CN107153041A - 多氯联苯77检测的核酸适配体比色传感器的制备及应用 - Google Patents

多氯联苯77检测的核酸适配体比色传感器的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及多氯联苯77检测的核酸适配体比色传感器的制备及应用，将含一定碱基序列、具备特异性识别PCB 77能力的核酸适配体与比色分析技术结合，构筑得到多氯联苯77(PCB 77)核酸适配体比色传感器，由于采用专一性识别PCB 77的核酸适配体作为识别元件，大大提高了比色传感器检测PCB 77的灵敏度和选择性。PCB 77检测的线性范围为5×10‑10～9×10‑7mol/L，检测限达到5×10‑11mol/L。与现有技术相比，该方法具有操作简便、响应迅速、易于在线检测等优点。

Description

多氯联苯77检测的核酸适配体比色传感器的制备及应用
技术领域
本发明属于水污染检测与治理领域，尤其是涉及一种多氯联苯77检测的核酸适配体比色传感器的制备及应用。
背景技术
多氯联苯77(PCB 77)是一类广泛存在于环境中的高毒性低浓度的持久性有机环境污染物。20世纪以来，世界多地发生了多氯联苯污染事件，对人类、动物的健康以及环境造成了无法挽回的影响。较其他污染物而言，它具有高毒性低致死量的特点。在许多污水处理厂及沿江、河口地区均有发现PCBs的存在，而且它会存在于水体中，更会残留在土壤中，最后通过食物链富集到人体或动物体内，对生命体的神经，生殖等多系统造成无可挽回的影响。多氯联苯是具有209种同系物的持久性有机污染物。PCB 77，PCB 126，PCB 169都是平面构型，这种平面构型的PCBs比非平面型的PCBs毒性要高得多，被认为是其中一类毒性极强的类二噁英类PCBs(DL-PCBs)。高毒性的PCBs在实际水体中浓度却极低。因此如何建立的方法检测这种高毒性低浓度的污染物显得尤为重要。因此实现对PCB 77的快速、简便且高灵敏高选择性检测具有重要的现实意义。
目前，气质联用(GC-MS)做为最常见的标准检测办法(GB)可以实现对PCB的定量检测。但是其需要复杂的前处理过程，专门人员操作，费时费力，对仪器和操作人员的要求较高。近年来，研究人员也研制了一些新的实验方法，如电化学方法、荧光法、表面增强拉曼等新型方法来检测PCB 77。但是，它们并不能实现快速高灵敏检测的目标。相对地，比色法不仅操作简单，使用方便，方法灵活，不需要昂贵的大型仪器并具有目测法代替复杂仪器的潜力，而且可以实现对污染物的分析检测。但是，比色法本身缺乏选择性，无法达到对复杂环境体系中的高毒性低浓度污染物的检测要求，所以我们设想将核酸适配体作为特异性识别元素与比色相结合。因此，构筑基于特异性识别元件的比色传感器，在复杂的水样中实现对PCB 77的检测，具有重要的环境意义。
核酸适配体(aptamer)是通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)体外筛选得到的一种单链的DNA或者RNA序列，对靶标分子具有极高的亲和力，因此赋予了对靶物质极高的识别能力。核酸适配体可以和目标物发生类似于抗原和抗体的特异性结合，因此也被称为“化学抗体”。它具有结构和化学性质稳定的特点，可以识别一个或者一类目标物。此外，核酸适配体还具有合成周期短、合成成本低、稳定性高、易于修饰等优点。因此在本发明中，将特异性识别PCB 77的核酸适配体与比色分析方法结合，实现了对PCB 77的快速、灵敏以及高选择性检测。具体如下：将具有一定碱基序列的核酸适配体溶液和较高浓度的氯化钠溶液加入到金纳米粒子溶胶中。由于核酸适配体对金纳米粒子的保护作用结合较高浓度氯化钠的静电屏蔽作用，金纳米粒子倾向于互相分离。当向上述体系加入PCB 77溶液后，核酸适配体高亲和力特异性结合PCB 77分子，金纳米粒子失去了保护。在较高浓度氯化钠作用下，金纳米粒子团聚，特征等离子共振吸收峰由520nm红移至646nm，溶液颜色由红色变紫色或者蓝色。利用吸光度比值A646/A520的变化与PCB 77浓度之间的关系实现对PCB 77的分析检测。
发明内容
本发明的目的是针对现有检测PCB 77方法的仪器价格昂贵、操作复杂、分析耗时等不足而提供的一种基于一定碱基序列的核酸适配比色传感器的分析方法。利用具特异性识别PCB 77功能的核酸适配体分子作为传感器的识别元件，提高了比色传感器的选择性，增加了比色分析方法的灵敏度。同时，该比色分析方法具有制备简单、响应迅速、操作简便等优点。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
