CN113109271A - 一种基于聚乳酸纳米线的生物传感器的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物传感检测技术领域，特别涉及一种基于聚乳酸纳米线的生物传感器的制备及其应用，包括以下步骤：制备光纤锥；配置聚乳酸溶液；将所述光纤锥浸入所述聚乳酸溶液中；再将所述光纤锥从所述聚乳酸溶液中拉出。本发明制备的聚乳酸纳米线传感器，聚乳酸纳米线表面形貌光滑，且尺寸可控。传感器的构建方式简单，容易操作。本申请同时首次探究了单根聚乳酸纳米线的光学和传感特性，拓宽了聚乳酸在生物医学领域的应用。本发明获得的聚乳酸纳米线传感器具有低损耗、高灵敏度，而且可降解，生物兼容性好安全性能高等特点。

Description

一种基于聚乳酸纳米线的生物传感器的制备及其应用

技术领域

本发明涉及生物传感检测技术领域，特别涉及一种基于聚乳酸纳米线的生物传感器的制备及其应用。

背景技术

在生物医学领域，光与生物的相互作用被用来实现多种医学目的，如光疗、生物检测、生物传感和成像等(M.Li,et al,Nat.Commun.2020,11,1-16；I.Barth,et al,LightSci.Appl.2020,9,1-9；H.Li,et al,Adv.Mater.2020,2000678)。然而，由于人体组织对光的吸收和散射，光在生物组织中的穿透深度有限(<3mm)(S.L. Jacques,Phys.Med.Biol.2013,58,37-61)。可植入型光波导器件，因其能够克服光穿透深度限制，实现深度组织内光信号的传输与感应，被广泛应用在光遗传学、荧光检测和传感等领域(R.Nazempour,et al,Materials 2018,11,1283；C.Lu,et al, Sci.Adv.2017,3,1600955；S.Vasudevan,Adv.Sci.2019,6,1902011)。目前常用的生物光波导多为硅基材料(如二氧化硅，氮化硅等)(S.Vasudevan,et al,Adv.Sci.2019, 6,1902011；J.W.Wang,et al,Adv.Mater.Technol.2020,5,1901138)。它们成本低廉，易加工，拥有极低的光学损耗，因而能够实现对光信号高效的传输与感应。但同时，它的生物兼容性不佳，会对生物组织造成损伤。考虑到对宿主的影响，生物光波导不仅需要具有优异的光学性能，还要具有良好的生物兼容性。另外，可降解性也是衡量此类光波导性能的重要指标之一；可生物降解材料制备的器件在使用后会物理消失，消除了进一步回收的风险(C.M.Li,et al,Nat.Rev.Mater.2019,5, 61–81)。因而，生物兼容且可降解的光波导引起了广泛的研究兴趣。近年来，基于蚕丝、蛛丝等天然材料(S.T.Parker,et al,Adv.Mater.2009,21,2411–2415；N.C. Tansil,Adv.Mater.2011,23,1463-1466；X.Qiao,et al,ACSAppl.Mater.Interfaces 2017,9,14665-14676)、水凝胶(A.K.Yetisen,et al,Adv.Mater.2017,29,1606380；M. Elsherif,et al,Biosens.Bioelectron.2019,137,25-32)、人造橡胶(M.Kolle,et al,Adv. Mater.2013,25,2239-2245；J.Guo,et al,Adv.Funct.Mater.2019,1902898)、合成高分子(S.Nizamoglu,et al,Nat.Commun.2016,7,1-7；D.Shan,et al,Biomaterials 2017,143,142-148)等的导光器件相继出现，它们具有良好的生物兼容性和可降解性，可以更好地满足生物医学需求。然而，目前大多数的生物兼容且可降解的光波导尺寸在微米级别(几十到几百微米)。与微米波导相比，纳米光波导由于其纳米级的径向尺寸与极大的表体比，对生物组织的损害更小，光限制能力更强，对环境变化的敏感度也更高，更适合用于传感使用。可见，研制一种性能优良、生物兼容且可降解的纳米光波导对生物光子学、生物医学等的发展有着重要的意义。

