CN102221542A

CN102221542A - 应用竞争性表面增强拉曼散射检测克伦特罗的方法及应用

Info

Publication number: CN102221542A
Application number: CN2011100728176A
Authority: CN
Inventors: 胡勇军; 朱桂池; 钟亮; 高姣
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2011-03-24
Filing date: 2011-03-24
Publication date: 2011-10-19

Abstract

本发明公开了一种应用竞争性表面增强拉曼散射(SERS)检测克伦特罗的方法及应用，属于激素类小分子物质的检测技术领域。该方法首先是将待测样品和结合克伦特罗抗体的SERS纳米探针依次滴在固定好抗原偶联物的基底表面，待测样品中的抗原和固定好抗原偶联物的基底中的抗原与结合在SERS纳米探针上的抗体竞争反应，反应结束后通过拉曼仪对固定好抗原偶联物的基底上标记的SERS纳米探针进行信号采集，并对数据进行处理，根据检测信号的高低和标准曲线，从而对克伦特罗进行定量检测。本发明所述的方法具有操作简单、灵敏度高、检测区间宽和特异性强的优点，在食品安全、兴奋剂检测以及环境分析等领域具有广泛的应用前景。

Description

应用竞争性表面增强拉曼散射检测克伦特罗的方法及应用

技术领域

本发明属于一种激素类小分子物质的检测技术领域，特别涉及一种应用竞争性表面增强拉曼散射(SERS)检测克伦特罗的方法及应用。

背景技术

克伦特罗(Clenbuterol，CL)是一种β-2肾上腺素受体激动剂，临床上作为支气管解痉药物，最初用于治疗哮喘病。当其应用剂量达到治疗量的5～10倍时，克伦特罗可增强肌肉发育、降低脂肪含量，近年来发现其被大量应用于畜牧业以提高瘦肉产率，俗名瘦肉精。人食用该类动物食品会引发一系列的副作用，临床表现为心跳加速、四肢颤抖、腹痛头晕，同时伴有恶心呕吐、呼吸困难等症状；长期食用可致染色体畸变，诱发恶性肿瘤，因此目前已被国际上大部分国家禁用。但近年来常有因食用含有克伦特罗猪肉、牛肉的中毒事件发生，严重危害了人民的身体健康。因此，准确快速检测克伦特罗对于食品安全具有非常重要的意义。当前检测克伦特罗的主要方法有高效液相色谱法(HPLC)、色谱-质谱联用(GC-MS，HPLC-MS)、酶联免疫(ELISA)等，高效液相色谱、色谱-质谱联用法由于操作繁琐、成本高、分析速度慢等缺点无法得到普遍推广。而目前市售的酶联免疫试剂盒虽然选择性好、操作方便，但价格昂贵、贮藏条件苛刻，假阳性比较高，并且检测限一般只能达到0.1ng/mL，满足不了快速准确的检测要求。

表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman scattering，SERS)标记技术是一种新颖的光谱标记方法，它利用金或银等纳米粒子来增强吸附在其表面标记分子的拉曼信号，并将其作为标记示踪信号。SERS标记技术有如下优点：①拉曼光谱具有高度的分子特征性，且谱峰窄，能避免不同分子间的谱峰重叠；②拉曼散射几乎不受水的影响，能够广泛应用于水溶液的检测；③SERS信号具有高强度、低背景的特点，很少受光漂白的影响，为了获得较好的信号可在一定程度上延长检测时间；④SERS信号不易发生淬灭现象。SERS技术以其独特的优点在分析化学与生命科学领域日益受到重视。