通过向制备的金纳米粒子溶胶中加入一定碱基序列的核酸适配体溶液和较高浓度的氯化钠溶液，室温下培育10～20min，构筑得到基于一定碱基序列的核酸适配体比色传感器。该核酸适配体比色传感器以PCB 77为检测对象，通过将不同浓度的PCB 77溶液加入到比色传感器溶液中，室温下作用10～20min后，采用紫外-可见分光光度计测定上述混合溶液的紫外-可见吸收光谱。通过测定的吸光度比值A646/A520与PCB 77浓度之间的关系可实现对PCB 77的高灵敏度和高选择性分析检测；具体步骤如下：
(1)所用玻璃仪器均经过王水浸泡、高纯水清洗干净并烘干待用。向洁净的烧杯中加入40～60mL的浓度为0.03～0.06mol/L的氯金酸(HAuCl4)溶液，持续加热至沸腾；持续搅拌下，将4～6ml浓度为0.03～0.04mol/L柠檬酸钠溶液加入到沸腾的HAuCl4溶液中，反应持续10～30min后停止加热。待溶液冷却至室温，用0.22μm的滤膜过滤得到金纳米粒子溶胶。
(2)向样品管中加入100～300μL的金纳米粒子溶胶，并分别加入30～70μL的核酸适配体溶液和15～25μL的NaCl溶液。作用10～20min后，得到核酸适配体比色传感器。其中，使用20-60个碱基的核苷酸序列做为与PCB 77发生特异性结合的核酸适配体。
(3)将不同浓度的PCB 77标准溶液分别加入步骤(2)制备的核酸适配体比色传感器溶液中，室温下静置培育10～20分钟。用紫外-可见分光光度计测定不同样品的紫外-可见吸收光谱。
(4)将PCB 77溶液和100倍于PCB 77溶液浓度的干扰物溶液分别加入步骤(2)制备的核酸适配体比色传感器的溶液中，室温下静置作用10～20分钟，用紫外-可见分光光度计测定不同样品的紫外-可见吸收光谱。
(5)取实际水样，先经过滤纸过滤以除去其中所含的颗粒物与悬浮物。随后用0.22μm的滤膜进行多次过滤，对江水样品进一步纯化。向纯化后的江水样品中加入PCB 77标准溶液，使得江水样品中PCB 77的含量为2×10-8mol/L。将预处理后的水样加入到步骤(2)制备的核酸适配体比色传感器溶液中，室温下静置培育10～20min，以紫外-可见分光光度计测定不同样品的紫外-可见吸收光谱。
与现有技术相比，本发明将操作简便、响应迅速的比色分析技术与对PCB 77具有特异性识别能力的核酸适配体技术相结合，构筑了一个新颖的PCB 77核酸适配体比色传感器。利用特异性识别PCB 77功能的核酸适配体分子作为传感器的识别元件，提高了比色传感器的选择性，增加了比色分析方法的灵敏度。该传感器可同时实现对PCB 77的高灵敏度和高选择性分析检测。与现有PCB 77的检测技术相比，本发明具体以下优点：
(1)与传统分析方法如高效气相色谱质谱法相比，本发明中构筑的核酸适配体比色传感器不需要借助复杂大型的仪器、操作简单、灵敏度高、可实现对PCB 77的快速检测。
(2)与现有的生物传感器相比，本发明直接将核酸适配体溶液与金纳米粒子溶胶混合，制备得到核酸适配体比色传感器，该传感器制备简单，具有较高的稳定性和重现性；选取合成成本低、稳定性高、易于修饰等优点的核酸适配体作为传感器的识别元素，提升了比色分析方法的灵敏度和选择性。
附图说明
图1为构筑的核酸适配体比色传感器的吸光度比值A646/A520随PCB 77浓度对数的变化曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种用于PCB 77快速检测的基于一定碱基序列的核酸适配体比色传感器，以金纳米粒子溶胶为基体，通过PCB 77与金纳米粒子竞争结合核酸适配体引起金纳米粒子聚集程度的改变，实现对PCB 77的分析。核酸适配体比色传感器的具体制备步骤如下：
(1)所用玻璃仪器均经过王水浸泡、高纯水清洗干净并烘干待用。制备时，向洁净的烧杯中加入100mL的浓度为0.05mol/L的氯金酸(HAuCl4)溶液，持续加热至沸腾；持续搅拌下，将10ml浓度为0.0388mol/L柠檬酸钠溶液加入到沸腾的HAuCl4溶液中，反应持续20分钟后停止加热。待溶液冷却至室温，用0.22μm的滤膜过滤得到金纳米粒子溶胶。
