CN107353903A - 一种合成染料修饰dna功能化含镉量子点的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种合成染料修饰DNA功能化含镉量子点的方法及其应用。该量子点是由一端染料修饰另一端硫代磷酸酯修饰的DNA通过硫与镉的强相互作用连接到量子点表面。是在量子点的合成过程中，将这种双修饰的DNA加入，作为量子点的共稳定剂，而得到该量子点探针。该量子点探针在比率荧光方面具有广泛应用，可实现核酸、蛋白、小分子及金属离子的精准检测；在DNA杂交及纳米材料自组装有着重要的应用价值。同时，该探针作为一个整体，可作为荧光成像探针，用于细胞识别和肿瘤靶向检测等方面。与其它双荧光发射纳米材料相比，该探针制备方法简单，无需偶联等化学修饰，在探针的合成纯化过程、稳定性及其它性能方面都有着相当大的优势。

Description

一种合成染料修饰DNA功能化含镉量子点的方法及其应用
技术领域
本发明涉及纳米材料和生物医学分析化学领域，具体涉及一种合成染料修饰DNA功能化含镉量子点的方法及其应用。
背景技术
量子点，又称半导体纳米晶体，是直径为1~100 nm 的零维纳米材料。含镉量子点是最为常用的量子点之一，其量子产率高、发射波长可调且稳定性好，在光电材料、分子生物学及生物医学分析等领域的研究越来越多。DNA功能化量子点在生物检测、成像及纳米材料自组装方面都有着更为广泛的应用。
单波长DNA功能化量子点的合成方法有许多，比如：1、将生物素修饰的DNA连接到亲和素修饰的量子点上，2、将氨基化的DNA与羧基的量子点进行化学偶联，3、将巯基化的DNA通过硫与镉的作用连接到量子点表面。以上方法成本非常高，制备过程繁琐，条件苛刻，且都易对量子点的发光效率造成影响。2009年，马楠等人将硫代磷酸酯修饰的DNA通过硫与镉的作用连接到量子点表面，该方法在合成量子点时同步进行DNA功能化修饰，简化了制备过程，从而减少了对量子点性能的影响（N. Ma, et al, Nat. Nanotechnol. 2009, 4,121-125），但他们合成的DNA功能化CdTe量子点细胞毒性大，量子产率较低。
相比于单波长荧光探针，比率型荧光探针在抗环境干扰、多目标及可视化检测等方面有着更大的优势。Zhang等人先对红色量子点进行硅烷化包裹，然后将羧基化的绿色量子点与氨基的硅壳进行共价偶联合成出了两个量子点的比率荧光探针（Z. P. Zhang, etal, J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 8424-8427; Z. P. Zhang, et al, Anal. Chem.2015, 87, 2087-2093）。Wang等人直接将氨基化的碳点与羧基化的CdTe量子点进行共价偶联，合成出了碳点与量子点的比率型荧光探针（Y. Yan, et al, Anal. Chem. 2015, 87,2087-2093）。Ma等人利用静电作用将一种咪唑类染料与量子点结合在一起构建了比率荧光探针，但静电作用力并不牢固，故该探针易受环境影响（F. Ma, et al, Sensors andActuators B: Chemical, 2015, 209, 377-383）。以上方法多是通过一步或多步偶联反应，将两个或多个荧光材料连接在一起，整个制备过程非常繁琐，耗时长，对材料的荧光性能影响较大。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种合成染料修饰DNA功能化含镉量子点的方法及其应用。这种双荧光发射的复合纳米材料是由一端染料修饰另一端硫代磷酸酯修饰的DNA通过硫与镉的强相互作用连接到量子点表面，DNA的连接数量可通过硫代磷酸酯修饰的碱基个数进行调控。与传统的DNA功能化量子点合成方法相比，该方法无需任何偶联，制备方法简单、不需要昂贵的设施，在一般实验室均可完成，节约了成本并提高了合成产率，细胞毒性小。在比率荧光方面，可实现核酸、蛋白、小分子及金属离子等多种分子的精准分析检测。
为了实现上述目的，本发明第一方面，提供一种合成染料修饰DNA功能化含镉量子点的方法的步骤如下：
（1）合成染料与硫代磷酸酯共同修饰的DNA：在DNA序列的 5’端修饰有硫代磷酸酯，3’端修饰有染料，或者3’端修饰有硫代磷酸酯，5’端修饰有染料；该DNA设计原则：5 ~ 20个硫代磷酸酯修饰碱基 + 4 ~ 10个连接臂 + 靶向序列 + 修饰的染料；
（2）合成染料修饰DNA功能化量子点：步骤（1）获得的一端染料修饰另一端硫代磷酸酯修饰的DNA与镉前体进行混合，然后加入碲前体，混合均匀，转入高温高压反应釜中，最后转移到200 ℃恒温箱中反应，通过硫与镉的强相互作用在合成量子点的同时将染料修饰DNA连接到量子点表面；得到染料修饰DNA功能化量子点，避光放置，以待进一步纯化；其中染料的种类、量子点的种类及合成方法并无限制，只需两者的荧光峰不发生光谱重叠即可；
（3）纯化：将步骤（2）获得的染料修饰DNA功能化量子点溶液用分子截留量为30000的超滤管进行离心纯化，将废液倒掉，再加入超纯水洗涤离心，如此循环洗涤离心4次，将超滤管倒置离心，得到荧光染料修饰DNA功能化量子点纯品，置于4 ℃下保存备用。
进一步地，所述量子点为CdZnTeS量子点，上述方法具体包括如下步骤：