聚乳酸，是一种源于可再生资源(玉米，马铃薯等)的合成聚酯(M.S.Singhvi, etal,J.Appl.Microbiol.2019,127,1612-1626)。由于其良好的生物兼容性和安全的降解产物，它一直是生物医学应用中最重要的聚合物之一(P.Saini,et al,Adv.DrugDeliver.Rev.2016,107,47–59；D.D.Silva,et al,Chem.Eng.J.2018,340,9–14；S. Zhang,et al,Nano Lett.2018,18,2243-2253)。不仅如此，聚乳酸的成本低廉、可塑性强、光传播损耗小(～0.1dB/mm)，这些特性使聚乳酸成为一种理想的生物光波导材料(A.Gierej,etal,J.Lightwave Technol.2019,37,1916-1923；R.Fu,et al, Adv.Opt.Mater.2018,6,1700941；J.Feng,et al,ACS Appl.Mater.Interfaces 2020,12, 18,20287–20294)。目前基于聚乳酸纳米材料的光波导尺寸较大且尚未有报道基于聚乳酸纳米材料的生物传感器。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种基于聚乳酸纳米线的生物传感器的制备及其应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种基于聚乳酸纳米线的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：制备光纤锥；配置聚乳酸溶液；将所述光纤锥浸入所述聚乳酸溶液中；再将所述光纤锥从所述聚乳酸溶液中拉出。

上述制备方法将光纤锥在聚乳酸溶液中蘸取，然后以一定速度将光线锥抽取，聚乳酸附着在光线锥上形成纳米线。光纤锥和聚乳酸纳米线形成光通路。聚乳酸纳米线是弱酸性的，表面带有的羧基可以和含有氨基的生物物质结合从而改变纳米线表面的粗糙度，从而改变光在纳米线中的传递衰减程度。通过光在纳米线上的衰减情况实现对不同待测物质的定量。

优选地，所述制备光纤锥的方法包括：将光纤芯水平悬挂，对光纤芯进行加热，并以0.1～0.5m/s的速度拉制光纤芯。

优选地，所述聚乳酸纳的溶液的浓度为0.13～0.26g/mL。

优选地，将所述光纤锥从所述聚乳酸溶液中拉出的速度为1～3m/s。

采用光线锥一步拉制法制备的纳米线，直径可控，而且长度可以达到厘米量级。

优选地，所述聚乳酸溶液中加入量子点。更优选地，所述量子点为羧基修饰的CdSe/ZnS量子点。聚乳酸纳米线具有聚合物的特性，可以很容易地实现功能化，通过不同功能的量子点对聚乳酸纳米线进行修饰可以得到不同作用的纳米线。本申请中以对pH敏感的CdSe/ZnS量子点为例说明了对纳米线修饰的可行性。采用其他量子点或纳米材料对聚乳酸纳米线的修饰也属于本发明的构思。

所述基于聚乳酸纳米线的生物传感器的制备方法得到的聚乳酸纳米线的生物传感器。

所述基于聚乳酸纳米线的生物传感器在生物检测中的应用，包括以下步骤：

S1.将所述基于聚乳酸纳米线的生物传感器悬置于微米槽上，聚乳酸纳米线的两端用氟化镁基底支撑，在聚乳酸纳米线的两端连接光纤锥；

S2.将待测生物样品溶液盛入微米槽中，以特定波长的光从一端光纤锥入射，测定另一端光线锥中光的出射强度，计算光的衰减强度；

S3.以标准浓度和对应的衰减强度绘制标准曲线，根据标准曲线对待测生物样品的定量。

将聚乳酸纳米线悬置在微米槽中，两端用氟化镁作为基底来支撑。用双光纤锥通过光耦合的方式实现入射光的输入与出射光的采集。一端光纤锥连接光源，通过耦合的方式，将输入光耦合进聚乳酸纳米线中。由于范德华力与静电力的作用，光纤锥能够保持与纳米线稳定的耦合。光波沿纳米线传播，再由另一端光纤锥出射，并通过光谱仪对出射光进行采集。通过测量光传播过程中损耗从而实现对吸附在纳米线上的物质进行定量测试。

