的盐酸，调节溶液的pH为2-3。加入0.75mL浓度为1mg/mL的鸡蛋白蛋白溶液，拉曼检测。
图12是0.15M盐(NaCl)浓度下鸡蛋白蛋白的表面增强拉曼图，a-1#JD，b-2#JD。由图12可以看出在基底中引入过多量的Fe2O3，减弱了蛋白检测的SERS信号强度。

Claims (2)

1.氧化铁协同纳米银/氧化石墨烯SERS基底的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1，银溶胶的制备：采用晶种法合成银溶胶，在柠檬酸三钠溶液中加入硼氢化钠溶液和硝酸银溶液，得到银纳米粒子晶种1，将柠檬酸钠溶液煮沸后，加入银纳米粒子晶种1和硝酸银，得到银纳米粒子晶种2，将柠檬酸钠溶液加热至80～82℃，加入银纳米粒子晶种2和硝酸银，得到银纳米粒子晶种3，在银纳米粒子晶种3加水，加热至80～82℃，加入柠檬酸钠和硝酸银，反应结束后，得到银溶胶，所述的银溶胶中的银纳米粒子的尺寸为50～60nm；
步骤2，氧化铁的制备：通过水热法，将氯化铁和尿素在磁力搅拌下溶解，然后将溶液在500～600℃下煅烧，水洗醇洗，干燥，得到氧化铁；
步骤3，按银溶胶、氧化铁与氧化石墨烯的质量比为140:45:9～140:135:9，将银溶胶和氧化铁与氧化石墨烯混合均匀，超声条件下加入NaCl溶液，NaCl在混合溶液中的终浓度为0.15～0.2M，超声混合均匀，离心去除上清液，将沉淀分散于水中，得到纳米银-氧化铁/氧化石墨烯/氯化钠的基底溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中，所述的银溶胶、氧化铁与氧化石墨烯的质量比为140:90:9。
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