早前关于SERS的研究主要集中在蛋白质、DNA、微生物检测等方面。韩晓霞《基于表面增强拉曼散射的蛋白质检测方法研究》一文利用蛋白质和金属纳米粒子的相互作用形成SERS基底用于蛋白质的测定；此外还结合SERS和ELISA的基本理论，设计了一种基于表面增强共振拉曼散射(Surface-enhancedresonant Raman spectroscopy，SERRS)利用荧光分子代替酶促反应、以SERS检测取代吸光度的免疫吸附试验。郭红燕《SERS标记的金纳米探针用于免疫检测》一文以对巯基苯甲酸为拉曼活性分子制备出SERS标记的金纳米棒探针和蛋白抗体结合形成SERS标记抗体。通过SERS标记抗体、待测抗原和俘获抗体之间的免疫应答反应，将金纳米棒探针组装到固体基底上。这种SERS标记方法主要基于类似三明治结构的构建，基底上的俘获抗体和纳米粒子上的标记抗体通过与抗原的结合形成“俘获抗体-抗原-标记抗体”三明治夹心复合物，通过对标记分子SERS信号的检测进行免疫分析。蛋白质等大分子物质一般具有多个结合位点，能够很好地适用于传统的三明治结构。但克伦特罗作为一种典型的激素类小分子物质，由于其缺少多个结合位点，目前还没有专门的利用SERS对这类激素类小分子物质，尤其是克伦特罗的检测。基于SERS技术的优点，因此，发展一种利用SERS简单快速检测克伦特罗的方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种灵敏度高、检测区间宽、特异性强的应用竞争性表面增强拉曼散射检测克伦特罗的方法。在本发明中，利用SERS免疫标记方法并结合竞争吸附法成功地对克伦特罗进行了检测。

本发明的另一目的在于提供所述应用竞争性表面增强拉曼散射检测克伦特罗的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种应用竞争性表面增强拉曼散射检测克伦特罗的方法，将克伦特罗和结合克伦特罗抗体的SERS纳米探针依次滴在固定好抗原偶联物的基底表面，克伦特罗与抗原偶联物竞争性地结合SERS纳米探针表面的抗体；反应完成后，然后使用拉曼仪对结合在基底上的SERS纳米探针进行信号采集，并对数据进行处理，根据检测信号的高低对克伦特罗进行定量检测。其具体步骤如下：

(1)将待测样品和结合克伦特罗抗体的SERS纳米探针依次滴在固定抗原偶联物的基底的表面，室温反应，用超纯水清洗基底；同时用不同浓度的克伦特罗标准溶液和结合克伦特罗抗体的SERS纳米探针依次滴在固定好抗原偶联物的基底表面，制作标准曲线；

(2)用拉曼仪对基底表面上结合的SERS纳米探针进行信号采集，数据处理；根据待测样品的百分SERS信号强度值，从标准曲线读出克伦特罗的浓度，乘以相应的稀释倍数即为待测样品中克伦特罗的实际浓度。

步骤(1)中所述的结合克伦特罗抗体的SERS纳米探针包括金纳米粒子、拉曼标记分子和克伦特罗抗体；

所述的金纳米粒子的平均直径优选为30nm，可参考文献《表面增强拉曼光谱研究以4，4′-联吡啶为标记分子的免疫检测》(蒋芸等)制备得到；

所述的拉曼标记分子优选为4，4′-联吡啶，它是一种双功能团拉曼标记分子，其一端与金纳米粒子相结合，另一端连接克伦特罗抗体；

所述的结合克伦特罗抗体的SERS纳米探针优选通过如下方法制备得到：将平均直径为30nm的金纳米粒子与4，4′-联吡啶在室温下标记反应，离心，去上清，沉淀用硼酸缓冲液分散，得到分散的金胶；然后在分散的金胶中加入克伦特罗抗体，反应，离心，去上清，沉淀用硼酸缓冲液分散，得到分散体系；最后，加入牛血清蛋白进行封闭反应，牛血清白蛋白的作用是封闭前述分散体系的剩余部位，离心，去上清，用磷酸缓冲液分散，即制得结合克伦特罗抗体的SERS纳米探针，2～6℃下保存待用；

