CN106645107A - 一种基于CdSe/ZnS量子点纳米簇的电化学发光生物传感器及其制法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CdSe/ZnS量子点纳米簇的电化学发光生物传感器及其制法和在癌细胞检测中的应用。本发明的技术方案是在金电极表面修饰磁性纳米金棒后连接细胞适体，然后组装纳米金‑DNA引发链，最后固定CdSe/ZnS量子点纳米簇电化学发光信号探针，构建电化学发光生物传感器。将本发明的传感器清洗后分别与100μL含有不同浓度癌细胞的PBS溶液震荡温浴45～60分钟，然后进行电化学发光的测试，发光强度与待测样品(癌细胞)的浓度成线性关系。本发明将纳米金放大效应与杂交链式反应放大技术相结合，大量的CdSe/ZnS量子点组装到纳米线上，极大地放大了ECL信号，对癌细胞进行高灵敏、高选择性的检测，该方法在癌细胞的早期临床检测中具有巨大的应用潜力。
Description
技术领域：
本发明涉及一种新型的基于CdSe/ZnS量子点纳米簇的电化学发光生物传感器的研制新方法，以及利用该电化学发光生物传感器检测癌细胞的分析方法。
背景技术：
电致化学发光(ECL)具有操作简单，快速，灵敏度高，可控性好等诸多优良的性能特点，ECL生物传感器作为一种新型的分析检测装置正逐渐应用于各种生物分析检测。[Piper,D.J.E.；Barbante,G.J.；Brack,N.；Pigram,P.J.；Hogan,C.F.Langmuir 2011,27,474–480.]。最近，以量子点为发光材料的ECL生物传感器和生物分析技术由于其显著的ECL发光性能、良好的生物相容性以及本身的纳米放大效应等诸优点而广泛应用于分析科学领域。[Lei,J.；Ju,H.TrendsAnal.Chem.2011,30,1351–1359.]。基于量子点ECL的免疫分析测定[Lin,D.；Wu,J.；Yan,F.；Deng,S.；Ju,H.Anal.Chem.2011,83,5214–5221.]，适配体技术[Jie,G.F.；Yuan,J.X.；Zhang,J.Biosens.Bioelectron.2012,31,69–76.]，DNA检测[Divsar,F.；Ju,H.Chem.Commun.2011,47,9879–9881.]以及细胞传感技术等许多方法[Jie,G.F.；Wang,L.；Yuan,J.X.；Zhang,S.S.Anal.Chem.2011,83,3873–3880.]越来越多地应用于生物分子的高灵敏检测。
癌症是目前最难治疗的疾病之一，严重威胁着人们的身心健康。因此对癌细胞灵敏准确的识别和检测对于癌症的诊断和治疗相当重要。目前，检测肿瘤细胞的方法有很多，比如流式细胞术[Raddatz,M.-S.L.；Dolf,A.；Endl,E.；Knolle,P.；Famulok,M.；Mayer,G.Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,5190–5193.]，聚合酶链式反应[Zhang,X.；Yu,R.M.K.；Jones,P.D.；Lam,G.K.W.；Newsted,J.L.；Gracia,T.；Hecker,M.；Hilscherova,K.；Sanderson,J.T.；Wu,R.S.S.；Giesy,J.P.Environ.Sci.Technol.2005,392777–2785.]，微量测定技术[Xu,Y.；Phillips,J.A.；Yan,J.；Li,Q.；Fan,Z.H.；Tan,W.Anal.Chem.2009,81,7436–7442.]以及细胞浓缩技术[Phillips,J.A.；Xu,Y.；Xia,Z.；Fan,Z.H.；Tan,W.Anal.Chem.2009,81,1033–1039.]等。到目前为止，许多DNA信号放大的技术已经应用于生物分析，比如聚合酶链式反应[Wan,G.；EnLim,Q.