CN108956566A - 基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测多氯联苯试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于环境安全检测免疫分析技术领域，涉及一种基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测多氯联苯试剂盒及检测方法。该试剂盒包括以下组分：(1)磁性微米颗粒；(2)特异性识别多氯联苯PCB72/106的适配体；(3)与适配体至少部分互补的互补DNA；(4)上转换纳米颗粒；(5)用于杂交链式反应的一对发卡DNA；(6)切刻内切酶；其中，所述互补DNA能够引发所述一对发卡DNA进行杂交链式反应。本发明的方法能够高灵敏的检测多氯联苯PCB72/106。

Description

基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测 多氯联苯试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于环境安全检测免疫分析技术领域，更具体地，涉及一种基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测多氯联苯试剂盒，以及利用该试剂盒的多氯联苯PCB72/106的检测方法。
背景技术
多氯联苯(Polychlorinated biphenyls，PCBs)又称氯化联苯，有209种不同的PCBs同源物，是人工合成的有机物，在工业上用作热载体、绝缘油和润滑油等。它极难分解，因而能够在生物体脂肪中大量富集，是持久的环境污染物。使用PCBs的工厂排出的废弃物是PCBs污染的主要来源。多氯联苯在工业上的广泛使用，已造成全球性环境污染问题。由于生产和使用中产生的多氯联苯废弃物能经皮肤、呼吸道、消化道而被人体吸收，甚至超痕量级别的也可以在人体组织中富集，严重时危及人的健康和生命安全。
目前常用的检测PCBs的方法包括色谱法、免疫检测法、电化学检测法、拉曼光谱检测法等。其中，气相色谱法(gas chromatography，GC)和气相色谱-质谱联用法(gaschromatography-mass spectrometer，GC-MS)有较好的灵敏度，但是耗时费力且昂贵，难以应用到现场检测；其他方法灵敏度一般，且普遍操作较为复杂。随着新技术的出现和发展，进一步提高PCBs检测传感器的灵敏度和便捷性并用于现场检测成为研究的热门话题。
因此，有必要开发一种高灵敏度的检测方法，对PCBs进行监测。
发明内容
本发明的目的是一种基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测多氯联苯试剂盒，以及利用该试剂盒的多氯联苯PCB72/106的检测方法。该方法能够高灵敏的检测多氯联苯PCB72/106。
为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测多氯联苯试剂盒，该试剂盒包括以下组分：
(1)磁性微米颗粒；
(2)特异性识别多氯联苯PCB72/106的适配体；
(3)与适配体至少部分互补的互补DNA；
(4)上转换纳米颗粒；
(5)用于杂交链式反应的一对发卡DNA；
(6)切刻内切酶；
其中，所述互补DNA能够引发所述一对发卡DNA进行杂交链式反应。
本发明的原理如图1所示，首先，适配体和磁性微米颗粒通过链霉亲和素和生物素的相互作用连接在一起。然后，适配体和互补DNA杂交。当目标物存在时，适配体识别目标物并与其结合，从而释放出互补DNA。被释放的互补DNA作为引发链引发杂交链式反应(hybridization chain reaction，HCR)，然后再与上转换纳米颗粒UCNPs连接，由于发卡结构打开，UCNPs与猝灭基团BHQ-1的距离变远，荧光得到一定恢复，实现第一重放大。发卡DNA上设计有切刻内切酶的识别位点，当HCR被引发形成双链后，切刻内切酶会在双链的特定位点进行切割，UCNPs离开双链DNA从而远离BHQ-1，荧光得到最大程度的恢复，实现双重放大。UCNPs荧光信号的强度与加入的PCB72/106的浓度成正相关关系，可以对其进行定量检测，制作标准曲线。对待测样品进行同样方法测定，将测得的荧光信号代入标准曲线，得到其中PCB72/106的浓度。
