CN110672851B - 卡那霉素的识别/传感一体化探针及制备方法与检测方法 - Google Patents

卡那霉素的识别/传感一体化探针及制备方法与检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110672851B
CN110672851B CN201910764620.5A CN201910764620A CN110672851B CN 110672851 B CN110672851 B CN 110672851B CN 201910764620 A CN201910764620 A CN 201910764620A CN 110672851 B CN110672851 B CN 110672851B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chain
kanamycin
signal amplification
amplification reaction
aptamer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910764620.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110672851A (zh
Inventor
叶泰
徐斐
张志伟
袁敏
曹慧
于劲松
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Shanghai for Science and Technology
Original Assignee
University of Shanghai for Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Shanghai for Science and Technology filed Critical University of Shanghai for Science and Technology
Priority to CN201910764620.5A priority Critical patent/CN110672851B/zh
Publication of CN110672851A publication Critical patent/CN110672851A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110672851B publication Critical patent/CN110672851B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9446—Antibacterials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及卡那霉素的识别/传感一体化探针及制备方法与检测方法，属于生物传感技术领域。卡那霉素的识别/传感一体化探针包括金纳米颗粒、适配体链、荧光标记底物链、信号放大反应Trigger链；当待测样品中存在卡那霉素时，适配体链与卡那霉素特异性结合，“激活”被封闭的Trigger链，Trigger链与修饰在纳米金上的底物链杂交，暴露酶切位点；在切刻内切酶的作用下，底物链被切割，标记荧光基团的核酸片段远离纳米金表面，被猝灭的荧光恢复；同时，游离的Trigger链在纳米金表面与其他底物链进行往复的“杂交‑切割”，实现信号放大。最后，通过检测溶液的荧光强度对卡那霉素进行定量。与现有技术相比，本发明增加了信号放大过程中局部底物浓度，缩短了检测时间。

Description

卡那霉素的识别/传感一体化探针及制备方法与检测方法
技术领域
本发明属于生物传感技术领域，尤其是涉及一种卡那霉素的识别/传感一体化探针及制备方法与检测方法。
背景技术
卡那霉素作为一种重要的氨基糖苷类抗生素，被广泛用于革兰氏阳性和阴性细菌感染的治疗。但是抗生素的滥用会导致动物源性食品中卡那霉素的残留，通过食品摄入并在体内聚积，引起人体不同程度的损害。因此，实现卡那霉素的快速、灵敏检测尤为重要。
目前，基于核酸适配体的抗生素快速检测方法受到广泛关注，这些方法中目标与探针1:1结合比例的局限，使得检测灵敏度受限于适配体和抗生素之间的结合能力，无法满足食品中痕量抗生素残留的检测需求。
将核酸适配体识别与核酸恒温扩增技术耦合，通过将抗生素浓度定量地转变为特异性的核酸进行信号放大，能够显著提高抗生素检测灵敏度。但是，在均相核酸恒温扩增反应中，信号的放大过程依赖于底物链浓度，随着反应的进行，底物链浓度逐渐降低，完成信号放大过程往往需要2h或者更长时间，从而导致整个检测过程极为耗时。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有基于核酸适配体信号放大策略检测卡那霉素耗时的缺点，而提供一种卡那霉素的识别/传感一体化探针及制备方法与检测方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明首先提供一种卡那霉素的识别/传感一体化探针，所述卡那霉素的识别/传感一体化探针包括金纳米颗粒、适配体链、荧光标记底物链、信号放大反应Trigger链；所述适配体链、荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链修饰在金纳米颗粒表面，得到卡那霉素的识别/传感一体化探针，所述卡那霉素的识别/传感一体化探针保存在保存溶液中。
进一步地，所述适配体链、荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链序列分别为：
适配体链：5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’；