；Too,H.P.RNA2010,16,1436–1445.]，滚环复制放大[Zhou,Y.；Huang,Q.；Gao,J.；Lu,J.；Shen,X.；Fan,C.Nucleic AcidsRes.2010,38,e156.]，链置换放大[Qiu,L.P.；Wu,Z.S.；Shen,G.L.；Yu,R.Q.Anal.Chem.2011,83,3050–3057.]以及基于核酸外切酶和内切酶的放大技术[Zhang,H.；Li,F.；Dever,B.；Li,X.F.；Le,X.C.Chem.Rev.2013,113,2812–2841.]，然而这些方法均需要稳定的热环境或者生物酶的参与。最近报道的杂交链式反应作为一种DNA自聚合的过程[Choi,H.M.T.；Chang,J.Y.；Trinh,L.A.；Padilla,J.E.；Fraser,S.E.；Pierce,N.A.Nat.Biotechnol.2010,28,1208–1212.]，在没有生物酶参与的情况下实现了对生物分子的高选择性和特异性检测。所有无酶放大技术中，杂交链式反应受到研究者的广泛青睐[Peng,Y.；Choi,H.M.T.；Calvert,C.R.；Pierce,N.A.Nature 2008,451,318-322.]，已经应用于核酸和蛋白质的分析检测[Zhu,G.,Zheng,J.,Song,E.,Donovan,M.,Zhang,K.,Liu,C.,Tan,W.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2013,1107998–8003.]。然而，还鲜有报道将杂交链式反应放大技术与ECL结合，并应用于癌细胞的高灵敏检测。
以CdSe/ZnS量子点为发光材料，以纳米金表面DNA杂交链式反应为放大手段，研制一种新型的CdSe/ZnS量子点纳米簇ECL生物信号探针。合成一种新型的具有良好导电性和磁性的纳米金棒，构建具有纳米放大效应的磁性修饰电极，用以负载大量的捕捉DNA分子。纳米金表面引发杂交链式反应，大量量子点通过发卡DNA修饰到电极上，产生放大的ECL信号。基于目标细胞对适体(c-DNA1)的特异性识别，将CdSe/ZnS量子点纳米簇ECL生物探针与DNA杂交链式反应放大技术相结合，实现对癌细胞高灵敏、高选择性的检测，该项研究对癌细胞的早期临床检测具有很好的应用前景。
发明内容：
本发明的目的之一是提供一种具有良好导电性和磁性的Au-Fe2O3磁性纳米金棒，构建具有纳米放大效应的磁性修饰电极，用以负载大量的捕捉DNA(c-DNA1)分子。具体包括以下步骤：
步骤1.纳米金种子生成：
0.25mL 0.01M的HAuCl4和9.75mL 0.1M的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)加入到15mL的塑料管中混合均匀，再将0.6mL 0.01M的NaBH4溶液迅速倒入到上混合液中，然后快速的反复倒置摇晃塑料管2min，室温下将混合物放置2h后备用。
步骤2.纳米金棒的生成：
2.0mL0.01M的HAuCl4和0.4mL 0.01M的AgNO3与40.0mL0.1M的CTAB加入到50.0mL的三口烧瓶中，混合均匀后用1.0M的HCl溶液调节pH大约在1-2，再加入0.32mL的抗坏血酸(维生素C)，然后取0.02mL上述合成的CTAB稳定的纳米金种子溶液加入到增长液中，将溶液摇匀后静置16h。
步骤3.Au-Fe2O3磁性金棒的合成：
首先将10.0mL纳米金溶液加到0.12mL0.05M的乙酰丙酮铁(以乙腈为溶液)中，然后用1.0M的NaOH调节溶液的pH至9左右(大约用0.3mL)，搅拌混匀，将溶液转入25.0mL的聚四氟乙烯反应釜中，在190℃的恒温烤箱中加热3h后拿出，自然冷却至室温，将获得的产物离心清洗两次后重新分散到去离子水中。
步骤4.磁性修饰电极的形成