所述基于聚乳酸纳米线的生物传感器的制备方法得到的聚乳酸纳米线的生物传感器。

所述基于聚乳酸纳米线的生物传感器在测定溶液pH中的应用。

采用羧基修饰的CdSe/ZnS量子点对聚乳酸纳米线进行修饰，由于CdSe/ZnS 量子点对溶液pH变化很敏感，从而实现对溶液中pH的测定。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

本发明制备的聚乳酸纳米线传感器，聚乳酸纳米线表面形貌光滑，且尺寸可控。传感器的构建方式简单，容易操作。本申请同时首次探究了单根聚乳酸纳米线的传感特性，拓宽了聚乳酸在生物医学领域的应用。本发明获得的聚乳酸纳米线传感器具有低损耗、高灵敏度等特点，而且可降解，生物兼容性好安全性能高。

附图说明

图1本发明实施例1获得的不同直径的聚乳酸纳米线的扫描电镜图；

图2本发明实施例2PLA纳米线线传感器对cyt c的超灵敏传感实验结果：a 实验原理示意图；b cyt c的吸收光谱。插图是cyt c水溶液的光学图像，比例尺为1cm；c PLA纳米线生物传感器的光学显微镜图像；d捕获cyt c前PLA纳米线表面的三维原子力显微镜图像；e捕获cyt c后PLA纳米线表面的三维原子力显微镜图像；f cyt c浓度从10^-18变化到10^-5M时的输出光谱；g依赖于cyt c浓度的输出光强度，10^-16至10^-7M浓度的线性拟合曲线；

图3本发明实施例3对对生物细胞凋亡的实时监测实验结果图；a实验原理示意图；b刚刚添加H₂O₂时生物传感器的光学显微镜图像(T＝0)，比例尺为15μm； c T＝40min时生物传感器的光学显微镜图像；d凋亡细胞(含H₂O₂)和健康细胞 (不含H₂O₂)的时间依赖的输出光强度，插图是台盼蓝染色的酵母细胞的光学显微镜图像，比例尺为10μm；凋亡(e)和健康(f)酵母细胞样品在不同时间的拉曼光谱；

图4本发明实施例4PLA纳米线传感器对pH传感实验结果；a直径为550nm 的量子点掺杂PLA纳米线的电镜图像。插图I是该纳米线的透射电子显微镜图像。插图Ⅱ是该纳米线在473nm激发下的光学显微镜图像；b不同PH值下该传感器的光致发光光谱，插图是其PH依赖的发光强度；

图5本发明实验例中聚乳酸纳米线光学特性测量示意图；

图6本发明实验例中650nm光在聚乳酸纳米线中的传播距离与光强度关系。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

一种基于聚乳酸纳米线的生物传感器的制备方法：

制备聚乳酸溶液：首先将市购的聚乳酸固体分割成小块，以便于后续溶解；将聚乳酸用去离子水和酒精(浓度75％～95％)分别在常温下超声清洗15mins，后置于高压氮气流下吹干。称取干净的聚乳酸固体4g放入锥形瓶中，之后加入30mL 的有机溶剂，在瓶中放入搅拌子，将锥形瓶放在磁力搅拌机中常温条件下以 1000rpm的转速搅拌24h，得到浓度为0.13g/mL的聚乳酸的溶液。

制备光线锥：将单模石英光纤(接口：DC/PC，内径：9μm，包层：125μm) 的一端用光纤刀剥去保护层和包覆层，露出光纤芯。将光纤芯悬置在酒精灯外焰加热1～20s，用镊子辅助，以0.1～0.5m/s的速度拉制出合适锥角的光纤锥。