1）合成染料与硫代磷酸酯共同修饰的DNA：DNA序列同时被染料和硫代磷酸酯修饰，其5’端修饰有硫代磷酸酯，3’端修饰有染料的核酸序列分别为G*G*G*G*G*G*G*G*AAAAAAAACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGTAAA-Rox (5’→ 3’ , *为硫代磷酸酯修饰，序列亦可换成3’端修饰有硫代磷酸酯，5’端修饰有染料)；
2）合成染料修饰DNA功能化量子点：
a.将氯化镉、氯化锌和N-乙酰-L-半胱氨酸溶解于去离子水中，得到混合溶液A，用氢氧化钠溶液调节混合溶液A的pH值至8.0 ~ 10.0，加入亚碲酸钠与2,3-二巯基丁二酸，得到混合溶液B，再用氢氧化钠溶液调节混合溶液B的pH值至10.0 ~ 12.0，最后加入20 ~ 200 µM染料与硫代磷酸酯共同修饰的DNA，搅拌均匀后转移至水热反应釜中，150 ~ 200 ℃下反应15 ~ 30 min，得到荧光染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点；其中氯化镉、氯化锌、N-乙酰-L-半胱氨酸、亚碲酸钠和2,3-二巯基丁二酸的摩尔比为1: (0.5 ~ 3): (1 ~ 10): (0.2 ~0.7): (0.05 ~ 0.5)；
b.将所得到的荧光染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点溶液用分子截留量为30000的超滤管进行离心纯化，将废液倒掉，再加入超纯水洗涤离心，如此循环洗涤离心4次，将超滤管倒置离心，得到荧光染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点纯品，置于4 ℃下保存备用。
进一步地，所述量子点为CdTe:Zn2+量子点，上述方法具体包括如下步骤：
1）合成染料与硫代磷酸酯共同修饰的DNA：DNA序列同时被染料和硫代磷酸酯修饰，其5’端修饰有硫代磷酸酯，3’端修饰有染料的核酸序列分别为G*G*G*G*G*G*G*G*AAAAAAAACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGTAAA-FAM (5’→ 3’ , *为硫代磷酸酯修饰，序列亦可换成3’端修饰有硫代磷酸酯，5’端修饰有染料)；
2）合成染料修饰DNA功能化量子点：
a.将氯化镉、氯化锌和N-乙酰-L-半胱氨酸溶解于去离子水中，得到混合溶液A，用氢氧化钠溶液调节混合溶液A的pH值至9.0；取亚碲酸钠与硼氢化钠，溶解于去离子水中，充氮气1 min以除去氧气，在冰浴中反应5-7 h，得到无色或浅粉色液体B；取400 µL混合溶液A，加入80 nmol染料FAM与硫代磷酸酯共同修饰的DNA，用去离子水使整个溶液体积为2 mL，为混合溶液C，最后取5 µL无色液体B快速加入2 mL混合溶液C中，搅拌均匀后转移至水热反应釜中，于200 ℃下反应26 min，得到荧光染料FAM修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点，其中氯化镉、氯化锌、N-乙酰-L-半胱氨酸、碲粉和硼氢化钠的摩尔比为1: (1~ 4): (1 ~ 10): (0.2~ 0.7): (0.3 ~ 1.5)；
b.将所得的荧光染料FAM修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点溶液用分子截留量为30000的超滤管进行离心纯化，将废液倒掉，再加入超纯水洗涤离心，如此循环洗涤离心4次，将超滤管倒置离心，得到荧光染料FAM修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点纯品，置于4 ℃下保存备用。
进一步地，所述量子点为CdTe/CdS量子点，上述方法具体包括如下步骤：
1）合成染料与硫代磷酸酯共同修饰的DNA：DNA序列同时被染料和硫代磷酸酯修饰，其5’端修饰有染料，3’端修饰有硫代磷酸酯的核酸序列分别为Rox-GGACACAGATACTGTTCTCCAACATTTACTGTGTCCAAAAAAAG*G* G*G*G* G*G*G* (5’→ 3’ , *为硫代磷酸酯修饰，序列亦可换成5’端修饰有硫代磷酸酯，3’端修饰有染料)；
2）合成染料修饰DNA功能化量子点：
a.将氯化镉和N-乙酰-L-半胱氨酸溶解于去离子水中，得到混合溶液A，用氢氧化钠溶液调节混合溶液A的pH值至9.0，再加入亚碲酸钠与还原剂硼氢化钠，搅拌均匀后转移至水热反应釜中，200℃下反应18 min，得到CdTe量子点；其中氯化镉、N-乙酰-L-半胱氨酸、亚碲酸钠和硼氢化钠的摩尔比为1: (1 ~ 10): (0.1 ~ 0.4): (0.2 ~ 0.8)；
b.将所得的CdTe量子点溶液加入到足量的异丙醇中，搅拌均匀，得到量子点浑浊液，将量子点浑浊液离心、洗涤4次，将所得固体物进行真空干燥，得到纯化、干燥的CdTe量子点，置于4℃下保存备用；