荧光标记底物链：5’-TTTTTTTTTTGGATCATATAGTAGT-3’；
信号放大反应Trigger链：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGGCTTAGCTACTATATGATCCGAACCCCCA-3’；
所述荧光标记底物链的5’端修饰-SH，所述荧光标记底物链的3’端修饰荧光基团；
所述信号放大反应Trigger链的5’端修饰-SH。
在本发明的一个实施方式中，所述荧光基团选自以下物质中的一种或几种：Cy系列荧光染料、FAM荧光染料、Rox荧光染料、Alexa系列染料、d6过渡金属配合物或荧光纳米粒子。
Cy系列荧光染料即为2,3,3-三甲基-3H-吲哚类碳菁染料，包括Cy3(三甲川菁染料)和Cy5(五甲川菁染料)；
FAM荧光染料即为5-羧基荧光素；
Rox荧光染料即为6-羧基-X-罗丹明；
Alexa系列染料包括Alexa Fluor350、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 647；
d6过渡金属配合物包括铱配合物和铼配合物；
荧光纳米粒子包括CdSe/ZnS量子点、碳量子点。
本发明选用但是并不限于上述的荧光染料，通用的用于标记DNA或RNA的荧光染料均可适用。
在本发明的一个实施方式中，所述金纳米颗粒、适配体链、信号放大反应Trigger链、荧光标记底物链之间加入的比例关系为：
适配体链与信号放大反应Trigger链的摩尔比为1～4：1，
荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链的摩尔比为5～40：1，
三(2-羧乙基)膦和乙酸盐与核酸链的摩尔比为10-100；
核酸链与金纳米颗粒的摩尔比300～1000：1，所述核酸链指适配体链、信号放大反应Trigger链及荧光标记底物链。
在本发明的一个实施方式中，所述保存溶液中，金纳米颗粒的浓度为0.1-5nM，优选为1nM。
本发明还提供所述卡那霉素的识别/传感一体化探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备纳米金溶液；
(2)将适配体链、荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链修饰到金纳米颗粒表面，得到卡那霉素的识别/传感一体化探针。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述纳米金溶液的浓度为0.1-5nM，优选为1nM。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)制备纳米金溶液可以采用本领域常规技术手段获得。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2)具体包括以下步骤：
S1、将适配体链和信号放大反应Trigger链按照按摩尔比为1～4：1静置杂交；
S2、S1所得物加入荧光标记底物链，混合均匀，再加入三(2-羧乙基)膦(TCEP)和乙酸盐缓冲液，静置活化，接着与纳米金溶液混合，震荡孵育；
S3、S2所得物加入Tris-Hcl缓冲液，静置孵育，然后，加入NaCl，静置孵育；
S4、用PBS缓冲液离心洗涤，去除未标记上的DNA链，保存在保存溶液中，备用。
在本发明的一个实施方式中，步骤S1中，静置杂交的优选温度为37℃，静置杂交的优选时间为1小时。
在本发明的一个实施方式中，步骤S2中，适配体链与信号放大反应Trigger链的摩尔比为1～4：1，
荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链的摩尔比为5～40：1，
三(2-羧乙基)膦和乙酸盐与核酸链的摩尔比为10-100；
核酸链与金纳米颗粒的摩尔比300～1000：1，所述核酸链指适配体链、信号放大反应Trigger链及荧光标记底物链。
在本发明的一个实施方式中，步骤S2中，所述荧光标记底物链的5’端修饰-SH，3’端修饰荧光基团。
在本发明的一个实施方式中，步骤S2中，三(2-羧乙基)膦的浓度为1-20mM，优选为10mM，乙酸盐缓冲液的浓度为100-1000mM，优选为500mM，乙酸盐缓冲液的pH为4-6，优选为5.2。
在本发明的一个实施方式中，步骤S2中，静置活化的优选温度为20-30℃，优选为25℃，静置活化的优选时间为1小时。
在本发明的一个实施方式中，步骤S2中，震荡孵育的优选温度为20-30℃，优选为25℃，震荡孵育的优选时间为16小时。
在本发明的一个实施方式中，步骤S3中，Tris-Hcl缓冲液加入后，Tris-Hcl缓冲液终浓度为5mmol/L。
在本发明的一个实施方式中，步骤S3中，Tris-Hcl缓冲液优选500mM、pH＝8.2的Tris-Hcl缓冲液。
在本发明的一个实施方式中，步骤S3中，加入Tris-Hcl缓冲液后静置孵育的优选温度为20-30℃，优选为25℃，加入Tris-Hcl缓冲液后静置孵育的优选时间为30-90min，优选为1小时。
在本发明的一个实施方式中，步骤S3中，加入NaCl的方式优选为：分4次加入NaCl，每次加入体积比为1:1:2:2。
在本发明的一个实施方式中，步骤S3中，加入NaCl的浓度优选为1-3M。
在本发明的一个实施方式中，步骤S3中，加入NaCl后静置孵育的优选温度为20-30℃，优选为25℃，加入NaCl后静置孵育的优选时间为24小时。
在本发明的一个实施方式中，步骤S4中，PBS缓冲液的浓度为5-20mM，优选为10mM。
在本发明的一个实施方式中，步骤S4中，PBS缓冲液的pH优选为7-8，由5-20mmol/LNa2HPO4和5-20mmol/LNaH2PO4组成。