所述的4，4′-联吡啶的用量为过量，其分子数优选为金纳米粒子个数的300倍；

所述的室温优选为25～30℃；

所述的标记反应时间优选为5～30min；

所述离心的条件优选为12000rpm离心5min；

所述反应的时间优选为1～3h；

所述的硼酸缓冲液优选为pH 8.2、2mM的硼酸缓冲液；

所述的克伦特罗抗体的用量优选为每6.02×10¹¹个金纳米粒子使用2.5μg克伦特罗抗体；

所述封闭反应的时间优选为0.5～2h；

所述的磷酸缓冲液优选为pH 7.4、10mM的磷酸缓冲液；

所述分散体系的剩余部位是指分散体系中克伦特罗抗体与4，4′-联吡啶结合不完全，还有一些剩余的4，4′-联吡啶未结合；

步骤(1)中所述的抗原偶联物为克伦特罗与载体蛋白偶联的物质，优选克伦特罗与牛血清白蛋白偶联的物质；

步骤(1)中所述的基底优选为常用于细胞观察的普通载玻片；

步骤(1)中所述的固定抗原偶联物的基底优选，通过如下步骤制备得到：将载玻片依次经过超声波清洗处理、水虎鱼溶液的浸泡处理、硅烷化处理以及戊二醛处理，得到能够有效连接蛋白质的载玻片，载玻片每经过一个处理都要用超纯水冲洗和惰性气体吹干；接着在吹干的载玻片上滴加抗原偶联物溶液，常温下固定后用超纯水冲洗，惰性气体吹干，再用牛血清蛋白中封闭硅烷化的载玻片的空白部位，取出后再次用超纯水冲洗，惰性气体吹干，得到固定抗原偶联物的基底；

所述的超纯水为电阻≥18MΩ的水；

所述的惰性气体优选为氮气；

所述的水虎鱼溶液为质量百分数30％的过氧化氢与质量分数98％以上的硫酸按体积比1∶3配制得到溶液；

所述的超声波清洗处理的条件优选为20～50KHz处理20～40min；更优选为40KHz处理30min；

所述的水虎鱼溶液的浸泡处理的条件优选为在沸腾的水虎鱼溶液浸泡20～40min；更优选为在沸腾的水虎鱼溶液浸泡30min；

所述的硅烷化处理优选为在体积百分比5～10％的3-氨基-三甲氧基硅烷(APTMS)甲醇溶液中浸泡12～36h；更优选为在体积百分比8％的3-氨基-三甲氧基硅烷甲醇溶液中浸泡24h；

所述的戊二醛处理优选为在体积百分比1～3％的戊二醛溶液中浸泡3～5h；更优选为在体积百分比2.5％的戊二醛溶液中浸泡4h；

步骤(1)中所述的室温反应的条件优选为25～30℃反应1～3h；

步骤(1)中所述的标准曲线的制备过程中，反应条件和待测样品的检测过程相同，区别仅在于用克伦特罗标准溶液取代待测样品；

步骤(1)中所述的标准曲线为克伦特罗标准溶液浓度与百分SERS信号强度值的标准曲线；所述的百分SERS信号强度值(B/B₀)是指不同浓度待测样品的SERS信号强度值的平均值(B)除以对照实验(标准克伦特罗浓度为0pg/mL)的SERS信号强度值(B₀)再乘以100％得到的值；

步骤(2)中所述的拉曼仪的操作条件优选为激发光源波长为632.8nm的He-Ne激光器，到达样品的激光功率为1mW，信号收集时间为10～60s，更优选为30s；

所述的数据处理是指利用Origin软件进行基线处理，从而得到清晰直观的SERS光谱图，根据SERS光谱图，以拉曼标记分子的振动特征谱峰为参考，选择合适的拉曼位移；

上述方法应用于检测克伦特罗，特别适用于微量或痕量的克伦特罗的检测，可应用于食品的安全检测领域。

本发明的原理在于：在固定好抗原偶联物的基底表面依次滴加待测样品或克伦特罗标准溶液和SERS纳米探针，待测样品或克伦特罗标准溶液与抗原偶联物可以竞争性地结合SERS纳米探针表面的抗体。与待测样品或克伦特罗标准溶液发生了偶联的SERS纳米探针在冲洗时可被清除，从而减少了结合在基底上的SERS纳米探针，基底上标记分子的SERS信号将变弱。因此基底上标记分子的SERS信号与待测样品浓度或克伦特罗标准溶液浓度成反比关系：即克伦特罗的浓度越高，可检测到的标记分子的SERS信号越低。基于上述原理，可在一定浓度区间内定量检测样品中的克伦特罗。

与现有技术相比，本发明具有如下的优点及有益效果：

(1)本发明与目前常用的酶联免疫方法相比，得到了一个更宽的检测区间(0.1～100pg/mL)和更高的灵敏度(0.1pg/mL)。

(2)本发明在猪尿中表现了很好的回收率以及特异性，实用性强。

(3)本发明操作简单，SERS纳米探针制备与抗原偶联物的固定都可以提前准备，操作时只需将待测样品与SERS纳米探针依次滴加至基底表面反应，反应结束后可以马上进行检测，这对于提高其应用性具有广泛的意义。