磁性金电极依次使用1.0μm、0.3μm和0.05μm的α-Al2O3抛光粉抛光，用二次蒸馏水超声洗涤后自然晾干，将8μL的磁性纳米金棒溶液滴到磁性金电极的表面并自然晾干。然后将10μL的适体DNA(C1)滴加到电极的表面，温浴反应10～16h。
本发明的目的之二是提供一种新型的CdSe/ZnS量子点纳米簇ECL信号探针。具体包括以下步骤：
步骤1.NaHSe的制备：0.0950g的NaBH4加入10mL的离心管中，在离心管中加入6mL的去离子水，加入磁子搅拌溶解，通氮气排出多余的氧气，称取0.0947g的Se粉快速加入体系中，在常温下搅拌至无色透明(即Se粉完全溶解)
步骤2.CdSe量子点的制备：将0.5709g的CdCl2·2.5H2O加入100mL的三口烧瓶中，50.0mL的去离子水溶解，通氮气排出多余的氧气，移取400μL的巯基乙酸加到三口烧瓶中，用1M的NaOH调pH至10-11，溶液变得澄清透明，然后把制得的NaHSe溶液迅速加入到三口烧瓶中，加热沸腾30-40min得淡黄色澄清溶液。
步骤3.CdSe@ZnS量子点的制备：将制得的CdSe量子点溶液在水浴中保持45℃，分别在5mL的去离子水中溶解0.21gNaS·9H2O和0.25gZnSO4，然后将两溶液交替加入到CdSe量子点中，反应30min，冷却至室温，即得到CdSe@ZnS量子点。所得量子点于棕色瓶中避光保存备用。
步骤4.CdSe/ZnS量子点-发夹DNA信号探针的组装(溶液b)：按照使用说明，将带有氨基的发夹DNAH1和H2溶解，再稀释至浓度为1.0×10-5M，以备实验使用。取100μL的CdSe@ZnS-COOH的量子点加入到1.5mL的离心管中，加入10μL的0.1mol/L的EDC和10μL的0.025mol/L的NHS溶液，室温下活化反应30min。活化后离心管中加入100μL的H1和H2，室温下反应16h后10000rpm下离心重新分散至100μL溶液，记为溶液b，保存备用。
本发明的目的之三是提供一种基于CdSe/ZnS量子点纳米簇信号探针的电化学发光生物传感器，以及采用该生物传感器检测癌细胞的分析方法。它由下列步骤组成：
步骤1.纳米金-DNA引发链的组装(溶液a)：取1mL的金胶溶液，按一定的比例加入P1和S1，在37℃下震荡温育16h，反应完全后在10000rpm下离心30min后重新分散至100μL，记为溶液a，4℃下保存备用。
步骤2.将带有适体DNA的电极浸入到溶液a中，用铝箔纸封好后，在37℃的条件下震荡温育1～2h后用pH＝7.4的PBS缓冲溶液冲洗未反应的溶液，然后将此标记的电极浸入到溶液b中，同样用铝箔纸封好，在37℃的条件下震荡温育1～2h，取回电极用pH＝7.4的PBS缓冲溶液冲洗未反应的溶液，制成检测细胞的ECL的生物传感器。
步骤3.癌细胞的电化学发光(ECL)检测。将ECL传感器分别与100μL含有不同浓度(例如1000个细胞每毫升)细胞的PBS溶液震荡温浴45～60分钟。
将步骤3处理后的基于CdSe/ZnS量子点纳米簇的电化学发光传感器清洗，在含有0.05M K2S2O8和0.1M KCl的0.1M PBS(pH 7.4)缓冲液中，进行电化学发光的测试，发光强度与待测样品(癌细胞)的浓度成线性关系。
所述的电化学发光测试是以修饰好的金电极(基于CdSe/ZnS量子点纳米簇的电化学发光传感器)为工作电极、Pt电极为对电极、甘汞电极为参比电极的三电极体系，用MPI-A型电致化学发光仪，在0到-1.5V进行循环伏安扫描，光电倍增管高压设为500～700V。
本发明利用了磁性纳米金棒良好的磁性、导电性以及CdSe/ZnS量子点具有极强的发光强度等特点，制备了基于CdSe/ZnS量子点纳米簇ECL探针及杂交链式反应放大技术相结合的电致化学发光生物传感器，成功实现了对癌细胞的高灵敏、高选择性检测。该项研究对癌细胞的早期临床检测具有很好的应用前景。