在本发明的一个实施方式中，步骤S4中，所述保存溶液为含有NaCl、KCl、Tween 20的PBS缓冲液，保存溶液中，PBS缓冲液的浓度为5-20mM，优选为10mM，pH优选为7-8，更优选为7.4，NaCl的浓度为100-200mM，优选为2.7mM，KCl的浓度为2-5mM，优选为2.7mM，Tween 20的浓度优选为0.01％(v/v)。
在本发明的一个实施方式中，步骤S4中，保存溶液的存放条件为2-8℃，优选为4℃。
本发明还提供所述卡那霉素的识别/传感一体化探针的检测方法，包括以下步骤：将保存在保存溶液中的卡那霉素的识别/传感一体化探针与均相反应液以及待测样品进行反应，所述均相反应液包括切刻内切酶、NEB CutSmart buffer以及pH＝7.0-10.0的PBS缓冲溶液；通过检测溶液的荧光强度判断待测样品中卡那霉素的含量。
在本发明的一个实施方式中，所述切刻内切酶为Nt.Alwl，为0.5-20U的Nt.Alwl，优选为10U的Nt.Alwl。
在本发明的一个实施方式中，所述NEB CutSmart buffer选用1-10×NEBCutSmart buffer。
在本发明的一个实施方式中，所述pH＝7.0-10.0的PBS缓冲溶液为5-50mMNaHPO4-NaH2PO4。
在本发明的一个实施方式中，发生反应的条件为30-40℃，优选为37℃，反应时间是10-90min，优选为40min。
本发明的检测方式是基于溶液中荧光强度实现对目标的定量检测，当待测样品中存在卡那霉素时，适配体链与卡那霉素特异性结合，“激活”被封闭的Trigger链，Trigger链与修饰在纳米金上的底物链杂交，暴露酶切位点；在切刻内切酶的作用下，底物链被切割，标记荧光基团的核酸片段远离纳米金表面，被猝灭的荧光恢复；同时，游离的Trigger链在纳米金表面与其他底物链进行往复的“杂交-切割”，实现信号放大。最后，通过检测溶液的荧光强度对卡那霉素进行定量。
与现有技术相比，本发明构筑的一体化探针将目标识别和输出信号放大过程高度集成，单一探针即可完成整个检测过程；利用适配体识别和切刻内切酶的循环切割作用，将卡那霉素的浓度定量转变为荧光强度进行信号放大输出；在纳米金表面修饰的高密度荧光标记底物链，增加了信号放大过程中局部底物浓度，缩短了检测时间。
附图说明
附图1为卡那霉素的识别/传感一体化探针及其检测方法示意图。
附图2为卡那霉素的识别/传感一体化探针反应动力学曲线。
附图3为不同浓度卡那霉素对应的光谱图(3a)和标准曲线(3b)。
附图4为卡那霉素的识别/传感一体化探针对不同抗生素的响应情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种卡那霉素的识别/传感一体化探针及其检测方法，包括以下部分：
1)纳米金的合成
250mL双颈烧瓶中加入98mL超纯水，然后加入2mL，50mM HAuCl4溶液，使最终的HAuCl4浓度为1mM。将溶液加热至沸腾，用量筒快速加入10mL，38.8mM柠檬酸钠，待颜色应由浅黄色变为深红色。继续加热回流20min，移出油浴锅，继续磁力搅拌15min。避光冷却过夜。将合成的Au NPs在4℃的条件下，保存在棕色试剂瓶中。测定溶液在520nm处的吸光度值，根据朗伯-比尔定律确定Au NPs颗粒的浓度。
2)纳米金修饰
修饰所用序列如下：
适配体链：5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’；
荧光标记底物链：5’-TTTTTTTTTTGGATCATATAGTAGT-3’；
信号放大反应Trigger链：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGGCTTAGCTACTATATGATCCGAACCCCCA-3’；
所述荧光标记底物链的5’端修饰-SH，所述荧光标记底物链的3’端修饰荧光基团；
所述信号放大反应Trigger链的5’端修饰-SH。
本实施例中，荧光基团是FAM(羧基荧光素)。
将适配体链和Trigger链按照摩尔比为4：1在37℃静置杂交1h；加入底物链(荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链摩尔比5-40：1)，混合均匀，再加入5μl,10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦)和5μl,500mM乙酸盐缓冲(NaAc-HAc，pH＝5.2)，25℃静置活化1h。接着与1nM,3mL Au NPs混合，然后25℃下震荡孵育16h。
向上述溶液中加入30μL 500mM Tris-Hcl,pH＝8.2缓冲液至缓冲终浓度为5mmol/L，25℃静置孵育1h。然后，分4次加入1M NaCl，每次加入体积分别为：50μL，50μL，100μL，100μL，NaCl终浓度为100mM，25℃静置孵育24h；
用PBS缓冲液离心洗涤，去除未标记上的DNA链，最终保存在1×PBS buffer，pH7.4(10mM PBS，137mM NaCl，2.7mM KCl，pH7.4，0.01％Tween 20)中，所得溶液即为含有卡那霉素的识别/传感一体化探针的溶液，也称之为核酸修饰的纳米金溶液；
3)卡那霉素检测
依次加入1nM核酸修饰的纳米金溶液(20μL),10U Nt.Alwl，10X NEB CutSmartbuffer(5μL)，20μL不同浓度的卡那霉素，37℃条件静置反应40min后，加入350μL的10mM PBbuffer pH 8.0，记录519nm处荧光强度(485nm激发)。
本实施例中卡那霉素的识别/传感一体化探针及其检测方法示意如图1所示，
将一体化探针与不同浓度的卡那霉素于样品池中混合，依次加入10×NEBCutSmart buffer和10U Nt.Alwl，采用循环水浴装置控制反应池温度为30-40摄氏度，采用岛津RF-6000荧光分光光度计，在485nm处激发，记录519nm处随时间变化的荧光强，每次测量间隔1min。得到如图2所示一体化探针反应动力学曲线。