纳米线的拉制：用制备好的光纤锥伸入聚乳酸溶液，以1m/s～3m/s的速度拉制，制备出单根聚乳酸纳米线。通过调节聚乳酸溶液的浓度和拉制时的速度，可以改变聚乳酸纳米线的直径。如图1所示为拉制得到的不同直径的纳米线的扫描电镜图片。可以看到，由一步拉制法拉制得到的聚乳酸纳米线表面光滑，没有明显瑕疵，这将有利于光的低损耗传输。

实验例2

生物传感器在细胞色素C(cytochrome c，cyt c)检测中的应用，包括以下步骤：

S1.将直径为400nm、传感长度为100μm聚乳酸纳米线生物传感器置于微米槽中，在聚乳酸纳米线的另一端连接光纤锥，聚乳酸纳米线的两端用氟化镁基底支撑；

S2.将cyt c样品溶液盛入微米槽中，以532nm的光从一端光纤锥入射，测定另一端光线锥中光的出射强度，计算光的衰减强度；

S3.以10^-18到10^-5M标准浓度和对应的衰减强度绘制标准曲线，根据标准曲线对待测生物样品的定量。

如图2a所示，当光在纳米线中传播时，它的一部分暴露在环境中并以倏逝波的形式传播。这些倏逝波对环境变化很敏感。在凋亡过程中，细胞膜的通透性改变，导致cyt c从细胞内部逐渐释放到环境中。cyt c在PLA(聚乳酸)纳米线表面的捕获会导致纳米线的表面粗糙度、厚度和折射率的变化，从而使接收到的光强度的变化。因此，通过监测光强度变化，可以实现对cyt c的传感。

为了定量测定聚乳酸纳米线的检测能力，制备了不同浓度的cyt c水溶液。图 2b显示了cyt c在水溶液中的吸收光谱。其中，插图是浓度为1mg/mL的cyt c水溶液的光学图像。可以看到，cyt c在408nm和526nm处有两个吸收峰。考虑到传播损耗、cyt c吸光度以及对生物样品的适用性，我们选择532nm波长的激光作为输入光源。

如图2c所示，入射光通过锥形光纤1(TF1)耦合到PLA纳米线中，出射光通过锥形光纤2(TF2)由光谱仪检测。PLA纳米线是弱酸性的，表面带有羧基，因此溶液中的cyt c通过cyt c的氨基与纳米线的羧基之间的结合而附着在纳米线的表面。图2d，e分别是捕获cyt c前后纳米线表面的三维原子力显微镜图像。可以看出，纯PLA纳米线的表面非常光滑，捕获cyt c后，纳米线的厚度和粗糙度都有明显的变化。图2f，g分别显示了cyt c浓度从10^-18到10^-5M变化时的出射光谱和强度。可以看到，出射光强随cyt c浓度的增加而减小，线性范围为10^-16～10^-7M，线性度为97.1％。该传感器的检测限可计算为1.38×10^-17M。该结果远低于之前生物传感器获得的结果(10^-6～10^-12M)。这表明，本方法具有效率高、操作简便、成本低等优点。