c.将0.025 mmol氯化镉和0.025 mmol 2,3-二巯基丙磺酸钠溶解于去离子水中，得混合溶液B，用氢氧化钠溶液调节混合溶液B调节pH值为9.0；取混合溶液B，再加入CdTe量子点溶液和80 nmol Rox与硫代磷酸酯共同修饰的DNA，搅拌均匀后转移至水热反应釜中，200℃下反应22 min，得到Rox-DNA功能化CdTe/CdS量子点；其中CdTe量子点、氯化镉与2,3-二巯基丙磺酸钠的摩尔比为1：500：1200；将反应后所得的Rox-DNA功能化CdTe/CdS量子点混合物用超滤离心管超滤4次，即得到Rox修饰DNA功能化CdTe/CdS量子点。
本发明第二方面，提供染料修饰DNA功能化含镉量子点作为双荧光发射纳米材料在金属离子、小分子及蛋白质检测中的应用。
本发明第三方面，提供染料修饰DNA功能化含镉量子点在生物传感、细胞及活体成像方面的应用。
本发明第四方面，提供染料修饰DNA功能化含镉量子点在核酸及蛋白的检测中的应用。
本发明第五方面，提供染料修饰DNA功能化含镉量子点在纳米材料的自组装中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：
1、在量子点的合成过程中，加入染料和硫代磷酸酯共同修饰的DNA，首次提出了染料修饰DNA功能化含镉量子点合成的方法，并将该探针应用于金属离子、小分子及蛋白质等的检测。该合成方法简单，大大简化了合成过程，节约了成本并提高了合成产率。
2、与传统的DNA功能化含镉量子点合成方法相比，该方法无需任何偶联，制备方法简单、成本低，不需要昂贵的设施，在一般实验室均可完成。
3、这种双荧光发射的复合纳米材料对染料的种类及量子点的种类及合成方法并无限制，只需两者的荧光峰不发生光谱重叠即可，从而能构建出多种双荧光发射纳米材料。
4、这种双荧光发射的复合纳米材料在比率荧光方面有着广泛的应用，且该比率荧光探针合成更简单、发光效率更高、稳定性更好，能更好地应用于生物传感、细胞及活体成像等方面。
5、该探针中的DNA可参与杂交反应，能实现对核酸及蛋白等多种分子的检测。同时该探针还可应用与纳米材料的自组装中，从而拓宽该探针的应用范围。
附图说明
图1为实施例1所合成的染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点的紫外-可见光吸收光谱（图A）及荧光发射光谱图（图B）；
图2为实施例1所合成的染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点与实施例2所合成的CdZnTeS量子点的透射电镜图；
图2A与B分别为CdZnTeS量子点（λem=527 nm）的电镜及粒径分布图，C与D分别为染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点（λem=516 nm）的电镜及粒径分布图；
图3为实施例3所合成的染料修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点的紫外-可见光吸收光谱（图A）及荧光发射光谱图（图B）；
图4为实施例4所合成的染料修饰DNA功能化CdTe/CdS量子点的紫外-可见光吸收光谱（图A）及荧光发射光谱图（图B）；
图5为染料修饰DNA功能化量子点用于金属离子、小分子及蛋白等检测的实验原理；
图A为染料修饰DNA功能化量子点用于过氧化氢、葡萄糖、多巴胺及酪氨酸酶检测的原理。过氧化氢能氧化量子点的表面配体而使得量子点的荧光猝灭，但对染料的荧光基本没有影响，故可利用其荧光强度比值的变化与目标物浓度的关系实现对过氧化氢的检测。葡萄糖的检测原理则是利用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化生成过氧化氢而实现的。多巴胺能被氧化成多巴胺醌，多巴胺醌在450-600 nm有一定的吸收且为缺电子分子，故可通过荧光共振能量转移（FRET）或电子转移机理（ET）猝灭量子点的荧光，而对染料Rox的影响很小，而实现对多巴胺的检测，但多巴胺在空气中氧化速率小，需要很长时间，酪氨酸酶能催化多巴胺氧化成多巴胺醌，从而可实现对多巴胺和酪氨酸酶的检测。图A中所用探针为Rox-DNA功能化CdZnTeS量子点。
图B为染料修饰DNA功能化量子点用于Cu2+的检测的原理。Cu2+能与量子点的表面配体作用而使得量子点的荧光猝灭，但对染料FAM基本无影响，故可实现对Cu2+的检测。图B中所用探针为FAM-DNA功能化CdTe:Zn2+量子点。
图C为染料修饰DNA功能化量子点用于核酸检测的原理图，其中DNA序列为发卡结构，在95 ℃退火条件下，可形成发卡结构使得量子点与染料之间发生FRET，加入互补DNA链后，发卡结构别打开，FRET被破坏，利用FRET破坏的程度与核酸浓度的关系可实现对DNA的检测，同时也说明染料修饰DNA功能化量子点可用于纳米材料的自组装，其所用探针为Rox-DNA功能化CdTe/CdS量子点。
图6为实施例3所合成的染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点用于检测过氧化氢的荧光光谱图；
图7为实施例4所合成的染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点用于检测葡萄糖的荧光光谱图；
图8为实施例5所合成的染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点用于检测多巴胺的荧光光谱图；
图9为实施例6所合成的染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点用于检测酪氨酸酶的荧光光谱图；
图10为实施例3所合成的染料修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点用于检测Cu2+的荧光光谱图；
图11为实施例4所合成的染料修饰DNA功能化CdTe/CdS量子点用于检测DNA的荧光光谱图；
图12为实施例1所合成的染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点应用于实际样品中葡萄糖含量检测的结果图；
图13为实施例1所合成的染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点及实施例2所合成的CdZnTeS量子点用于葡萄糖检测的可视化结果图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例1】一种荧光染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点的方法
其合成方法包括如下步骤：
1）将0.025 mmol氯化镉、0.025 mmol氯化锌和0.05 mmol N-乙酰-L-半胱氨酸溶解于去离子水中，得到混合溶液A，用氢氧化钠溶液调节混合溶液A的pH值至10.0，加入0.01mmol亚碲酸钠与0.005 mmol 2,3-二巯基丁二酸，再用氢氧化钠溶液调节混合溶液B的pH值至11.0，最后加入80 nmol染料与硫代磷酸酯共同修饰的DNA，搅拌均匀后转移至水热反应釜中，于200 ℃下反应18 min，得到荧光染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点；
所述的DNA由发明人设计好交由上海生工合成，其 5’端修饰有硫代磷酸酯，3’端修饰有染料的核酸序列分别为G*G*G* G*G*G* G*G*A AAA AAA ACC TTC CTC CGC AAT ACT CCCCCA GGT AAA-Rox (5’→ 3’ , *为硫代磷酸酯修饰，序列亦可换成5’端修饰有染料Rox，3’端修饰有硫代磷酸酯)，该DNA设计原则：5 ~ 20个硫代磷酸酯修饰碱基 + 4 ~ 10个连接臂+ 靶向序列 + 修饰的染料。
2）将所得的荧光染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点溶液用分子截留量为30000的超滤管进行离心纯化，将废液倒掉，再加入超纯水洗涤离心，如此循环洗涤离心4次，将超滤管倒置离心，得到荧光染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点纯品，置于4 ℃下保存备用，需要时再将其稀释成所需浓度的水溶液。
图1为染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点的紫外-可见光吸收光谱（图A）及荧光发射光谱图（图B），由紫外-可见吸收光谱图可知，该探针存在253 nm、490 nm及588 nm三个明显的吸收峰，其分别为DNA、量子点及Rox染料的吸收峰，可见染料修饰的DNA已成功连接到量子点上。由荧光光谱图可知，该探针在不同激发波长下都有一定强度的量子点和染料的荧光发射峰，当激发波长为340 nm时，染料的荧光发射强度适当且量子点与染料的荧光强度比值最大，最适于分析检测。
【实施例2】一种CdZnTeS量子点的方法
其合成方法包括如下步骤：
1）将0.025 mmol氯化镉、0.025 mmol氯化锌和0.05 mmol N-乙酰-L-半胱氨酸溶解于去离子水中，得到混合溶液A，用氢氧化钠溶液调节混合溶液A的pH值至10.0，加入0.02mmol亚碲酸钠与0.01 mmol 2,3-二巯基丁二酸，再用氢氧化钠溶液调节混合溶液B的pH值至11.0，搅拌均匀后转移至水热反应釜中，于200 ℃下反应18 min，得到CdZnTeS量子点；
2）将所得到的CdZnTeS量子点溶液用分子截留量为30000的超滤管进行离心纯化，将废液倒掉，再加入超纯水洗涤离心，如此循环洗涤离心4次，将超滤管倒置离心，得到CdZnTeS量子点纯品，置于4 ℃下保存备用，需要时再将其稀释成所需浓度的水溶液。
图2为实施例1所合成的染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点与实施例2所合成的CdZnTeS量子点的透射电镜图。图2A与B分别为CdZnTeS量子点（λem=527 nm）的电镜及粒径分布图，C与D分别为染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点（λem=516 nm）的电镜及粒径分布图，两种量子点的分散性都比较好。对比染料修饰前后量子点的粒径，发现量子点进行染料修饰的DNA功能化后，基本没有改变原量子点的粒径。
【实施例3】一种荧光染料修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点的方法
其合成方法包括如下步骤：
1）将0.025 mmol氯化镉、0.05 mmol氯化锌和0.05 mmol N-乙酰-L-半胱氨酸溶解于去离子水中，得到混合溶液A，用氢氧化钠溶液调节混合溶液A的pH值至9.0。取0.01 mmol亚碲酸钠与0.005 mmol硼氢化钠，溶解于1 mL去离子水中，充氮气1 min以除去氧气，在冰浴中反应5-7 h，得到无色或浅粉色液体B。取400 µL混合溶液A，加入80 nmol染料FAM与硫代磷酸酯共同修饰的DNA，用去离子水使整个溶液体积为2 mL，为混合溶液C，最后取5 µL无色液体B快速加入2 mL混合溶液C中，搅拌均匀后转移至水热反应釜中，于200 ℃下反应26 min，得到荧光染料FAM修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点。
所述的DNA由发明人设计好交由上海生工合成，其 5’端修饰有硫代磷酸酯，3’端修饰有染料的核酸序列分别为G*G*G* G*G*G* G*G*A AAA AAA ACC TTC CTC CGC AAT ACTCCC CCA GGT AAA-FAM (5’→ 3’ , *为硫代磷酸酯修饰，序列亦可换成5’端修饰有染料FAM，3’端修饰有硫代磷酸酯)，该DNA设计原则：5 ~ 20个硫代磷酸酯修饰碱基 + 4 ~ 10个连接臂 + 靶向序列 + 修饰的染料。
2）将所得的荧光染料FAM修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点溶液用分子截留量为30000的超滤管进行离心纯化，将废液倒掉，再加入超纯水洗涤离心，如此循环洗涤离心4次，将超滤管倒置离心，得到荧光染料FAM修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点纯品，置于4 ℃下保存备用，需要时再将其稀释成所需浓度的水溶液。
图3为实施例3所合成的染料修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点的紫外-可见光吸收光谱（图A）及荧光发射光谱图（图B）。由紫外-可见吸收光谱图可知，该探针存在255 nm、490nm及558 nm三个明显的吸收峰，其分别为DNA、FAM染料及量子点的吸收峰。可见染料FAM修饰的DNA已成功连接到量子点上。由荧光光谱图可知，该探针在不同激发波长下都有一定强度的量子点和染料的荧光发射峰，当激发波长为340 nm时，染料的荧光发射强度适当且量子点的荧光强度最大，最适于分析检测。
【实施例4】一种荧光染料修饰DNA功能化CdTe/CdS量子点的方法
其合成方法包括如下步骤：
1）将0.025 mmol氯化镉和0.05 mmol N-乙酰-L-半胱氨酸溶解于去离子水中，得到混合溶液A，用氢氧化钠溶液调节混合溶液A的pH值至9.0，再加入0.01 mmol亚碲酸钠与0.01mmol还原剂硼氢化钠，搅拌均匀后转移至水热反应釜中，200℃下反应18 min，得到CdTe量子点；
2）将所得的CdTe量子点溶液加入到足量的异丙醇中，搅拌均匀，得到量子点浑浊液，将量子点浑浊液离心、洗涤4次，将所得固体物进行真空干燥，得到纯化、干燥的CdTe量子点，置于4℃下保存备用；
3）将0.025 mmol氯化镉和0.025 mmol 2,3-二巯基丙磺酸钠溶解于去离子水中，得混合溶液B，用氢氧化钠溶液调节混合溶液B调节pH值为9.0。取混合溶液B，再加入CdTe量子点溶液和80 nmol Rox与硫代磷酸酯共同修饰的DNA，搅拌均匀后转移至水热反应釜中，200℃下反应22 min，将反应后所得的混合物用超滤离心管超滤4次，即得到Rox修饰DNA功能化CdTe/CdS量子点。
所述的DNA由发明人设计好交由上海生工合成，其 5’端修饰有硫代磷酸酯，3’端修饰有染料的核酸序列分别为Rox-GGA CAC AGA TAC TGT TCT CCA ACA TTT ACT GTG TCCAAA AAA AG*G* G*G*G* G*G*G*(5’→ 3’ , *为硫代磷酸酯修饰，序列亦可换成5’端修饰有硫代磷酸酯，3’端修饰有染料Rox)，该DNA设计原则：5 ~ 20个硫代磷酸酯修饰碱基 + 4~ 10个连接臂 + 靶向序列 + 修饰的染料。
图4为实施例4所合成的染料修饰DNA功能化CdTe/CdS量子点的紫外-可见光吸收光谱（图A）及荧光发射光谱图（图B）。由紫外-可见吸收光谱图可知，该探针存在255 nm、545nm及588 nm三个明显的吸收峰，其分别为DNA、量子点及染料Rox的吸收峰。可见染料Rox修饰的DNA已成功连接到量子点上。由荧光光谱图可知，量子点与Rox的荧光峰有一定的重叠，是为了能使量子点的发射与染料的吸收有着更好的重叠同时两者的荧光峰又能基本分开，从而能更好的发生FRET。
【实施例5】一种荧光染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点检测过氧化氢的方法
其检测方法包括如下步骤：
取10 µL Rox-DNA功能化量子点，并加入不同浓度的过氧化氢，加入20 mM的Tris缓冲液（pH = 8.4）使得反应体系的总体积为300 µL。将混合溶液于室温条件下反应60 min，然后，用340 nm作为激发波长测定其荧光光谱。
由图6可知，当反应体系中存在过氧化氢时，量子点的荧光会被猝灭，而染料的荧光基本不发生变化。利用量子点与染料的荧光强度变化与过氧化氢浓度的关系，可实现对过氧化氢的定量检测。其线性范围为0.33-50.0 µM，检出限为0.075 µM。过氧化氢和辣根过氧化物酶是免疫分析中的重要物质，过氧化氢的灵敏检测也证明了该探针在荧光酶联免疫分析中将有着重要的应用价值。
【实施例6】一种荧光染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点检测葡萄糖的方法
其检测方法包括如下步骤：
取10 µL Rox-DNA 功能化量子点，加入固定量的葡萄糖氧化酶，再加入不同浓度的葡萄糖，最后加入20 mM的Tris缓冲液（pH = 8.4）使得反应体系的总体积为300 µL。 将混合溶液于室温条件下反应60 min，然后，用340 nm作为激发波长测定其荧光光谱。
由图7可知，当反应体系中存在葡萄糖氧化酶和葡萄糖时，体系中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下被氧化，生成过氧化氢，从而使得量子点的荧光被猝灭，但染料的荧光基本不发生变化。利用量子点与染料的荧光强度变化与葡萄糖浓度的关系，可实现对葡萄糖的定量检测，其线性范围为0.33-5.0 µM, 5.0-100.0 µM，检出限为0.042 µM。
【实施例7】 一种荧光染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点检测多巴胺的方法
其检测方法包括如下步骤：
取10 µL Rox-DNA功能化量子点，加入固定量的酪氨酸酶，再加入不同浓度的多巴胺，最后加入20 mM的Tris缓冲液（pH = 8.4）使得反应体系的总体积为300 µL。 将混合溶液于室温条件下反应30 min，然后，用340 nm作为激发波长测定其荧光光谱。
由图8可知，当反应体系中存在固定量的酪氨酸酶和不同浓度多巴胺时，多巴胺在酪氨酸酶的催化作用下会被氧化成多巴胺醌，多巴胺醌能猝灭量子点的荧光，而染料的荧光基本不发生变化。利用量子点与染料的荧光强度变化与多巴胺浓度的关系，可实现对多巴胺的定量检测，其线性范围为10.0-1000.0 nM，检出限为1.93 nM。
【实施例8】一种荧光染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点检测酪氨酸酶的方法
其检测方法包括如下步骤：
取10 µL Rox-DNA 功能化量子点，加入固定量的多巴胺，再加入不同浓度的酪氨酸酶，最后加入20 mM的Tris缓冲液（pH = 8.4）使得反应体系的总体积为300 µL。 将混合溶液于室温条件下反应30 min，然后，用340 nm作为激发波长测定其荧光光谱。
由图9可知，当反应体系中存在不同浓度的酪氨酸酶和固定量的多巴胺时，多巴胺在酪氨酸酶的催化作用下会被氧化成多巴胺醌，多巴胺醌能猝灭量子点的荧光，而染料的荧光基本不发生变化。利用量子点与染料的荧光强度变化与酪氨酸酶浓度的关系，可实现酪氨酸酶的定量检测，其线性范围为10.0-100.0 ng/mL，检出限为2.87 ng/mL。
【实施例9】一种荧光染料修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点检测铜离子的方法其检测方法包括如下步骤：
取10 µL FAM-DNA功能化CdTe:Zn2+量子点，并加入不同浓度的CuSO4溶液，加入20 mM的Tris缓冲液（pH = 8.4）使得反应体系的总体积为300 µL。将混合溶液于室温条件下反应5min，然后，用340 nm作为激发波长测定其荧光光谱。
由图10可知，当反应体系中存在Cu2+时，Cu2+会与量子点的表面配体作用而使得量子点的荧光猝灭，但FAM的荧光基本不发生变化，利用量子点与染料的荧光强度变化与Cu2+浓度的关系，从而实现对Cu2+的定量检测，其线性范围为3.0-50.0 nM，检出限为0.57 nM。
【实施例10】一种荧光染料修饰DNA功能化CdTe/CdS量子点检测核酸的方法其检测方法包括如下步骤：
1）取2 µL Rox-DNA功能化CdTe/CdS量子点，并加入198 µL Tris缓冲液（20 mM Tris，200 mM NaCl，pH 7.4），95 ℃加热退火10 min，室温冷却30 min，为混合溶液A，以备用。
2）取5 µL混合溶液A，加入不同浓度的互补DNA链，再加入Tris缓冲液（20 mMTris，200 mM NaCl，pH 7.4）使得反应体系的总体积为300 µL。 将混合溶液于室温条件下反应30 min，然后，用350 nm作为激发波长测定其荧光光谱。
由图11A可知，Rox-DNA功能化CdTe/CdS量子点经过退火后，会形成发卡结构，使得量子点与染料的距离变小，然后量子点的荧光会通过FRET转移给Rox，最后量子点荧光降低而Rox的荧光增强。图11B可知，加入不同浓度互补DNA链后，发卡结构被打开，量子点与染料的距离变大，FRET被破坏，从而实现对DNA的定量检测。DNA的成功检测说明了染料修饰DNA功能化量子点中的DNA可以参与杂交反应，可在利用DNA及DNA功能化量子点实现纳米材料的自组装。
【实施例11】一种荧光染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点检测用于实际样品检测的方法
其检测方法包括如下步骤：
取10 µL Rox-DNA 功能化量子点，加入固定量的葡萄糖氧化酶，再加入预处理过的不同人的实际血清样品，最后加入20 mM的Tris缓冲液（pH = 8.4）使得反应体系的总体积为300 µL。 将混合溶液于室温条件下反应60 min，然后，用340 nm作为激发波长测定其荧光光谱。
由图12A可知，不同人的血糖反应所产生的过氧化氢可对量子点的荧光产生不同的猝灭效果，根据猝灭程度不同，可实现人血糖含量的定量检测；由图12B可知，该探针对人血糖定量检测的结果与商业化的血糖仪所测得的结果基本一致，说明该探针能准确地测定实际样品中的葡萄糖，具有一定的实际应用价值。
【实施例12】一种荧光染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点用于葡萄糖的可视化检测的方法
其检测方法包括如下步骤：
1）分别取10 µL 裸量子点与Rox-DNA 功能化量子点，加入固定量的葡萄糖氧化酶，再加入不同浓度的葡萄糖，最后加入20 mM的Tris缓冲液（pH = 8.4）使得反应体系的总体积为300 µL。 将混合溶液于室温条件下反应60 min，然后，在紫外暗箱中用激发波长为365nm的紫外灯照射、观察并拍照。
2）分别取10 µL 裸量子点与Rox-DNA 功能化量子点，加入固定量的葡萄糖氧化酶，再加入超滤处理过的不同稀释倍数的实际血清样品，最后加入20 mM的Tris缓冲液（pH= 8.4）使得反应体系的总体积为300 µL。 将混合溶液于室温条件下反应60 min，然后，在紫外暗箱中用激发波长为365 nm的紫外灯照射、观察并拍照。
3）分别取10 µL 裸量子点Rox-DNA 功能化量子点，加入固定量的葡萄糖氧化酶，再加入超滤处理过的不同人的实际血清样品，最后加入20 mM的Tris缓冲液（pH = 8.4）使得反应体系的总体积为300 µL。 将混合溶液于室温条件下反应60 min，然后，在紫外暗箱中用激发波长为365 nm的紫外灯照射、观察并拍照。
由图13A可知，该探针在紫外灯下的颜色会随着葡萄糖含量的变化而发生变化，可实现目标物的裸眼可视化检测；由图13C可知，该探针可实现实际样品中葡萄糖可视化检测；由图13E可知，该探针能明显地区分正常人与糖尿病患者；图13B、D、F为裸量子点用于检测葡萄糖的结果，对比图13A、C、E与图13B、D、F可知，相比于单色荧光探针，该探针具有更高的可视化检测灵敏度。该方法能简单快速地实现实际样品检测，在实际样品分析中具有一定的应用价值。

Claims (8)

1.一种合成染料修饰DNA功能化含镉量子点的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）合成染料与硫代磷酸酯共同修饰的DNA：在DNA序列的 5’端修饰有硫代磷酸酯，3’端修饰有染料，或者3’端修饰有硫代磷酸酯，5’端修饰有染料；该DNA设计原则：5 ~ 20个硫代磷酸酯修饰碱基 + 4 ~ 10个连接臂 + 靶向序列 + 修饰的染料；
（2）合成染料修饰DNA功能化量子点：步骤（1）获得的一端染料修饰另一端硫代磷酸酯修饰的DNA与镉前体进行混合，然后加入碲前体，混合均匀，转入高温高压反应釜中，最后转移到200 ℃恒温箱中反应，通过硫与镉的强相互作用在合成量子点的同时将染料修饰DNA连接到量子点表面；得到染料修饰DNA功能化量子点，避光放置，以待进一步纯化；
其中染料的种类、量子点的种类及合成方法并无限制，只需两者的荧光峰不发生光谱重叠即可；
（3）纯化：将步骤（2）获得的染料修饰DNA功能化量子点溶液用分子截留量为30000的超滤管进行离心纯化，将废液倒掉，再加入超纯水洗涤离心，如此循环洗涤离心4次，将超滤管倒置离心，得到荧光染料修饰DNA功能化量子点纯品，置于4 ℃下保存备用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述量子点为荧光染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点，合成方法具体包括如下步骤：
1）合成染料与硫代磷酸酯共同修饰的DNA：DNA序列同时被染料和硫代磷酸酯修饰，其5’端修饰有硫代磷酸酯，3’端修饰有染料的核酸序列分别为G*G*G*G*G*G*G*G*AAAAAAAACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGTAAA-Rox (5’→ 3’ , *为硫代磷酸酯修饰，序列亦可换成3’端修饰有硫代磷酸酯，5’端修饰有染料)；
2）合成染料修饰DNA功能化量子点：
将氯化镉、氯化锌和N-乙酰-L-半胱氨酸溶解于去离子水中，得到混合溶液A，用氢氧化钠溶液调节混合溶液A的pH值至8.0 ~ 10.0，加入亚碲酸钠与2,3-二巯基丁二酸，得到混合溶液B，再用氢氧化钠溶液调节混合溶液B的pH值至10.0 ~ 12.0，最后加入20 ~ 200 µM 染料与硫代磷酸酯共同修饰的DNA，搅拌均匀后转移至水热反应釜中，150 ~ 200 ℃下反应15~ 30 min，得到荧光染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点；其中氯化镉、氯化锌、N-乙酰-L-半胱氨酸、亚碲酸钠和2,3-二巯基丁二酸的摩尔比为1: (0.5 ~ 3): (1 ~ 10): (0.2 ~0.7): (0.05 ~ 0.5)；