将1nM一体化探针溶液(20μL),10U Nt.Alwl，10×NEB CutSmart buffer(5μL)，20μL不同浓度的卡那霉素(从下至上依次为0，50，100，500，1000，2500，5000pM)，37℃条件静置反应40min后，加入350μL的10mM PB buffer pH 8.0，记录519nm处荧光强度(485nm激发)，得到如图3所示不同浓度卡那霉素对应的光谱图和标准曲线。
分别将1nM卡那霉素、10nM四环素、氨苄青霉素、氯霉素、土霉素和链霉素与一体化探针混合，按照实施例中步骤3)所述操作记录519nm处荧光强度(485nm激发)，得到如图4所示卡那霉素的识别/传感一体化探针对不同抗生素的响应情况。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海理工大学
<120> 卡那霉素的识别/传感一体化探针及制备方法与检测方法
<140> 2019107646205
<141> 2019-08-19
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
tgggggttga ggctaagccg a 21
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
tttttttttt ggatcatata gtagt 25
<210> 3
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttcggc ttagctacta 60
tatgatccga accccca 77

Claims (9)

1.一种卡那霉素的识别/传感一体化探针，其特征在于，所述卡那霉素的识别/传感一体化探针包括金纳米颗粒、适配体链、荧光标记底物链、信号放大反应Trigger链；
所述适配体链、荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链修饰在金纳米颗粒表面，得到卡那霉素的识别/传感一体化探针，所述卡那霉素的识别/传感一体化探针保存在保存溶液中；
所述适配体链、荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链序列分别为：
适配体链：5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’；
荧光标记底物链：5’-TTTTTTTTTTGGATCATATAGTAGT-3’；
信号放大反应Trigger链：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGGCTTAGCTACTATATGATCCGAACCCCCA-3’；
所述荧光标记底物链的5’端修饰-SH，所述荧光标记底物链的3’端修饰荧光基团；
所述信号放大反应Trigger链的5’端修饰-SH。
2.根据权利要求1所述卡那霉素的识别/传感一体化探针，其特征在于，所述荧光基团选自以下物质中的一种或几种：Cy 系列荧光染料、FAM 荧光染料、Rox 荧光染料、Alexa 系列染料、d6 过渡金属配合物或荧光纳米粒子。
3.根据权利要求1所述卡那霉素的识别/传感一体化探针，其特征在于，所述金纳米颗粒、适配体链、信号放大反应Trigger链、荧光标记底物链之间加入的比例关系为：
适配体链与信号放大反应Trigger链的摩尔比为1~4：1，
荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链的摩尔比为5~40：1，
核酸链与金纳米颗粒的摩尔比300~1000：1，所述核酸链指适配体链、信号放大反应Trigger链及荧光标记底物链。
4.根据权利要求1所述卡那霉素的识别/传感一体化探针，其特征在于，所述保存溶液中，金纳米颗粒的浓度为0.1-5 nM。
5.权利要求1-4中任一项所述卡那霉素的识别/传感一体化探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备纳米金溶液；
（2）将适配体链、荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链修饰到金纳米颗粒表面，得到卡那霉素的识别/传感一体化探针。
6.根据权利要求5所述卡那霉素的识别/传感一体化探针的制备方法，其特征在于，步骤（2）具体包括以下步骤：
S1、将适配体链和信号放大反应Trigger链按摩尔比为1~4：1静置杂交；
S2、在S1所得物中加入荧光标记底物链，混合均匀，再加入三（2-羧乙基）膦和乙酸盐缓冲液，静置活化，接着与纳米金溶液混合，震荡孵育；
S3、在S2所得物中加入Tris-Hcl缓冲液，静置孵育，然后，加入NaCl，静置孵育；
S4、用PBS缓冲液离心洗涤，去除未标记上的DNA链，保存在保存溶液中，备用。
7.根据权利要求6所述卡那霉素的识别/传感一体化探针的制备方法，其特征在于，步骤S2中，荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链的摩尔比为5~40：1，
三（2-羧乙基）膦和乙酸盐与核酸链的摩尔比为10-100:1；
核酸链与金纳米颗粒的摩尔比300~1000：1，所述核酸链指适配体链、信号放大反应Trigger链及荧光标记底物链。
8.权利要求1-4中任一项所述卡那霉素的识别/传感一体化探针的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
将保存在保存溶液中的卡那霉素的识别/传感一体化探针与均相反应液以及待测样品进行反应，所述均相反应液包括切刻内切酶、NEB CutSmart buffer以及pH=7.0-10.0的PBS缓冲液；通过检测溶液的荧光强度判断待测样品中卡那霉素的含量。