本发明与现有技术相比，主要优点在于：本发明制备的磁性纳米金棒作为修饰电极具有很好的性能，增加了适体DNA在电极上的附着量以及附着的稳定性，提高了检测的灵敏度；本发明制备的新型的CdSe/ZnS量子点纳米簇ECL探针具有极强的电化学发光信号，研制了一种高灵敏的电化学发光生物传感器，实现了对癌细胞高选择性的ECL检测。本发明将纳米金放大效应与杂交链式反应放大技术相结合，大量的CdSe/ZnS量子点组装到纳米簇上，作为ECL探针，极大地放大了ECL信号，成功对癌细胞进行了高灵敏、高选择性的检测，检测限为23个细胞/100μL。
本发明的电化学发光传感器表现出了优良的准确性、高灵敏性，稳定性与重现性，分析检测迅速、方便，该方法在癌细胞的早期临床分析中具有巨大的应用潜力，可用于实际样品的检测。
附图说明：
图1(A)CdSe-ZnS量子点的透射电镜图，(B)CdSe-ZnS量子点的荧光光谱图。
图2基于CdSe/ZnS量子点纳米簇信号探针电化学发光检测癌细胞的原理图。
图3(A)纯纳米金，(B)基于纳米金表面杂交链式反应形成的量子点纳米簇的原子力显微镜图。
图4(A)磁性纳米金棒修饰到电极上，(B)纳米金探针组装到电极上的扫描电镜图。
图5该传感器对应不同浓度目标细胞的ECL响应信号，细胞浓度为：个/毫升：(a)0；(b)500；(c)1000；(d)2000；(e)4000；(f)6000；(g)8000；(h)15000。插图A为ECL的信号变化ΔI与细胞浓度的关系，细胞的浓度为500～20000个/毫升。
图6(A)该传感器检测细胞的标准校正曲线(500～10000个mL-1)；(B)该传感器检测细胞的选择性：a)为细胞媒介中纯的靶细胞b)靶细胞和干扰细胞加入到细胞媒介中的ECL选择性柱形图。
具体实施方式
实施例1.电化学发光生物传感器的制备及其对癌细胞的检测
首先将磁性金电极依次使用1.0μm、0.3μm和0.05μm的α-Al2O3抛光粉抛光，用二次蒸馏水超声洗涤后自然晾干，将8μL的磁性纳米金棒溶液滴到电极的表面并自然晾干。然后将10μL的适体DNA(C1)滴到电极表面，温浴反应10h。
将上述带有适体的电极洗净后浸入到纳米金-DNA引发链(溶液a)中，在37℃的条件下震荡温育2h，清洗后再将电极浸入到CdSe/ZnS量子点-发夹DNA信号探针(溶液b)中，在37℃的条件下震荡温育2h，制成检测细胞的ECL的生物传感器。
将ECL传感器分别与100μL含有不同浓度(例如：1000个细胞/毫升)细胞的PBS溶液在37℃下震荡温浴60分钟，适体与细胞反应，清洗后的电极可用于电化学发光检测
实施例2.电化学发光生物传感器的制备及其对癌细胞的检测
“将10μL的适体DNA(C1)滴到电极表面，温浴反应10h”改为”将10μL的适体DNA(C1)滴到电极表面，温浴反应12h”。制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感器。对癌细胞检测的结果同实施例1。
实施例3.电化学发光生物传感器的制备及其对癌细胞的检测
“将ECL传感器分别与100μL含有不同浓度细胞的PBS溶液在37℃下震荡温浴60分钟”改为“将ECL传感器分别与100μL含有不同浓度细胞的PBS溶液在37℃下震荡温浴50分钟”。制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感器。对癌细胞检测的结果同实施例1。
实施例4.电化学发光生物传感器的制备及其对癌细胞的检测
“将电极浸入到CdSe/ZnS量子点-发夹DNA信号探针(溶液b)中，在37℃的条件下震荡温育2h”改为“将电极浸入到CdSe/ZnS量子点-发夹DNA信号探针(溶液b)中，在37℃的条件下震荡温育1h”，制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感器。对癌细胞检测的结果同实施例1。
实施例5.电化学发光生物传感器的制备及其对癌细胞的检测