附图说明

图1是本发明所述应用竞争性表面增强拉曼散射检测克伦特罗的方法的流程示意图。

图2是实施例1中使用不同浓度的克伦特罗标准溶液得到的检测图；其中，a为SERS光谱图；b为强度柱形图。

图3是克伦特罗标准溶液浓度值与百分信号强度值的标准曲线图。

图4是实施例2得到的特异性检测图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：猪尿中克伦特罗的SERS检测，

猪尿中克伦特罗的SERS检测，其步骤如下所示(图1)：

(1)制备结合克伦特罗抗体的SERS纳米探针

制备金溶胶(蒋芸，崔颜，顾仁敖等.表面增强拉曼光谱研究以4，4′-联吡啶为标记分子的免疫检测[J].化学学报，2006，64(3)：240～244)：用水配制100mL、摩尔浓度为1mM的氯金酸溶液(HAuCl4)，置于三颈圆底烧瓶中加热至沸腾。然后加入6mL、摩尔浓度为38.8mM的柠檬酸钠溶液(用水配制)。此时金胶的颜色变化是：淡黄-无色-黑色-紫色-深红色，到达深红色后继续加热回流15～20min，即制得平均直径为30nm的金纳米粒子。然后取1mL新鲜制得的金纳米粒子(约6.02×10¹¹个)与30μL、摩尔浓度为0.01mM的4，4′-联吡啶(购自Sigma试剂公司)，常温(25～30℃)下标记10min后12000rpm离心5min，去上清，沉淀用1mL pH 8.2、2mM的硼酸缓冲液分散，得到分散的金胶；接着在1mL分散的金胶中加入5μL、质量浓度为0.5mg/mL的克伦特罗抗体(购自北京华安麦科生物技术有限公司)，反应2h后再次12000rpm离心5min，去上清，沉淀用1mL pH 8.2、2mM的硼酸缓冲液分散，得到分散体系；最后用20μL、质量浓度为2.5％的牛血清蛋白(购自Sigma试剂公司)封闭上述分散体系的剩余部位1h，12000rpm离心5min，去上清，沉淀用pH 7.4、10mM的磷酸缓冲液分散，即制得结合克伦特罗抗体的SERS纳米探针，4℃下保存待用。

(2)固定抗原偶联物的基底的制备

可参考文献《SERS标记纳米粒子用于免疫识别》(徐抒平等)进行制备。首先将尺寸为25mm×76mm×1mm的载玻片(购自江苏盐城市信泰医疗器械厂)经过40KHz的超声波清洗30min，取出后用超纯水(由ELGA LabWater公司的PURELAB Option-R纯水系统制备，电阻≥18MΩ)冲洗，氮气(购自广州普鲁克气体公司，纯度为99.99％)吹干；然后将吹干的载玻片浸泡在沸腾的水虎鱼溶液(30wt％过氧化氢与98wt％硫酸体积比为1∶3)中30min，取出后用大量超纯水冲洗，氮气吹干；接着将吹干的载玻片放入体积浓度为8％的3-氨基-三甲氧基硅烷(APTMS)(购自上海晶纯试剂有限公司)甲醇溶液中浸泡24h，取出后先用甲醇溶液(分析纯)彻底清洗，再用超纯水淋洗，氮气吹干，即为硅烷化的载玻片；再接着把硅烷化的载玻片浸于体积浓度为2.5％的戊二醛溶液中浸泡4h后用超纯水冲洗，氮气吹干；最后在上述处理好的载玻片上滴加100μL、50μg/mL抗原偶联物溶液(克伦特罗-BSA，购自北京华安麦科生物技术有限公司)，常温下固定2h后用超纯水冲洗，氮气吹干，置于牛血清蛋白中封闭剩余部位1h，取出后再次用超纯水冲洗，氮气吹干，备用。此时抗原偶联物已经成功固定于载玻片表面。