实施例3

基于PLA纳米线对cyt c的高灵敏度传感特性，PLA纳米线进一步用于生物细胞凋亡的实时监测，如图3所示。所用细胞为富含cyt c的酵母细胞，细胞分散在水溶液中，细胞浓度为1.96×10³个/mm²。浓度为0.8wt％的H₂O₂为细胞凋亡的诱导剂。用上述直径为400nm、传感长度为100μm的PLA纳米线为传感器件。图 3b为T＝0时的PLA生物传感器在细胞溶液中的光学显微镜图像，即此时刚刚加入H₂O₂。红色箭头的方向表示光的传播方向。40分钟后(图3c)，光纤锥和纳米线之间的相对位置没有变化，这证明了该传感结构具有良好的稳定性。随着时间的增加，输出光强度逐渐降低，如图3d，这表明了溶液中cyt c浓度的增加，即细胞凋亡程度的加深。34分钟后，光照强度下降了36％，然后保持稳定，这意味着此时溶液中几乎所有的细胞都已经凋亡。为了对比，我们以相同的方式制备和监测了具有相同细胞浓度的健康细胞溶液(即不添加H₂O₂)，如图3d，随着时间的增加，光强度略有波动，这说明酵母细胞在40分钟内能保持良好的活性。为了进一步验证监测结果，我们进一步用台盼蓝对添加/不添加H₂O₂的酵母细胞样品进行了染色试验。在T＝0时，两组细胞都不能染色(图3d插图I)，这意味着细胞在开始时具有良好的活性。40分钟后，不含H₂O₂的酵母细胞仍未染色(图3d插图Ⅱ)，含H₂O₂的酵母细胞被染成蓝色(图3d插图Ⅲ)，被染色代表着酵母细胞死亡。实验结果与PLA纳米线生物传感器的监测结果一致。进一步的，我们对两种样品的拉曼光谱进行测量来反映细胞的凋亡过程，如图3e(添加H₂O₂)和3f(无H₂O₂) 所示。在图3e中，有六个拉曼峰，中心分别位于876、1081、1259、1301、1440 和1654cm^-1，其中876cm^-1峰是H₂O₂的特征峰。对于含H₂O₂的酵母细胞，随着时间的延长，酵母细胞的拉曼峰强度降低，这代表细胞凋亡程度的增加。以上结果表明，H₂O₂可引起酵母细胞的凋亡，用单根PLA纳米线即可实现对该过程无标记、实时的监测。

实施例4

基于聚乳酸纳米线的生物传感器在测定溶液pH中的应用，包括以下步骤：

S1.制备量子点聚乳酸纳米线传感器

PLA纳米线由于具有聚合物的特性，可以很容易地实现功能化。在本实施例中，我们通过PH敏感的量子点掺杂，制备了量子点掺杂的PLA纳米线，实现了高分辨率PH的传感。我们将羧基修饰的CdSe/ZnS量子点分散在丙酮溶液中，然后将量子点与聚乳酸按照质量比为1:3000进行混合。然后通过光线锥采用一步拉制法制备了量子点掺杂的PLA纳米线。

S2.聚乳酸纳米线生物传感器置于微米槽中，在聚乳酸纳米线的另一端连接光纤锥，聚乳酸纳米线的两端用氟化镁基底支撑；

S2.将pH值在3～10之间的水溶液样品溶液盛入微米槽中，以437nm的光从一端光纤锥入射，测定另一端光线锥中光的出射强度，计算光的衰减强度；

S3.以pH值在3～10标准浓度和对应的衰减强度绘制标准曲线，根据标准曲线对待测溶液pH的定量。

图4a为直径550nm的量子点掺杂PLA纳米线的扫描电镜图像，插图I是其透射电子显微镜图像。可以看到，量子点成功的掺杂到了纳米线中，并在其中呈现均匀分布。插图Ⅱ是该纳米线在473nm光激发下的光学显微镜图像。沿纳米线发射的均匀红光再次表明量子点成功且均匀地掺杂在纳米线中。

以硼酸和氢氧化钠为PH缓冲液，我们制备了PH值在3～10之间的水溶液。通过锥形光纤将473nm的入射光耦合到纳米线中激发量子点发射。经过100μm的传输长度后，用光谱仪通过另一根锥形光纤测量输出光谱。图4b为在不同PH溶液中的输出光谱，即量子点的光致发光光谱。插图是PH依赖的光致发光强度。可以看到，在473nm光的激发下，量子点发射出波峰在625nm的发射光。随着pH 值的增加，量子点表面羧基的离子化程度增加，因而在量子点表面形成带负电荷的壳层，这会增加载流子的限制，从而获得更高的量子产率和更强的荧光强度，即使得输出荧光强度单调增加。基于PH依赖的输出光强，纳米线PH传感器的分辨率可计算为1.46×10^-3～3.24×10^-3RIU。与其它量子点PH传感器相比，该量子点掺杂纳米线更易于回收和再次利用。此外，该传感方式可以有效地解决由于量子点的扩散和泄漏导致的样品污染问题。