9.根据权利要求8所述卡那霉素的识别/传感一体化探针的检测方法，其特征在于：
所述切刻内切酶为Nt.Alwl；
所述NEB CutSmart buffer选用1-10× NEB CutSmart buffer；
所述pH= 7.0-10.0的PBS缓冲液为5-50 mM NaHPO4-NaH2PO4；
发生反应的条件为30-40℃，反应时间是10-90min。
CN201910764620.5A 2019-08-19 2019-08-19 卡那霉素的识别/传感一体化探针及制备方法与检测方法 Active CN110672851B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910764620.5A CN110672851B (zh) 2019-08-19 2019-08-19 卡那霉素的识别/传感一体化探针及制备方法与检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910764620.5A CN110672851B (zh) 2019-08-19 2019-08-19 卡那霉素的识别/传感一体化探针及制备方法与检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110672851A CN110672851A (zh) 2020-01-10
CN110672851B true CN110672851B (zh) 2022-12-16

Family

ID=69075400

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910764620.5A Active CN110672851B (zh) 2019-08-19 2019-08-19 卡那霉素的识别/传感一体化探针及制备方法与检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110672851B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111504966B (zh) * 2020-04-24 2023-06-13 济南大学 一种检测并降解氨苄青霉素的生物传感器及其制备方法与应用
CN111778315B (zh) * 2020-06-10 2023-03-14 山东师范大学 基于发夹锁定脱氧核酶探针的金纳米颗粒传感器及其检测muc1的应用
CN114350658B (zh) * 2022-03-16 2022-07-12 南京师范大学 一种四面体框架核酸sers探针、传感器及其制备方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103439296A (zh) * 2013-07-31 2013-12-11 南昌大学 基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建及应用
CN106645107A (zh) * 2016-09-29 2017-05-10 青岛科技大学 一种基于CdSe/ZnS量子点纳米簇的电化学发光生物传感器及其制法和应用
CN107238699A (zh) * 2017-05-10 2017-10-10 江南大学 一种基于适配体修饰磁珠和金纳米颗粒模拟酶活性检测卡那霉素的比色分析方法
CN109540860A (zh) * 2019-02-19 2019-03-29 济南大学 一种检测卡那霉素的荧光生物传感器及其制备方法和应用
CN110093344A (zh) * 2019-05-13 2019-08-06 山东大学 一种内源性酶触发的dna步行器及其检测udg的应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2702171A1 (de) * 2011-04-27 2014-03-05 Cherkasov, Dmitry Methoden und komponenten zur detektion von nukleinsäureketten

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103439296A (zh) * 2013-07-31 2013-12-11 南昌大学 基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建及应用
CN106645107A (zh) * 2016-09-29 2017-05-10 青岛科技大学 一种基于CdSe/ZnS量子点纳米簇的电化学发光生物传感器及其制法和应用
CN107238699A (zh) * 2017-05-10 2017-10-10 江南大学 一种基于适配体修饰磁珠和金纳米颗粒模拟酶活性检测卡那霉素的比色分析方法
CN109540860A (zh) * 2019-02-19 2019-03-29 济南大学 一种检测卡那霉素的荧光生物传感器及其制备方法和应用
CN110093344A (zh) * 2019-05-13 2019-08-06 山东大学 一种内源性酶触发的dna步行器及其检测udg的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110672851A (zh) 2020-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110672851B (zh) 卡那霉素的识别/传感一体化探针及制备方法与检测方法
Wang et al. A reusable aptamer-based evanescent wave all-fiber biosensor for highly sensitive detection of Ochratoxin A