(2)向样品管中加入200μL(1)中制备得到的金纳米粒子溶胶，随后分别加入55μL的核酸适配体溶液和20μL的NaCl溶液，25℃作用15min后，得到特异性识别PCB 77的核酸适配体比色传感器。实验中使用的PCB 77的核酸适配体的碱基序列为：
5′-GGCTA-CGAAG-TAGTG-
ATTTT-TTCCG-ATGGC-CCGTG-3′
实施例2
对于核酸适配体比色传感器制备过程中的两个浓度参数和反应时间参数：核酸适配体和氯化钠的最优浓度，反应时间的最优量进行了确定。具体为：取一系列的金纳米粒子溶胶，分别向其中加入不同浓度的适配体溶液和氯化钠溶液，配制得到核酸适配体的浓度位于1.40×10-8～1.40×10-7mol/L的范围、氯化钠的浓度位于0.01～0.04mol/L范围内的一系列核酸适配体比色传感器溶液。分别以紫外-可见分光光度计测定上述系列溶液的A646/A520。研究结果表明，当适配体的浓度为3.8×10-7mol/L，氯化钠的浓度为0.0345mol/L时，A646/A520的比值最大。因此，在核酸适配体比色传感器的构筑过程中所采用的核酸适配体和氯化钠的最优浓度分别为3.8×10-7mol/L，0.0345mol/L。
实施例3
取PCB 77液体样品，先用正己烷配制得到1.0×10-3mol/L的PCB 77母液，再分别用不同体积的乙醇对上述PCB 77母液进行稀释，配制得到一系列不同浓度的PCB 77的标准溶液。取实施例1中制备得到的核酸适配体比色传感器溶液，分别向其中加入不同浓度的PCB77溶液，25℃下作用3min后，以紫外-可见分光光度计测定溶液的紫外-可见吸收光谱。研究结果表明，随着测试体系中PCB 77浓度的增加，金纳米粒子的特征等离子共振吸收峰由520nm红移至646nm。PCB 77的浓度越高，金纳米粒子位于646nm处的吸光度值A646越大，位于520nm处的吸光度值A520越小，此时二者的比值A646/A520越大。利用A646/A520与PCB 77浓度的对数之间的线性关系建立工作曲线，如图1所示，左上角插图为PCB 77的核酸适配体碱基序列；右下角插图为加入不同浓度的PCB 77的核酸适配体比色传感器溶液的紫外-可见吸收光谱。如图所示，随着加入污染物浓度的依次增加，金纳米粒子在520nm处的紫外吸收峰强度越来越低，在646nm处的紫外吸收峰强度越来越高。本发明中，核酸适配体比色传感器测定PCB 77的线性范围为5×10-10～9×10-7mol/L，检测限为5×10-11mol/L。
实施例4
(1)向样品管中加入200μL实施例1中制备得到的金纳米粒子溶胶，随后分别加入55μL的核酸适配体溶液和20μL的NaCl溶液，25℃作用15min后，得到特异性识别PCB 77的核酸适配体比色传感器。再分别向其中加入实施例3中配制的不同浓度的PCB 77溶液，25℃下作用3min后，以紫外-可见分光光度计测定溶液的紫外-可见吸收光谱。研究结果表明，随着测试体系中PCB 77浓度的增加，金纳米粒子的特征等离子共振吸收峰由520nm红移至646nm。PCB 77的浓度越高，金纳米粒子位于646nm处的吸光度值A646越大，位于520nm处的吸光度值A520越小，此时二者的比值A646/A520越大。可见，具有40个碱基的核酸适配体所制备的PCB 77核酸适配体比色传感器在测定PCB 77时表现出特异性识别能力。本实验中使用的PCB 77的核酸适配体的碱基序列为：
5′-GGCGG-GGCTA-CGAAG-TAGTG-
ATTTT-TTCCG-ATGGC-CCGTG-3′
(2)向样品管中加入200μL，实施例1中制备得到的金纳米粒子溶胶，随后分别加入55μL的错配碱基的核酸适配体溶液和20μL的NaCl溶液，25℃作用15min后，得到错配碱基的核酸适配体比色传感器。分别向其中加入实施例3中配制的不同浓度的PCB 77溶液，25℃下作用3min后，以紫外-可见分光光度计测定溶液的紫外-可见吸收光谱。研究结果表明，随着测试体系中PCB 77浓度的增加，金纳米粒子的特征等离子共振吸收峰仍处在520nm位置，并没有发生红移。随着PCB 77的浓度越高，金纳米粒子位于520nm处的吸光度值A520并未发生变化。可见，所制备的错配碱基的核酸适配体比色传感器在测定PCB 77时并没有发生特异性识别。本实验中使用的错配碱基的核酸适配体的序列为：
5′-GGCGG-AATTA-CGAAG-CCATG-
ATTTT-GGACG-ATGGC-TTATG-3′