由于多氯联苯PCB72(2,3',5,5'-四氯联苯)和PCB106(2',3',4',5,5'-五氯联苯)具有相同的适配体，因此，本发明方法的检测对象可为PCB72、PCB106或二者的混合物。本发明中，术语“PCB72/106”既可以指PCB72，也可以指PCB106。
基于本发明的上述原理，可设计各组分的具体序列，优选地，所述适配体具有SEQID NO：1所示序列(5’-TTTTTCACTCGGACCCCATTCTCCTTCCATCCCTCATCCGTCCAC-3’)。所述磁性微米颗粒与适配体可以单独提供，也可以共同以磁性微米颗粒-适配体偶联物的形式提供。所述磁性微米颗粒与适配体之间可通过各种常规方式偶联，优选地，可通过生物素-链霉亲和素实现偶联。此时，所述适配体5’端优选具有biotin修饰基团。
根据本发明，互补DNA既要与适配体具有一定互补配对能力，又要能够引发后面的HCR扩增。优选地，所述互补DNA具有SEQ ID NO：2所示序列；5’-GACAAGAGGGATGGGCTGAGGAGA-3’。
本发明中，所述一对发卡DNA包括第一发卡DNA和第二发卡DNA，所述第一发卡DNA的5’端修饰有NH2基团，3’端修饰有上转换纳米颗粒的猝灭基团，所述第一发卡DNA的5’端含有切刻内切酶识别位点；所述第二发卡DNA的5’端修饰有上转换纳米颗粒的猝灭基团，3’端修饰有NH2基团，所述第二发卡DNA的3’端含有切刻内切酶识别位点；所述上转换纳米颗粒的猝灭基团优选为BHQ-1基团。
基于HCR的反应原理和本发明的上述原理，本领域技术人员可设计合适的发卡DNA，根据本发明一种优选实施方式，所述第一发卡DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示(5’-TTTCTCCTCAGCCCATCCCTCTTGTCGAAGGAGACAAGAGGGATGGGCTG-3’)，具有修饰基团后为5’-NH2C6-TTTCTCCTCAGCCCATCCCTCTTGTCGAAGGAGACAAGAGGGATGGGCTG-BHQ-1-3’，所述第二发卡DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示(5’-GACAAGAGGGATGGGCTGAGGAGACAGCCCATCCCTCTTGTCTCCTTCTT-3’)，具有修饰基团后为5’-BHQ-1-GACAAGAGGGATGGGCTGAGGAGACAGCCCATCCCTCTTGTCTCCTTCTT-C6NH2-3’。
本发明中，所述切刻内切酶可以为本领域常规各种切刻内切酶，所述切刻内切酶识别位点即与其相应的识别位点，为减少HCR的非特异性扩增，优选地，第一发卡DNA和第二发卡DNA上的内切酶识别位点不同，对应的所述切刻内切酶分别为Nt.BbvCI和Nt.BsmAI。
根据本发明，所述上转换纳米颗粒表面优选具有羧基修饰基团，可与发卡DNA的氨基进行缩合反应，实现上转换纳米颗粒与发卡DNA的连接。
本发明中，所述上转换纳米颗粒优选为NaYF4:Yb,Er。该上转换纳米颗粒可通过本领域常规方法制备得到。
根据本发明一种具体实施方式，上述上转换纳米颗粒通过以下方法制得：
①2mmol Re(CF3COO)3(Y:Yb:Er＝78％：20％：2％)，8mmol三氟乙酸钠和40mL有机溶剂(20mL OA/20mL ODE)并在氮气保护下于100℃保持1h。
②将其缓慢加热至320℃并在此温度下磁力搅拌1h。然后自然冷却至室温，并加入无水乙醇,通过离心获得沉淀物。
③用水和乙醇反复洗涤沉淀物三次后，得到UCNPs。
④将1g PAA分散在20mL DEG(二甘醇)中，并将混合物加热至110℃并剧烈搅拌30min。
⑤将上述UCNPs(60mg)分散到4mL甲苯中。将该混合物迅速加入到含有PAA的溶液中，并在该温度下保持搅拌15min以蒸发甲苯。
⑥在240℃保持1h。然后冷却至室温，并加入过量的稀盐酸。通过离心获得白色沉淀，通过用纯水洗涤三次除去过量的PAA。所得产物在表面上具有羧基修饰，分散在PBS中使用。
根据本发明，优选地，所述磁性微米颗粒的直径为250-350nm，所述上转换纳米颗粒的直径为25-35nm。特定尺寸的磁性微米颗粒能够进一步提高检测的灵敏度。特定尺寸的UCNPs能够满足修饰的要求。
本发明的第二方面提供利用上述基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测多氯联苯试剂盒的多氯联苯PCB72/106的检测方法，该方法包括：
(1)获取磁性微米颗粒-适配体偶联物；
(2)将磁性微米颗粒-适配体偶联物与互补DNA孵育，去除未杂交的互补DNA；
(3)将一系列浓度梯度的多氯联苯PCB72/106标准品溶液与步骤(2)所得产物混合孵育，磁场分离，收集上清；
(4)将一对发卡DNA与步骤(3)所得上清混合孵育；
(5)将活化的上转化纳米颗粒加入步骤(4)所得孵育溶液中，震荡反应；
(6)向步骤(5)所得反应液中加入切刻内切酶及其酶反应液，进行酶反应；
(7)测量步骤(6)所得反应产物溶液的荧光信号，建立多氯联苯PCB72/106标准品浓度与荧光信号的标准曲线；
(8)将含有多氯联苯PCB72/106的待测液进行上述测试，将得到的荧光信号代入步骤(7)的标准曲线，计算待测液中多氯联苯的浓度；
所述多氯联苯PCB72/106标准品为多氯联苯PCB72标准品或多氯联苯PCB106标准品。
本发明中，UCNPs、与所述UCNPs连接的发卡DNA以及与所述UCNPs连接的HCR产物可统称为UCNPs检测探针。
本发明中，所述磁性微米颗粒-适配体偶联物可采用本领域常规的方法制得，例如，在37℃下将链霉亲和素化的磁性微米颗粒(50μL，10mg/mL)与生物素化的适配体(210pmol)温育10小时以使适配体固定在磁性微米颗粒的表面上。
根据本发明，所述一系列浓度梯度的多氯联苯PCB72/106标准品溶液的浓度范围可以为0.001-1000ng/mL。
所述测量步骤(6)所得反应产物溶液的荧光信号的条件与所用上转换纳米颗粒相关，对于NaYF4:Yb,Er，测量条件优选包括：激发波长980nm，狭缝宽度10nm，发射波长545nm。
本发明中，发卡DNA可商购获得，HCR的方法优选包括如下步骤：
将购买的含发卡DNA序列的离心管在4000rpm离心30s，按照说明加入缓冲液配制成10μM浓度的溶液。将发卡DNA放入PCR仪中，95℃解链5min，缓慢降温至室温(约1.5h)；加入一定量的互补DNA在37℃条件下分别反应0、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180min，然后再通过氨基羧基反应连接UCNPs，比较不同反应时间的荧光恢复强度，确定最佳反应条件为1h。
根据本发明，UCNPs和HCR产物连接的方法优选包括如下步骤：
将购买的含发卡DNA序列的离心管在4000rpm离心30s，按照说明加入缓冲液配制成10μM浓度的溶液。将发卡DNA放入PCR仪中，95℃解链5min，缓慢降温至室温(约1.5h)；加入一定量的互补DNA在37℃条件下反应1h，然后再通过氨基羧基反应连接不同浓度的UCNPs(0，0.5，1，1.5，2，2.5mg/mL)，比较不同条件下的荧光恢复强度，确定最佳UCNPs浓度为2mg/mL。
本发明用UCNPs替代了传统的荧光基团，进一步减小了背景信号的干扰，提高了荧光强度和稳定性；通过添加切刻内切酶识别特定位点切割双链中的一条单链，进一步释放UCNPs，使其更加远离猝灭基团，提高了荧光的恢复值。因此，本发明的试剂盒和方法具有灵敏度高、检测范围宽、特异性好等优点，对PCB72/106的超灵敏检测具有重要的实际意义，对于实现现场快速、超灵敏检测技术具有很好的指导意义。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为本发明的检测原理图。
图2为上转换纳米粒子(UCNPs)透射电镜图。
图3为以PCB72标准品的浓度为横坐标，各浓度对应的荧光强度为纵坐标绘制的标准曲线。