“将上述带有适体的电极洗净后浸入到纳米金-DNA引发链(溶液a)中，在37℃的条件下震荡温育2h”改为“将上述带有适体的电极洗净后浸入到纳米金-DNA引发链(溶液a)中，在37℃的条件下震荡温育1h”，制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感器。对癌细胞检测的结果同实施例1。
Claims (4)
1.一种基于CdSe/ZnS量子点纳米簇的电化学发光生物传感器，其特征是：在金电极表面修饰磁性纳米金棒后连接细胞适体，然后组装纳米金-DNA引发链，最后固定CdSe/ZnS量子点纳米簇电化学发光信号探针，构建电化学发光生物传感器。
2.一种制备权利要求1所述的CdSe/ZnS量子点纳米簇电化学发光探针的方法，其特征是它由下列步骤组成：
步骤1.NaHSe的制备：0.0950g的NaBH4加入10mL的离心管中，在离心管中加入6mL的去离子水，加入磁子搅拌溶解，通氮气排出多余的氧气，称取0.0947g的Se粉快速加入体系中，在常温下搅拌至无色透明(即Se粉完全溶解)
步骤2.CdSe量子点的制备：将0.5709g的CdCl2·2.5H2O加入100mL的三口烧瓶中，50.0mL的去离子水溶解，通氮气排出多余的氧气，移取400μL的巯基乙酸加到三口烧瓶中，用1M的NaOH调pH至10-11，溶液变得澄清透明，然后把制得的NaHSe溶液迅速加入到三口烧瓶中，加热沸腾30-40min得淡黄色澄清溶液。
步骤3.CdSe@ZnS量子点的制备：将制得的CdSe量子点溶液在水浴中保持45℃，分别在5mL的去离子水中溶解0.21g NaS·9H2O和0.25gZnSO4，然后将两溶液交替加入到CdSe量子点中，反应30min，冷却至室温，即得到CdSe@ZnS量子点。所得量子点于棕色瓶中避光保存备用。
步骤4.CdSe/ZnS量子点-发夹DNA信号探针的组装(溶液b)：按照使用说明，将带有氨基的发夹DNA H1和H2溶解，再稀释至浓度为1.0×10-5M，以备实验使用。取100μL的CdSe@ZnS-COOH的量子点加入到1.5mL的离心管中，加入10μL的0.1mol/L的EDC和10μL的0.025mol/L的NHS溶液，室温下活化反应30min。活化后离心管中加入100μL的H1和H2，室温下反应16h后10000rpm下离心重新分散至100μL溶液，记为溶液b，保存备用。
3.一种采用权利要求1所述的基于CdSe/ZnS量子点纳米簇信号探针的电化学发光生物传感器，以及采用该生物传感器检测癌细胞的分析方法。其特征是它由下列步骤组成：
步骤1.纳米金-DNA引发链的组装(溶液a)：取1mL的金胶溶液，按一定的比例加入P1和S1，在37℃下震荡温育16h，反应完全后在10000rpm下离心30min后重新分散至100μL，记为溶液a，4℃下保存备用。
步骤2.将带有适体DNA的电极浸入到溶液a中，用铝箔纸封好后，在37℃的条件下震荡温育1～2h后用pH＝7.4的PBS缓冲溶液冲洗未反应的溶液，然后将此标记的电极浸入到溶液b中，同样用铝箔纸封好，在37℃的条件下震荡温育1～2h，取回电极用pH＝7.4的PBS缓冲溶液冲洗未反应的溶液，制成检测细胞的ECL的生物传感器。
步骤3.癌细胞的电化学发光(ECL)检测。将ECL传感器分别与100μL含有不同浓度(例如1000个细胞每毫升)细胞的PBS溶液震荡温浴45～60分钟。
将步骤3处理后的基于CdSe/ZnS量子点纳米簇的电化学发光传感器清洗，在含有0.05MK2S2O8和0.1M KCl的0.1M PBS(pH 7.4)缓冲液中，进行电化学发光的测试，发光强度与待测样品(癌细胞)的浓度成线性关系。
4.根据权利要求3所述的癌细胞检测方法，其特征是：所述的电化学发光测试是以修饰好的金电极(基于CdSe/ZnS量子点纳米簇的电化学发光传感器)为工作电极、Pt电极为对电极、甘汞电极为参比电极的三电极体系，用MPI-A型电致化学发光仪，在0到-1.5V进行循环伏安扫描，光电倍增管高压设为500～700V。
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