(3)待测样品或克伦特罗标准溶液与抗原偶联物发生竞争反应

①选择5个浓度的克伦特罗标准溶液(购自广州分析测试中心科力技术开发公司)，分别为0、0.1、1、10和100pg/mL，其中0pg/mL为对照实验，将克伦特罗标准溶液(50μL)和结合克伦特罗抗体的SERS纳米探针(50μL)依次滴在固定好抗原偶联物的载玻片表面。克伦特罗标准溶液与固定在载玻片表面的抗原偶联物竞争性地结合SERS纳米探针表面的抗体，在室温(25～30℃)下反应2h后用超纯水冲洗载玻片。

用日本Nippon Optical System公司的显微拉曼光谱仪，对载玻片表面上结合的SERS纳米探针进行信号采集，激发光源是波长为632.8nm的He-Ne激光器，到达样品的激光功率为1mW，信号收集时间为10～60s。信号采集完毕后通过Origin软件对数据进行基线处理，得到清晰直观的SERS光谱图(如图2a所示)及强度柱形图(如图2b所示)。根据SERS光谱图，以4，4′-联吡啶面内环呼吸振动特征谱峰为参考，选择拉曼位移为1612cm^-1。从图2a中可以明显地看到，随着克伦特罗浓度的提高，采集的SERS信号逐渐降低。从图2b可以看出，相比于0pg/mL处的信号强度，0.1～100pg/mL的强度有一个明显的降低趋势，表明在这一区间内能够进行有效的定量分析，同时看出该方法的检测限低至0.1pg/mL，比常用检测克伦特罗的ELISA法(检测限一般为0.1ng/mL)的灵敏度高1000倍。以克伦特罗标准溶液浓度为横坐标，以百分SERS信号强度值(B/B₀)为纵坐标，得到克伦特罗标准溶液浓度与百分SERS信号强度值的标准曲线：Y＝63.0-16.3log₁₀X，R²＝0.9980，如图3所示。

②用pH 7.4、10mM的磷酸缓冲液将阴性猪尿(由华南农业大学兽医学院提供，不含克伦特罗)稀释50倍，得到猪尿稀释液。将克伦特罗标准样品加入到猪尿稀释液中，克伦特罗标准样品在猪尿稀释液的浓度分别为0.1、1、10和100pg/mL，制成含克伦特罗的猪尿稀释液。用含克伦特罗的猪尿稀释液代替克伦特罗标准溶液进行检测，重复实施步骤①，得到猪尿稀释液的百分SERS信号强度值(B/B0)，从标准曲线读出猪尿稀释液浓度，乘以相应的稀释倍数即为猪尿中克伦特罗的实际浓度。从表1可以看出，猪尿中克伦特罗的平均回收率为111.9％，平均相对标准偏差(RSD)为10.5％，说明本发明具有很高的准确性和灵敏度。

由于克伦特罗结构稳定，其在体内不会被破坏分解，大量以原形从尿液中排出(时瑾等，盐酸克伦特罗的高灵敏时间分辨荧光免疫分析，卫生研究，2006，35(6)，798-801)。因此，可知本发明能有效地从尿液中检测到克伦特罗的存在。

表1竞争性表面增强拉曼散射(SERS)方法检测猪尿中克伦特罗的回收率

实施例2：克伦特罗的特异性检测

为了说明本发明的特异性，分别用莱克多巴胺和沙丁胺醇标准样品(购自广州分析测试中心科力技术开发公司)代替克伦特罗标准样品加入到稀释50倍的猪尿稀释液中，分别制成含莱克多巴胺的猪尿稀释液和含沙丁胺醇的猪尿稀释液，选择4个不同浓度的含莱克多巴胺和含沙丁胺醇的猪尿稀释液，分别为0、1、10和100pg/mL，代替含克伦特罗的猪尿稀释液作为待测样品进行检测，重复实施例1的过程。克伦特罗抗体与作为待测抗原的莱克多巴胺和沙丁胺醇是非配对抗体抗原，不具有选择性的识别作用。因此莱克多巴胺和沙丁胺醇不能与基底上的抗原偶联物竞争性地结合SERS纳米探针表面的抗体，所以超纯水冲洗后，含有不同浓度的莱克多巴胺或沙丁胺醇的猪尿稀释液所得到的SERS强度柱形图(图4)没有明显的区别，这说明本发明具有很强的特异性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种应用竞争性表面增强拉曼散射检测克伦特罗的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将待测样品和结合克伦特罗抗体的SERS纳米探针依次滴在固定抗原偶联物的基底的表面，室温反应，用超纯水清洗基底；同时用不同浓度的克伦特罗标准溶液和结合克伦特罗抗体的SERS纳米探针依次滴在固定好抗原偶联物的基底表面，制作标准曲线；抗原偶联物为克伦特罗与载体蛋白偶联的物质；