图4为基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测多氯联苯PCB72的特异性实验，左侧柱代表10ng/mL，右侧柱代表100ng/mL。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例中，适配体、互补DNA、发卡DNA序列及猝灭基团BHQ-1均由上海生工生物有限公司合成，稀土金属等化学试剂购自Sigma公司，实验中所用到的多氯联苯PCB72标准品购自Accu Standard(New Haven,USA)公司，Nt.BbvCI和Nt.BsmAI切刻内切酶购自美国NewEngland BioLabs公司。F97pro荧光分光光度计购自上海棱光公司。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下实施例中：
适配体：5’-biotin-TTTTTCACTCGGACCCCATTCTCCTTCCATCCCTCATCCGTCCAC-3’
互补DNA：5’-GACAAGAGGGATGGGCTGAGGAGA-3’
发卡DNA-1：5’-NH2C6-TTTCTCCTCAGCCCATCCCTCTTGTCGAAGGAGACAAGAGGGATGGGCTG-BHQ-1-3’
发卡DNA-2：5’-BHQ-1-GACAAGAGGGATGGGCTGAGGAGACAGCCCATCCCTCTTGTCTCCTTCTT-C6NH2-3’
实施例1
基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测多氯联苯PCB72的方法建立。
1)磁性微米颗粒的制备：
①使用王水清洗所有的玻璃器皿，用去离子水充分清洗，然后在100℃干燥箱中烘干。
②将FeCl3·6H2O(1.3g，8mmol)和CH3COONa(0.8g，2.72mmol)溶于乙二醇(40mL)中形成溶液，然后加入Na3C6H5O7(2.4g)。剧烈搅拌混合物30分钟，然后密封在聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜(50mL容量)中。高压釜在210℃保持15h，冷却至室温，得到黑色产物。
③黑色产物用乙醇洗涤数次，并在60℃下干燥12h。
④将羧基化磁球(100μL，2mg/mL)与缩合偶联试剂EDC(50μL，0.2mg/mL)和NHS(25μL，0.2mg/mL)在PBS缓冲液(10mmol/L，pH 6)中混合，反应1小时后，磁分离并洗涤三次，沉淀用PBS缓冲液(10mmol/L，pH 7.4)分散。活化后的磁球与链霉亲和素(100μL，0.1mg/mL)混合。
⑤将混合物在37℃振荡反应2h。反应完成后，产物用PBS缓冲液洗涤三次。
2)磁性微米颗粒偶联适配体和互补链DNA：
①在37℃下将链霉亲和素化的磁性微米颗粒MMP(50μL，10mg/mL)与生物素化的适配体(210pmol)温育10小时以使适配体固定在MMP的表面上，得到MMPs-Apt，用外部磁铁去除未连接的适配体。
②将MMPs-Apt(200μL)和过量互补DNA的溶液在37℃杂交30分钟，用外部磁铁去除未杂交的互补DNA。
3)UCNPs的制备：
①2mmol Re(CF3COO)3(Y:Yb:Er＝78％：20％：2％)，8mmol三氟乙酸钠和40mL有机溶剂(20mL OA/20mL ODE)并在氮气保护下于100℃保持1h。
②将其缓慢加热至320℃并在此温度下磁力搅拌1h。然后自然冷却至室温，并加入无水乙醇,通过离心获得沉淀物。
③用水和乙醇反复洗涤沉淀物三次后，得到UCNPs。
④将1g PAA分散在20mL DEG(二甘醇)中，并将混合物加热至110℃并剧烈搅拌30min。
⑤将上述UCNPs(60mg)分散到4mL甲苯中。将该混合物迅速加入到含有PAA的溶液中，并在该温度下保持搅拌15min以蒸发甲苯。
⑥在240℃保持1h。然后冷却至室温，并加入过量的稀盐酸。通过离心获得白色沉淀，通过用纯水洗涤三次除去过量的PAA。所得产物在表面上具有羧基修饰，分散在PBS中使用。所得UCNPs的透射电镜图如图2所示。
4)PCB72和适配体结合：在含有磁性微米颗粒探针的缓冲液中(100μL)，加入一系列浓度梯度的PCB72标准品100μL，37℃孵育1h，磁场分离，收集上清。
5)将购买的含发卡DNA的离心管4000rpm 30s离心，按照说明加入缓冲液配制成10μM浓度的溶液。将发卡DNA放入PCR仪中，95℃解链，缓慢降温至室温(约1.5h)，得到第一发卡DNA H1和第二发卡DNA H2。
6)10μL H1(10μmol/L)和10μL H2(10μmol/L)加入到之前磁分离得到的上清(80μL)中，放入金属浴中37℃杂交1h。得到HCR扩增产物。
7)使UCNPs和EDC、NHS进行活化反应，即把EDC、NHS用PBS溶成10mg/mL，在100μL上转换悬浮液中(5mg/mL，用PBS分散，pH调至7)加入565μL缓冲液，先加入100μL EDC震荡反应10min，再加入35μL的NHS，37℃震荡反应20min，然后离心，用PBS洗涤三次并复溶使终浓度为2mg/mL。
8)向步骤6)的100μL体系中添加活化后的上转换颗粒悬浮液100μL，在37℃条件下震荡反应5h。
9)添加15U Nt.BbvCI、15U Nt.BsmAI和10×NEB缓冲液(15μL)到步骤8)的混合物中使最终体积达到150μL，在37℃条件下震荡反应1h，然后用F97pro荧光分光光度计(激发波长980nm，狭缝宽度10nm，电压700V)在室温下检测荧光信号，发射波长为545nm。
10)检测不同浓度的PCB72(0.004，0.008，0.02，0.08，0.32，2，16，100，800ng/mL)，并得到了荧光图谱。利用软件计算得到其标准曲线为F＝119.6366lgC+618.8279(R2＝0.9978)，检测范围是0.004-800ng/mL，检出限是0.0035ng/mL(S/N＝3)。以荧光信号为纵坐标，PCB72标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，如图3所示。
实施例2
基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光传感器检测水中多氯联苯PCB72的方法。
1)以五种不同浓度向水中添加PCB72：0，0.1，1，10和100ng/mL。将水样(35mL)和氯化钠(6g)在离心管中混合，并加入正己烷(2mL)，得到五种不同浓度的待测水样。
2)剧烈振动3分钟，然后静置15分钟。收集上清液并在N2下干燥，将残余物重新溶解在1％甲醇中，重复萃取三次，合并上清。
3)在含有磁性微米颗粒探针的缓冲液中(100μL)，加入五种待测水样各100μL，37℃孵育1h，磁场分离，收集上清(80μL)。
4)将购买的含发卡DNA的离心管4000rpm 30s离心，按照说明加入缓冲液配制成10μM浓度的溶液。将发卡DNA放入PCR仪中，95℃解链，缓慢降温至室温(约1.5h)，得到第一发卡DNA H1和第二发卡DNA H2。
5)10μL H1(10μmol/L)和10μL H2(10μmol/L)加入到之前磁分离得到的上清(80μL)，放入金属浴中37℃杂交1h。
6)向步骤5)的100μL体系中添加活化后的上转换颗粒悬浮液(100μL，2mg/mL)，在37℃条件下震荡反应5h。
7)添加15U Nt.BbvCI、15U Nt.BsmAI和10×NEB缓冲液(15μL)到步骤6)的混合物中使最终体积达到150μL，在37℃条件下震荡反应1h，然后用F97pro荧光分光光度计(激发波长980nm，狭缝宽度10nm，电压700V)在室温下检测荧光信号，发射波长为545nm。
8)通过标准曲线计算检测的浓度与实际添加浓度比较，回收率的范围为93.4％-109.7％，RSD范围为1.6％-2.9％。结果表明该检测方法可以应用到实际水样检测，并且前处理简单。
实施例3
基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光传感器检测土壤中多氯联苯PCB72的方法。
1)称5g干土于30mL离心管中，以五种不同浓度添加PCB72：0，0.1，1，10和100ng/mL；加入5mL正己烷。将管放入超声波浴中30min。得到五种浓度的待测样品；
2)将混合溶液以10000rpm离心10min，取上清液用0.22μm的膜过滤。滤液在环境温度下用N2干燥，将残余物重新溶解在1％甲醇中，重复萃取三次，合并上清。
3)在含有磁性微米颗粒探针的缓冲液中(100μL)，加入五种待测样品各100μL，37℃孵育1h，磁场分离，收集上清(80μL)。
4)将购买的含发卡DNA的离心管4000rpm 30s离心，按照说明加入缓冲液配制成10μM浓度的溶液。将发卡DNA放入PCR仪中，95℃解链，缓慢降温至室温(约1.5h)，得到第一发卡DNA H1和第二发卡DNA H2。
5)10μL H1(10μmol/L)和10μL H2(10μmol/L)加入到之前磁分离得到的上清(80μL)，放入金属浴中37℃杂交1h。
6)向步骤5)的100μL体系中添加活化后的上转换颗粒悬浮液(100μL，2mg/mL)，在37℃条件下震荡反应5h。
7)添加15U Nt.BbvCI、15U Nt.BsmAI和10×NEB缓冲液(15μL)到步骤6)的混合物中使最终体积达到150μL，在37℃条件下震荡反应1h，然后用F97pro荧光分光光度计(激发波长980nm，狭缝宽度10nm，电压700V)在室温下检测荧光信号，发射波长为545nm。
8)通过标准曲线计算检测的浓度与实际添加浓度比较，回收率的范围为983.2％-118.5％，RSD范围为2.1％-3.2％。结果表明该检测方法可以应用到实际土壤样品检测，并且前处理简单。
实施例4
多氯联苯PCB72的切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测方法特异性实验。
1)在含有磁性微米颗粒探针的缓冲液中(100μL)，加入一定浓度的待测物标准品100μL(10ng/mL，100ng/mL)，37℃孵育1h，磁场分离，收集上清(80μL)。
2)将购买的含发卡DNA的离心管4000rpm 30s离心，按照说明加入缓冲液配制成10μM浓度的溶液。将发卡DNA放入PCR仪中，95℃解链，缓慢降温至室温(约1.5h)，得到第一发卡DNA H1和第二发卡DNA H2。
3)10μL H1(10μmol/L)和10μL H2(10μmol/L)加入到之前磁分离得到的上清(80μL)，放入金属浴中37℃杂交1h。
4)向步骤3)的100μL体系中添加活化后的上转换颗粒悬浮液(100μL，2mg/mL)，在37℃条件下震荡反应5h。
5)添加15U Nt.BbvCI、15U Nt.BsmAI和10×NEB缓冲液(15μL)到4)的混合物中使最终体积达到150μL，在37℃条件下震荡反应1h，然后用F97pro荧光分光光度计(激发波长980nm，狭缝宽度10nm，电压700V)在室温下检测荧光信号，发射波长为545nm。
为了验证本发明检测方法的特异性，选取PCB28，PCB52，PCB101，氯苯和甲基对硫磷进行检测。由图4可知，本发明检测方法的特异性良好，待测物为PCB72时的荧光强度显著高于其他类似物的荧光强度。其他类似物几乎没有与适配体结合，对荧光几乎没有影响，荧光值变化不大。
以上实施例均以PCB72为检测对象，本发明的方法对于检测PCB106，亦是相同结果。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
<120> 基于切刻内切酶和杂交链式反应双重扩增的上转换荧光检测多氯联苯试剂盒及检测方法
<130> BJI1800644PY
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttttcactc ggaccccatt ctccttccat ccctcatccg tccac 45
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacaagaggg atgggctgag gaga 24
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttctcctca gcccatccct cttgtcgaag gagacaagag ggatgggctg 50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacaagaggg atgggctgag gagacagccc atccctcttg tctccttctt 50

Claims (10)

1.一种基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测多氯联苯试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下组分：
(1)磁性微米颗粒；
(2)特异性识别多氯联苯PCB72/106的适配体；
(3)与适配体至少部分互补的互补DNA；
(4)上转换纳米颗粒；
(5)用于杂交链式反应的一对发卡DNA；
(6)切刻内切酶；
其中，所述互补DNA能够引发所述一对发卡DNA进行杂交链式反应。
2.根据权利要求1所述的基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测多氯联苯试剂盒，其中，
所述适配体具有SEQ ID NO：1所示序列，所述适配体5’端具有biotin修饰基团；
所述互补DNA具有SEQ ID NO：2所示序列；
所述一对发卡DNA包括第一发卡DNA和第二发卡DNA，所述第一发卡DNA的5’端修饰有NH2基团，3’端修饰有上转换纳米颗粒的猝灭基团，所述第一发卡DNA的5’端含有切刻内切酶识别位点；所述第二发卡DNA的5’端修饰有上转换纳米颗粒的猝灭基团，3’端修饰有NH2基团，所述第二发卡DNA的3’端含有切刻内切酶识别位点；
所述上转换纳米颗粒表面具有羧基修饰基团。
3.根据权利要求2所述的基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测多氯联苯试剂盒，其中，所述第一发卡DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二发卡DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
4.根据权利要求2所述的基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测多氯联苯试剂盒，其中，所述上转换纳米颗粒的猝灭基团为BHQ-1基团。
5.根据权利要求1所述的基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测多氯联苯试剂盒，其中，所述切刻内切酶为Nt.BbvCI和Nt.BsmAI。
6.根据权利要求1所述的基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测多氯联苯试剂盒，其中，所述上转换纳米颗粒为NaYF4:Yb,Er。
7.根据权利要求1所述的基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测多氯联苯试剂盒，其中，所述磁性微米颗粒的直径为250-350nm，所述上转换纳米颗粒的直径为25-35nm。
8.根据权利要求1所述的基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测多氯联苯试剂盒，其中，所述磁性微米颗粒与适配体共同以磁性微米颗粒-适配体偶联物的形式提供。
9.利用权利要求1-8中任意一项所述的基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测多氯联苯试剂盒的多氯联苯PCB72/106的检测方法，其特征在于，该方法包括：
(1)获取磁性微米颗粒-适配体偶联物；
(2)将磁性微米颗粒-适配体偶联物与互补DNA孵育，去除未杂交的互补DNA；
(3)将一系列浓度梯度的多氯联苯PCB72/106标准品溶液与步骤(2)所得产物混合孵育，磁场分离，收集上清；
(4)将一对发卡DNA与步骤(3)所得上清混合孵育；
(5)将活化的上转化纳米颗粒加入步骤(4)所得孵育溶液中，震荡反应；
(6)向步骤(5)所得反应液中加入切刻内切酶及其酶反应液，进行酶反应；
(7)测量步骤(6)所得反应产物溶液的荧光信号，建立多氯联苯PCB72/106标准品浓度与荧光信号的标准曲线；
(8)将含有多氯联苯PCB72/106的待测样品进行上述测试，将得到的荧光信号代入步骤(7)的标准曲线，计算待测样品中多氯联苯的浓度；
所述多氯联苯PCB72/106标准品为多氯联苯PCB72标准品或多氯联苯PCB106标准品。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其中，
所述一系列浓度梯度的多氯联苯PCB72/106标准品溶液的浓度范围为0.004-800ng/mL；
所述测量步骤(6)所得反应产物溶液的荧光信号的条件包括：激发波长980nm，狭缝宽度10nm，发射波长545nm。
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