3）将所得到的荧光染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点溶液用分子截留量为30000的超滤管进行离心纯化，将废液倒掉，再加入超纯水洗涤离心，如此循环洗涤离心4次，将超滤管倒置离心，得到荧光染料修饰DNA功能化CdZnTeS量子点纯品，置于4 ℃下保存备用。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述量子点为荧光染料修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点，合成方法具体包括如下步骤：
1）合成染料与硫代磷酸酯共同修饰的DNA：DNA序列同时被染料和硫代磷酸酯修饰，其5’端修饰有硫代磷酸酯，3’端修饰有染料的核酸序列分别为G*G*G*G*G*G*G*G*AAAAAAAACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGTAAA-FAM (5’→ 3’ , *为硫代磷酸酯修饰，序列亦可换成3’端修饰有硫代磷酸酯，5’端修饰有染料)；
2）合成染料修饰DNA功能化量子点：
将氯化镉、氯化锌和N-乙酰-L-半胱氨酸溶解于去离子水中，得到混合溶液A，用氢氧化钠溶液调节混合溶液A的pH值至9.0；取亚碲酸钠与硼氢化钠，溶解于去离子水中，充氮气1min以除去氧气，在冰浴中反应5-7 h，得到无色或浅粉色液体B；取400 µL混合溶液A，加入80 nmol染料FAM与硫代磷酸酯共同修饰的DNA，用去离子水使整个溶液体积为2 mL，为混合溶液C，最后取5 µL无色液体B快速加入2 mL混合溶液C中，搅拌均匀后转移至水热反应釜中，于200 ℃下反应26 min，得到荧光染料FAM修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点，其中氯化镉、氯化锌、N-乙酰-L-半胱氨酸、碲粉和硼氢化钠的摩尔比为1: (1~ 4): (1 ~ 10): (0.2~ 0.7): (0.3 ~ 1.5)；
3）将所得的荧光染料FAM修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点溶液用分子截留量为30000的超滤管进行离心纯化，将废液倒掉，再加入超纯水洗涤离心，如此循环洗涤离心4次，将超滤管倒置离心，得到荧光染料FAM修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点纯品，置于4 ℃下保存备用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述量子点为荧光染料修饰DNA功能化CdTe/CdS量子点，合成方法具体包括如下步骤：
1）合成染料与硫代磷酸酯共同修饰的DNA：DNA序列同时被染料和硫代磷酸酯修饰，其5’端修饰有染料，3’端修饰有硫代磷酸酯的核酸序列分别为Rox-GGACACAGATACTGTTCTCCAACATTTACTGTGTCCAAAAAAAG*G* G*G*G* G*G*G* (5’→ 3’ , *为硫代磷酸酯修饰，序列亦可换成5’端修饰有硫代磷酸酯，3’端修饰有染料)；
2）合成染料修饰DNA功能化量子点：
a.将氯化镉和N-乙酰-L-半胱氨酸溶解于去离子水中，得到混合溶液A，用氢氧化钠溶液调节混合溶液A的pH值至9.0，再加入亚碲酸钠与还原剂硼氢化钠，搅拌均匀后转移至水热反应釜中，200℃下反应18 min，得到CdTe量子点；其中氯化镉、N-乙酰-L-半胱氨酸、亚碲酸钠和硼氢化钠的摩尔比为1: (1 ~ 10): (0.1 ~ 0.4): (0.2 ~ 0.8)；
b.将所得的CdTe量子点溶液加入到足量的异丙醇中，搅拌均匀，得到量子点浑浊液，将量子点浑浊液离心、洗涤4次，将所得固体物进行真空干燥，得到纯化、干燥的CdTe量子点，置于4℃下保存备用；
3）将氯化镉和2,3-二巯基丙磺酸钠溶解于去离子水中，得混合溶液B，用氢氧化钠溶液调节混合溶液B调节pH值为9.0；取混合溶液B，再加入CdTe量子点溶液和80 nmol Rox与硫代磷酸酯共同修饰的DNA，搅拌均匀后转移至水热反应釜中，200℃下反应22 min，得到Rox-DNA功能化CdTe/CdS量子点；其中CdTe量子点、氯化镉与2,3-二巯基丙磺酸钠的摩尔比为1：500：1200；将反应后所得的混合物用超滤离心管超滤4次，即得到Rox修饰DNA功能化CdTe/CdS量子点。
5.权利要求1-4所述的染料修饰DNA功能化含镉量子点作为双荧光发射纳米材料在金属离子、小分子及蛋白质检测中的应用。
6.权利要求1-4所述的染料修饰DNA功能化含镉量子点在生物传感、细胞及活体成像方面的应用。
7.权利要求1-4所述的染料修饰DNA功能化含镉量子点在核酸及蛋白的检测中的应用。
8.权利要求1-4所述的染料修饰DNA功能化含镉量子点在纳米材料的自组装中的应用。
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