2.根据权利要求1所述的应用竞争性表面增强拉曼散射检测克伦特罗的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的结合克伦特罗抗体的SERS纳米探针包括金纳米粒子、拉曼标记分子和克伦特罗抗体。

3.根据权利要求2所述的应用竞争性表面增强拉曼散射检测克伦特罗的方法，其特征在于：所述的金纳米粒子的平均直径为30nm；

所述的拉曼标记分子为4，4′-联吡啶。

4.根据权利要求3所述的应用竞争性表面增强拉曼散射检测克伦特罗的方法，其特征在于：所述的结合克伦特罗抗体的SERS纳米探针通过如下方法制备得到：将平均直径为30nm的金纳米粒子与4，4′-联吡啶在室温下标记反应，离心，去上清，沉淀用硼酸缓冲液分散，得到分散的金胶；然后在分散的金胶中加入克伦特罗抗体，反应，离心，去上清，沉淀用硼酸缓冲液分散，得到分散体系；最后用牛血清蛋白进行封闭反应，离心，去上清，用磷酸缓冲液分散，即制得结合克伦特罗抗体的SERS纳米探针。

5.根据权利要求4所述的应用竞争性表面增强拉曼散射检测克伦特罗的方法，其特征在于：

所述的4，4′-联吡啶的用量为其分子数是金纳米粒子个数的300倍；

所述的室温温度为25～30℃；

所述的标记反应时间为5～30min；

所述的反应的时间为1～3h；

所述的硼酸缓冲液为pH 8.2、2mM的硼酸缓冲液；

所述的克伦特罗抗体的用量为每6.02×10¹¹个金纳米粒子使用2.5μg克伦特罗抗体；

所述的磷酸缓冲液为pH 7.4、10mM的磷酸缓冲液；

所述封闭反应的时间为0.5～2h；

所述的离心的条件为12000rpm离心5min。

6.根据权利要求1所述的应用竞争性表面增强拉曼散射检测克伦特罗的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的固定抗原偶联物的基底通过如下步骤制备得到：将载玻片依次经过超声波清洗处理、水虎鱼溶液的浸泡处理、硅烷化处理以及戊二醛处理，得到能够有效连接蛋白质的载玻片，载玻片每经过一个处理都要用超纯水冲洗和惰性气体吹干；接着在吹干的载玻片上滴加抗原偶联物溶液，常温下固定后用超纯水冲洗，惰性气体吹干，再用牛血清蛋白中封闭硅烷化的载玻片的空白部位，取出后再次用超纯水冲洗，惰性气体吹干，得到固定抗原偶联物的基底。

7.根据权利要求6所述的应用竞争性表面增强拉曼散射检测克伦特罗的方法，其特征在于：

所述的惰性气体为氮气；

所述的超声波清洗处理的条件为20～50KHz处理20～40min；

所述的水虎鱼溶液的浸泡处理的条件为在沸腾的水虎鱼溶液浸泡20～40min；

所述的硅烷化处理为在体积百分比5～10％的3-氨基-三甲氧基硅烷甲醇溶液中浸泡12～36h；

所述的戊二醛处理为在体积百分比1～3％的戊二醛溶液中浸泡3～5h。

8.根据权利要求1所述的应用竞争性表面增强拉曼散射检测克伦特罗的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的室温反应的条件为25～30℃反应1～3h；

步骤(1)中所述的标准曲线为克伦特罗标准溶液浓度与百分SERS信号强度值的标准曲线；百分SERS信号强度值是指不同浓度待测样品的SERS信号强度值的平均值除以对照实验的SERS信号强度值再乘以100％得到的值；

步骤(2)中所述的拉曼仪的操作条件为激发光源波长为632.8nm的He-Ne激光器，到达样品的激光功率为1mW，信号收集时间为10～60s；

所述的数据处理是指利用Origin软件进行基线处理。

9.权利要求1～8任一项所述的应用竞争性表面增强拉曼散射检测克伦特罗的方法的应用，其特征在于：所述的方法应用于检测微量或痕量的克伦特罗。