实施例5
取实施例1中制备得到的核酸适配体比色传感器溶液，分别向其中加入1×10- 8mol/L的PCB 77标准溶液和1×10-6mol/L的腐殖酸标准溶液，25℃下作用3min后，以紫外-可见分光光度计分别测定加入了PCB 77和腐殖酸的核酸适配体比色传感器溶液的紫外-可见吸收光谱。研究结果表明，加入1×10-8mol/L的PCB 77标准溶液引起的金纳米粒子吸收比A646/A520为1.3882，而加入100倍浓度于PCB 77的腐殖酸引起的金纳米粒子吸收比A646/A520为0.2675，远小于PCB 77引起的吸光度的变化值。可见，所制备的核酸适配体比色传感器在测定PCB 77时表现出较高的选择性。环境中与PCB 77共存的污染物腐殖酸加入待测体系后，并不对核酸适配体比色传感器测定PCB 77造成干扰。
实施例6
取实际江水样品，先经过滤纸过滤以除去其中所含的颗粒与悬浮物，随后用0.22μm的滤膜进行多次过滤，对江水样品进一步纯化。向纯化后的江水样品中加入PCB 77标准溶液，使得江水样品中PCB 77的含量为2×10-7mol/L。测试时，将上述预处理的水样加入到核酸适配体比色传感器溶液中，25℃温度下作用3min后，以紫外-可见分光光度计测定上述溶液的紫外-可见吸收光谱。研究结果表明，以构筑的核酸适配体比色传感器测定江水样品中PCB 77含量的回收率为97％之间，相对标准偏差(n＝3)为9.2％。从测试的结果来看，制备的核酸适配体比色传感器在测定PCB 77时表现出较高的灵敏度与准确性。该核酸适配体比色传感器的制备为水体中PCB 77的分析检测提供一种简便、快捷的分析方法。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (4)

1.一种多氯联苯77检测的核酸适配体比色传感器的制备方法，其特征在于，该制备方法将含碱基序列、具备特异性识别PCB 77能力的核酸适配体与比色分析技术结合，构筑得到多氯联苯77(PCB 77)核酸适配体比色传感器。
2.根据权利要求1所述的一种多氯联苯77检测的核酸适配体比色传感器的制备方法，其制备的具体步骤和特征如下：
(1)向洁净的烧杯中加入40～60mL浓度为0.03～0.06mol/L的氯金酸(HAuCl4)溶液，持续加热至沸腾；快速搅拌下，将4～6mL浓度为0.03～0.04mol/L柠檬酸钠溶液加入到沸腾的HAuCl4溶液中，持续10～30分钟后停止加热，待溶液冷却至室温，用0.22μm的滤膜过滤得到金纳米粒子溶胶；
(2)向样品管加入100～300μL的金纳米粒子溶胶，并分别加入30～70μL的核酸适配体溶液和15～25μL的NaCl溶液，作用10～20分钟后，得到核酸适配体比色传感器，使用含有20-60个碱基且与PCB 77之间具有特异性结合能力的碱基序列做为PCB 77核酸适配体溶液。
3.多氯联苯77检测的核酸适配体比色传感器对PCB 77的选择性检测应用，其特征在于，采用以下步骤：
(1)将不同浓度的PCB 77标准溶液分别加入到制备得到的核酸适配体比色传感器的溶液中，室温下作用10～20分钟，用紫外-可见分光光度计分别测定不同样品的紫外-可见吸收光谱，根据吸光度A646/A520的比值与PCB 77浓度之间的线性关系建立工作曲线；
(2)取实际水样，先经过滤纸过滤以除去其中所含的颗粒物与悬浮物。随后用0.22μm的滤膜进行多次过滤，对江水样品进一步纯化，然后将其置于核酸适配体比色传感器的溶液中，室温下静置培育10～20min，以紫外-可见分光光度计测定不同样品的紫外-可见吸收光谱，与上述工作曲线进行比对，检测得到水体中PCB77的含量。
4.根据权利要求3所述的多氯联苯77检测的核酸适配体比色传感器对PCB77的选择性检测应用，其特征在于，PCB 77核酸适配体比色传感器对PCB 77的选择性检测方法具体包括以下步骤：向含有传感器的溶液中分别加入PCB 77溶液和100倍PCB 77浓度的干扰物溶液，采用紫外-可见分光光度计测定混合液的紫外-可见吸收光谱，根据加入的PCB 77和干扰物引起的金纳米粒子吸光度比值A646/A520的变化实现对PCB 77的选择性分析，所述的干扰物为腐殖酸、PCB 72、PCB 101、PCB 126、萘、芘、阿特拉津或双酚A中的任意一种。
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