实验例

本实验例具体展示了对聚乳酸纳米线的光学损耗测量

将实施例1中单根聚乳酸纳米线(直径560nm)悬置在微米槽上，两端用氟化镁基底来支撑。用双光纤锥通过光耦合的方式来实现入射光的输入与出射光的采集，如图5a所示。光锥1左端连接光源，通过耦合的方式，将输入光耦合进聚乳酸纳米线中。由于范德华力与静电力的作用，光锥能够保持与纳米线稳定的耦合。光波沿纳米线传播一段距离后，由光谱仪通过光锥2进行采集。以测量光传播损耗为例，通过移动光锥2的位置，我们可以测量不同传播距离下的光输出强度，如图5b，c所示。以波长650nm的红光为例，选取距离光锥1尖端位置约45μm 处为A点(此处输出光受到光锥1散射光的影响可忽略不计)，也就是我们的测量起点，记录下此处输出光强度。接着，保持光锥与纳米线间的耦合角度不变，移动光锥2至B点，记录下此处输出光强度。通过改变B点的位置，可以得到不同传输距离下的光输出强度，通过对所得数据进行指数拟合，则可以得到聚乳酸纳米线对红光的传输损耗。同理，我们可以测量水环境中聚乳酸纳米线的光传播损耗，如图6所示。对于650nm的光来说，聚乳酸纳米线在空气和水中的传播损耗分别为0.14和0.64dB/mm。本实施例证明，在空气和水环境中，聚乳酸纳米线均可以进行有效的光传播，且该传播损耗比一些蛋白质基的纳米线的传播损耗小1 到2个数量级。

以上所述仅为本发明专利的较佳实施例而已，并不用以限制本发明专利，凡在本发明专利的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于聚乳酸纳米线的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备光纤锥；配置聚乳酸溶液；将所述光纤锥浸入所述聚乳酸溶液中；再将所述光纤锥从所述聚乳酸溶液中拉出。

2.根据权利要求1所述基于聚乳酸纳米线的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备光线锥的方法包括：将光纤芯水平悬挂，对光纤芯进行加热，并以0.1～0.5m/s的速度拉制出光纤锥。

3.根据权利要求1所述基于聚乳酸纳米线的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述聚乳酸纳的溶液的浓度为0.13～0.26g/mL。

4.根据权利要求1所述基于聚乳酸纳米线的生物传感器的制备方法，其特征在于，将所述光纤锥从所述聚乳酸溶液中拉出的速度为1～3m/s。

5.根据权利要求1所述基于聚乳酸纳米线的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述聚乳酸溶液中加入量子点。

6.根据权利要求5所述基于聚乳酸纳米线的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述量子点为羧基修饰的CdSe/ZnS量子点。

7.根据权利要求1～4任一项所述基于聚乳酸纳米线的生物传感器的制备方法得到的聚乳酸纳米线的生物传感器。

8.根据权利要求7所述基于聚乳酸纳米线的生物传感器在生物检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将所述基于聚乳酸纳米线的生物传感器悬置于微米槽上，聚乳酸纳米线的两端用氟化镁基底支撑，在聚乳酸纳米线的两端连接光纤锥；

S2.将待测生物样品溶液盛入微米槽中，以特定波长的光从一端光纤锥入射，测定另一端光线锥中光的出射强度，计算光的衰减强度；

S3.以标准浓度和对应的衰减强度绘制标准曲线，根据标准曲线对待测生物样品的定量。

9.权利要求5或6所述基于聚乳酸纳米线的生物传感器的制备方法得到的聚乳酸纳米线的生物传感器。

10.权利要求9所述所述基于聚乳酸纳米线的生物传感器在测定溶液pH中的应用。

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