Didenko DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications
áEric Aston et al. DNA detection on lateral flow test strips: enhanced signal sensitivity using LNA-conjugated gold nanoparticles
CN110398481B (zh) 一种基于无酶催化自组装的单个量子点荧光纳米传感器及其制备方法和应用
CN109540860B (zh) 一种检测卡那霉素的荧光生物传感器及其制备方法和应用
CN109001167B (zh) 一种基于适配体和碳点的链置换信号放大荧光传感器检测三磷酸腺苷的方法及试剂盒
CN111781186A (zh) 用于肿瘤蛋白和核酸标志物一体化检测的sers传感器及其制备方法
CN103760355B (zh) 微阵列芯片检测中核苷酸序列的颗粒标记方法
Zhao et al. A competitive colorimetric aptasensor for simple and sensitive detection of kanamycin based on terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated signal amplification strategy
Du et al. Multiplexed aptasensing of food contaminants by using terminal deoxynucleotidyl transferase-produced primer-triggered rolling circle amplification: application to the colorimetric determination of enrofloxacin, lead (II), Escherichia coli O157: H7 and tropomyosin
CN106645107A (zh) 一种基于CdSe/ZnS量子点纳米簇的电化学发光生物传感器及其制法和应用
Ren et al. A novel fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based paper sensor with smartphone for quantitative detection of Vibrio parahaemolyticus
CN107353903A (zh) 一种合成染料修饰dna功能化含镉量子点的方法及其应用
Li et al. An ultrasensitive fluorescence aptasensor for carcino-embryonic antigen detection based on fluorescence resonance energy transfer from upconversion phosphors to Au nanoparticles
EP2050817A1 (en) Nucleic acid strand useful in detecting substance and method thereof
Shokri et al. Virus-directed synthesis of emitting copper nanoclusters as an approach to simple tracer preparation for the detection of Citrus Tristeza Virus through the fluorescence anisotropy immunoassay
CN112961907B (zh) 一种同时检测两种rna的荧光生物传感器及其制备和使用方法
Hou et al. Bio-barcode assay: A useful technology for ultrasensitive and logic-controlled specific detection in food safety: A review
CN105838790B (zh) 一种银纳米簇传感器及其制备方法和在检测病毒基因中的应用
Qin et al. Time-resolved fluorescence based DNA detection using novel europium ternary complex doped silica nanoparticles
Gao et al. Sensitive fluorescence detection of DNA using isothermal exponential amplification coupled quantum dots coated silica nanospheres as label
Liang et al. A novel PCR-free and label-free cloth-based DNA sensor for sensitive and rapid detection of Escherichia coli
KR102332082B1 (ko) 자성 마이크로입자와 표면증강라만 신호를 이용한 바이오물질 검출 방법
Guo et al. Detection of norovirus RNA based on catalytic hairpin assembly and magnetic separation of DNA AgNCs

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant