KR20110122320A

KR20110122320A - 형광공명에너지전이-기반 나노센서 시스템 및 이를 이용한 검출방법

Info

Publication number: KR20110122320A
Application number: KR1020100041746A
Authority: KR
Inventors: 김종성; 유정하
Original assignee: 경원대학교 산학협력단
Priority date: 2010-05-04
Filing date: 2010-05-04
Publication date: 2011-11-10

Abstract

본 발명은 양자점(quantum dot)과 삽입 염료(intercalating dye) 간의 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer; FRET) 현상을 기반으로 하여, 표적 핵산(또는 유전물질)을 간편하면서 정확하게 검출할 수 있는 나노센서 시스템 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.

Description

형광공명에너지전이-기반 나노센서 시스템 및 이를 이용한 검출방법{FRET-based Nano-sensor System and Detection Method Using the Same}

본 발명은 형광공명에너지전이-기반 나노센서 시스템 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 양자점(quantum dot)과 삽입 염료(intercalating dye) 간의 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer; FRET) 현상을 기반으로 하여, 표적 핵산(또는 유전물질)을 간편하면서 정확하게 검출할 수 있는 나노센서 시스템 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.

양자점은 나노 사이즈의 결정으로서, 독특한 광학 특성으로 인하여 최근 바이오 분야에서 많은 주목을 받아왔다. 통상의 유기 발색단(chromophore), 형광 단백질과 비교하면, 사이즈에 따른 스펙트럼 변화(즉, 사이즈 변화에 따라 다른 파장의 빛을 방출하는 특성), 개선된 휘도, 광 표백(photo bleaching)에 대한 우수한 안정성, 동시 다중 형광 여기 등과 같은 특유의 유용한 광학 특성을 갖고 있다. 또한, 양자점의 넓은 흡수 스펙트럼 및 좁은 방출 스펙트럼으로 인하여 FRET 현상을 기반으로 하는 바이오센서 또는 진단 시스템 내에서 도너(donor) 또는 어셉터(acceptor)로서 적합한 특성을 갖고 있다. 이러한 양자점은 미국특허 제6,207,392호를 비롯한 다수의 문헌에 개시되어 있으며, 상기 선행문헌은 본 발명의 참고문헌으로서 포함된다.

한편, FRET 현상은 2가지 형광 물질의 상호작용을 이용한 것으로, 1964년 Forster에 의하여 처음 소개되었다. FRET 현상은 장거리 쌍극자-쌍극자 상호작용에 의하여 하나의 여기된 형광분자에서 다른 형광 분자로 비복사 과정을 통해 에너지가 전이되는 물리적인 현상이다. 이때 에너지를 주는 분자를 "도너 또는 공여체(Doner; D)"라 하고, 에너지를 받는 분자를 "어셉터 또는 수용체(Acceptor; A)"라고 한다.

특정 파장대의 빛을 방출하는 형광 물질인 도너와 도너로부터 방출되는 에너지와 공명을 일으켜 에너지를 흡수할 수 있는 형광 물질인 어셉터가 소정의 거리 이내로 근접하면, 외부에서 도너를 여기시키기 위하여 조사된 빛 에너지가 도너로부터 어셉터로 비복사 전이되어 도너의 고유 파장대의 발광이 감소하고, 도너로부터 에너지를 전달받은 어셉터의 고유 파장대의 빛이 방출된다. 따라서, 어셉터가 Fㆆrster 반경 이내에 존재하는 경우, 도너의 방출 강도는 감소한다.

FRET 현상은 통상 대부분의 생물 내 매크로 분자의 치수(dimension)에 상당하는 약 10 내지 100Å 범위에서 일어나기 때문에 생물 분자 연구로의 응용과 관련하여 많은 관심을 받고 있다. 도너와 어셉터 간의 국지적 거리에 의존하는 FRET 효율은 바이오물질의 검출에 응용될 수 있다.

예를 들면, 미국특허공개번호 제2007/0166743호는 양자점을 이용한 FRET-기반 핵산의 검출 방법을 개시하고 있는 바, 구체적으로는 양자점과 검출 가능한 라벨로 핵산을 라벨링한 다음, 상기 양자점과 검출가능한 라벨로부터의 발생하는 FRET 시그널을 측정하여 핵산의 특성을 검출하는 원리를 채택하고 있다.

또한, 국내특허번호 제704011호는 에너지 어셉터(수용체)로서 금속나노입자를 사용하고, 에너지 도너(공여체)로서 양자점을 사용하여 특이결합하는 한 쌍의 생체분자(제1 생체분자 및 제2 생체분자)를 상기 금속나노입자 및 양자점에 각각 부착하여 제1 생체분자부착-금속나노입자 및 제2 생체분자부착-양자점을 액상 혼합하여 형광분석법을 이용하여 FRET 현상 유무에 따라 제1 생체분자부착-금속나노입자 및 제2 생체분자부착-양자점의 특이결합성 여부를 확인한 다음, 제1 생체분자부착-금속나노입자 및 제2 생체분자부착-양자점을 제1 생체분자와 제2 생체분자와의 특이결합을 저해하는 표적분자가 함유된 검체와 혼합하여 FRET 확인함으로써 검체 내 표적분자를 정량 분석하는 방법을 개시하고 있다.

최근에 보고된 양자점을 이용한 FRET 기반 센서 관련 기술로서, siRNA 서열을 스크리닝하기 위한 양자점-접합된(conjugated) 혼성화 프로브, 고감도 DNA 나노센서, DNA-양자점 접합에 기반하는 뉴클레아제 내성(nuclease tolerant) FRET 프로브 등이 있다. 상술한 바와 같이 양자점을 이용한 FRET 기반 센서의 다수는 단백질-양자점 접합체(conjugates) 또는 스트렙타비딘(Streptavidin)-양자점 시스템을 사용하고 있다. 생접합(bioconjugation)의 경우, 몇몇 시도에서는 비특이적 흡착, 정전기적 상호작용 및 공유 결합과 같이, 생분자를 양자점에 접합시키는데 성공한 바 있다.

그러나, 올리고뉴클레오티드및 다양한 혈청 알부민과 같은 간단하고 작은 분자들의 경우에는 수용성 양자점의 표면에 쉽게 흡착된다. 이러한 흡착 현상은 비특이적이고, 이온 세기, pH, 온도 및 분자의 표면 전하에 의존한다. 정전기적 상호작용은 통상 생물학적인 복잡한 환경에서는 적합하지 않다.

현재, 양자점-생분자의 접합(QD-bioconjugation)을 위하여 다양한 방법이 제시되고 있는 바, 대표적으로는 다음과 같다.

(1) 카르보디이미드(carbodiimide) 중간물질을 사용하여 양자점(QD)의 표면과 생분자의 아민기 또는 카르복실기를 결합시킨다(cross-linking chemistry 방법).

(2) 바이오틴-아비딘 상호작용(biotin-avidin interaction)을 이용하는 방법으로, 예를 들면 국내특허번호 제904825호에 개시되어 있다. 그러나, 아비딘/스트렙타비딘(avidin/streptavidin) 또는 바이오틴 작용기를 갖는(biotin-functionalized) 양자점의 사용이 요구되고, 또한 종종 큰 사이즈의 생접합체가 생성된다. 따라서, FRET 분석 및 셀 분석(cellular assay)과 같은 타겟 응용분야에 있어서 그 사용이 제한될 수 있다.

한편, 양자점을 이용한 FRET 현상을 기반으로 각종 질병 또는 질환을 진단할 수 있는 DNA-나노센서는 PCR과 같은 별도의 증폭 과정 없이 표적 유전자를 검출할 수 있는 장점을 갖고 있는 바, 최근 보고된 관련 기술은 다음과 같다.

Zhang et al.는 종래의 유기 FRET 프로브로는 달성하기 어려운 낮은 레벨의 배경 형광 특성을 나타내는, 무기/유기 하이브리드 FRET 나노센서 시스템의 개발을 보고한 바 있다(Zhang et al., Single-quantum-dot-based DNA Nanosensor, Nature Materials, Vol. 4, 826-831 (2005)). 상기 논문에 따르면, DNA 나노센서는 스트렙타비딘으로 접합된 양자점, 및 2개의 표적-특이성 올리고뉴클레오티드 프로브(형광체로 라벨링된 리포터 프로브 및 바이오틴으로 라벨링된 캡쳐 프로브)로 이루어져 있다. 이때, 표적 DNA의 가닥(strand)은 리포터 프로브 및 캡쳐 프로브와 샌드위치된 하이브리드를 형성하고, 스트렙토비딘-접합된 양자점에 상기 갭쳐 프로브가 연결되어 FRET 도너-어셉터 앙상블을 형성하게 된다.

그러나, 상기 문헌을 비롯한 대부분의 종래기술들의 경우, 도너인 양자점에 접합시키기에 앞서 대부분 표적 유전물질(예를 들면, DNA)을 먼저 염료 또는 다이(dye)로 라벨링할 것을 요구할 뿐만 아니라, 경우에 따라서는 복수의 프로브를 사전에 제조하거나 접합에 앞서 표적 물질 및 양자점에 각각 바이오틴 처리 및 스트렙타비딘 처리를 수반하기 때문에 절차가 상대적으로 복잡하다.

따라서, 보다 간편하면서도 신속하게 표적 물질을 검출할 수 있는 형광공명에너지전이-기반 나노센서 시스템에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명자들은 지속적으로 연구를 진행한 결과, 상술한 종래기술의 한계를 극복할 수 있는 형광공명에너지전이-기반 나노센서 시스템을 개발하게 된 것이다.

따라서, 본 발명은 표적 유전물질에 대한 라벨링 필요성이 없고 소량의 샘플을 사용하는 경우에도 표적 핵산(또는 유전물질)에 대한 감도가 우수한 형광공명에너지전이-기반 나노센서 시스템을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상술한 나노센서 시스템을 이용하여 표적 핵산(또는 유전물질)을 검출하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 제1 구체예에 따르면,

양자점; 및

상기 양자점의 표면에 연결되고, 표적 핵산에 대한 상보적(complementary) 염기 서열의 올리고뉴클레오티드를 갖는 생접합된 양자점-프로브를 포함하며,

상기 표적 핵산과 상기 생접합된 양자점-프로브의 혼성화(hybridization)에 의하여 삽입되는 색소(intercalating dye)가 상기 양자점과 형광공명에너지전이(FRET)를 발생시키고,

상기 표적 DNA는 라벨링되지 않은 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 형광공명에너지전이-기반 나노센서 시스템이 제공된다.

본 발명의 제2 구체예에 따르면,

a) 양자점을 제공하는 단계;

b) 표적 핵산에 대한 상보적 염기서열의 올리고뉴클레이티드가 구비된 프로브를 상기 양자점의 표면에 연결하여 생접합된 양자점-프로브를 형성하는 단계; 및

c) 삽입 색소(intercalating dye)의 존재 하에서 상기 표적 핵산과 상기 생접합된 양자점-프로브를 혼성화하는 단계;

를 포함하며,

상기 삽입 색소는 혼성화에 의하여 상기 양자점과 형광공명에너지전이(FRET)를 발생시키고,

상기 표적 DNA는 라벨링되지 않은 것을 특징으로 하는 핵산의 검출 방법이 제공된다.

본 발명에 따른 형광공명에너지전이-기반 나노센서 시스템 및 핵산의 검출방법은 종래에 알려진 FRET-기반 나노센서 기술과 달리 표적 핵산(또는 유전자)를 라벨링하는 과정을 수반하지 않기 때문에 한층 간편할 뿐만 아니라, 낮은 농도의 표적 핵산에 대하여도 높은 감도 특성을 나타내는 장점을 갖는다. 따라서, 향후 광범위한 상용화가 기대된다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 예시된 FRET-기반 나노센서 시스템의 원리를 개략적으로 도시하는 도면이고;
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 사용된 양자점의 광물리적 특성을 나타내는 흡수 및 방출 스펙트럼이고;
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 사용된 삽입 색소(dsDNA에 결합되었을 때)인 PI의 광물리적 특성을 나타내는 흡수 및 방출 스펙트럼이고;
도 4는 본 발명의 실시예 1에 있어서, 혼성화 과정 중 양자점 및 표적 핵산의 농도를 각각 8 μM 및 100 μM으로 일정하게 유지하면서 PI의 농도를 0 내지 20 ㎎/㎕ 범위에서 변화시킨 경우에 얻어지는 형광 스펙트럼이고;
도 5는 본 발명의 실시예 1에 있어서, 혼성화 과정 중 PI의 농도(2 ㎎/㎕) 및 양자점의 농도(8 μM)를 고정하면서 표적 핵산의 농도를 20 내지 100 μM 범위에서 변화시킨 경우에 얻어지는 형광 스펙트럼이고; 그리고
도 6은 본 발명의 실시예 2에 따라, 2% 아가로즈 겔(agarose gel) 상에서 전기영동 실험을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.

본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 FRET-기반 나노센서 시스템은 생접합된 양자점 프로브(bioconjugated quantum dot probe)의 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산의 혼성화(hybridization)에 의하여 이중 가닥(나선 구조) 내로 삽입된 색소 어셉터(dye acceptor)와 양자점 도너 사이에 발생하는 FRET 현상을 기반으로 한다.

구체적으로, 검출하고자 하는 표적 핵산에 대하여 상보적 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레이티드를 프로브(probe)로 사용하고, 이를 양자점에 접합시켜 생접합된 양자점-프로브를 제조한다. 그 다음, 삽입 색소 또는 염료(intercalating dye)의 존재 하에서 상기 표적 핵산과 상기 양자점-프로브의 올리고뉴클레오티드를 혼성화할 경우, 상기 삽입 색소는 혼성화된 이중 가닥(double strand) 사이에 삽입된다.

이와 같이, 혼성화에 의하여, 비로소 도너인 양자점과 어셉터인 삽입 색소 간의 거리가 감소하여 FRET 현상이 발생하게 된다. 구체적으로, 샘플에 생접합된 양자점 프로브의 올리고뉴클레오티드에 대한 상보적 염기서열을 포함하는 표적 핵산이 존재할 경우, 혼성화에 의하여 발생하는 FRET 형광을 검출함으로써 표적 핵산을 특이적으로 검출할 수 있게 된다. 이때, 주목할 점은 표적 핵산에 대한 별도의 라벨링(labeling)을 요하지 않으며, 높은 FRET 효율을 달성할 수 있기 때문에 낮은 농도의 표적 핵산을 함유하는 샘플에 대하여도 검출이 용이하다. 특히, 생접합(bioconjugation)에 앞서 색소 또는 염료로 표적 DNA(이중 가닥)을 라벨링한 다음, 이를 양자점에 접합시켜 FRET 형광을 검출하는 종래 기술과에 비하여 보다 간편할 뿐만 아니라 별도의 증폭 과정이 필요 없다.

양자점

본 발명에 있어서, 양자점은 단일 타입의 물질 또는 다른 타입 물질의 코어 및 쉘(또는 캡)으로 이루어질 수 있는 바, 양자점의 형광 특성이 중요한 고려 사항인 만큼, 코어(core)/쉘(shell) 구조의 양자점을 사용하는 것이 바람직하다.

양자점은 표면적 대 부피 비율이 대단히 커서 구성 원자들의 대부분이 표면에 노출되므로 원자 또는 분자 궤도가 완전히 결합되지 않는 형태로 남게 되고 이는 양자점의 형광을 소광하는 결함부위로 작용할 수 있다. 이 때문에 보다 넓은 띠 간격을 갖는 다른 반도체의 셸(shell)을 코어(core)표면에 성장시켜 전자 절연효과를 얻는다. 더욱이, 쉘은 여기된 코어에 의하여 방출되는 형광을 안정화하고 강화시키는 역할을 하며, 바람직하게는 코어보다 높은 밴드 갭을 갖도록 하여 코어를 부동태화(passivation)함으로써 양자점의 여기가 코어로 한정되도록 하고 산화로부터 보호할 뿐만 아니라, Cd/Se이 주변 용액 내로 용출(leeching)되는 것을 방지한다. 본 발명에 따르면, 바람직하게는 CdSe(코어)/ZnS(쉘) 구조의 양자점을 사용할 수 있는데, 얇은 ZnS(1∼2 모노레이어)에서 종종 가장 높은 PL 수율(yield)을 얻을 수 있으며, 두꺼운 ZnS(4∼6 모노레이어)에서는 산화로부터 코얼를 보다 잘 보호할 수 있으며, 생물학적 가혹 환경(예를 들면, 산성 완충용액 등)에서도 잘 견딜 수 있다.

이처럼, 양자점은 통상의 형광 유기염료와 비교하여 다음과 같은 장점을 갖는다.

(1) 양자점은 같은 여기 광자 플럭스(excitation photon flux)에서 유기염료보다 약 10 내지 50배 정도 더 많은 광자를 흡수할 수 있다.

(2) 양자점은 유기염료보다 광표백(photo bleaching)에 대하여 수천배 이상의 내성을 갖고 있고, 장시간 추적 연구를 지속하는데 적합하다.

(3) 양자점의 스토크 편이(Stokes shifts; 여기와 방출 피크 사이의 거리에서 측정됨)의 큰 차이는 탐측 감도를 더욱 향상시키는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 양자점의 사이즈는 전형적으로는 약 0.5 내지 50㎚, 보다 전형적으로는 약 1 내지 40 ㎚, 특히 전형적으로는 약 1 내지 20 ㎚ 범위이며, 가장 바람직하게는 약 1 내지 10 ㎚ 범위로 정할 수 있다. 직경이 지나치게 작거나 큰 경우에는 안정성 저하에 따라 광 방출 특성을 구현하기 곤란하거나, 원하는 파장대의 빛을 방출하기 어려울 수 있으므로, 상술한 범위 내에서 적절히 조절하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 코어가 3 ㎚ CdSe인 양자점은 520㎚ 광을 방출하는 한편 코어가 5.5 ㎚ CdSe인 양자점은 630 ㎚ 광을 방출하며, 발광 폭(emission width)는 사이즈 분포에 의하여 영향을 받는다. 또한, 양자점의 형상은 특별히 제한되는 것은 아니며, 구, 로드, 와이어, 피라미드, 입방체 등 다양한 형상을 가질 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 양자점은 Ⅱ-Ⅵ족 반도체 화합물(예를 들면, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgTe, 또는 이들의 조합물), Ⅲ-Ⅴ족 반도체 화합물(예를 들면, GaAs, InGaAs, InP, InAs, 또는 이들의 조합물) 또는 Ⅳ족 반도체 화합물(예를 들면, Ge 또는 Si)일 수 있다. 보다 바람직하게는, Ⅱ-Ⅵ족 반도체 화합물로서 CdS, CdSe, CdTe, ZnS, ZnSe, ZnTe 또는 CdSeTe을, 그리고 Ⅲ-Ⅴ족 반도체 화합물로서 InP, GaP 또는 InAs를 사용할 수 있다. 예를 들면, 코어가 CdSe으로 이루어지는 경우에는 가시광선 영역의 빛을 방출하는 한편, InAs으로 이루어지는 경우에는 근적외선 영역의 빛을 방출한다.

양자점은 공지된 방법, 예를 들면 미국특허번호 제6,207,392호 등에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이와 관련하여, 대표적인 CdSe 양자점의 예시적인 합성과정을 간략하게 설명하면, Se 전구체(Se의 착화합물, 산화물, 금속 등; 통상 trioctylphosphine selenide 또는 tributylphosphine-selenide)를 Cd 전구체(Cd의 착화합물, 산화물, 금속 등; 통상 dimethyl cadmium 또는 cadmium oleate)와 배위 리간드(trioctylphosphine oxide와 같은 탄소수 5 내지 20의 알킬포스핀 또는 hexadecylamine과 같은 탄소수 5 내지 20의 알킬아민)를 함유한 뜨거운 용액(예를 들면, 약 300℃)에 천천히 주입하면 CdSe 나노결정 코어가 생성된다. 배위 리간드는 성장하는 결정의 표면에 있는 금속이온에 결합하여 용액 중에서 결정을 안정화시키고 성장속도를 조절하는 역할을 한다. 양자점이 원하는 사이즈에 도달하면 온도를 실온으로 낮추어 성장을 중지시킨다.

또한, 쉘, 예를 들면 ZnS 쉘의 경우, 당업계에서 알려진 방식에 따라 상기 코어의 표면에 성장시킬 수 있는 바, 양자점의 쉘 형성 방법은, 예를 들면, 미국특허출원번호 제08/969,302호 등에 예시되어 있다. 쉘 형성 과정 중 코어의 흡수 스펙트럼을 모니터링하면서 반응 혼합물의 온도를 조절함으로써 높은 방출 양자 효율 및 좁은 사이즈 분포를 갖는 쉘을 형성하는 것이 바람직하다.

본 발명의 보다 바람직한 구체예에 있어서, 양자점은 히드록시기(-OH), 카르복실기(-COOH), 아민기(-NH₂), 티올기(-SH) 등의 친수성 작용기로 캡슐화 또는 표면 개질(modification)됨으로써 수용성(water-soluble) 특성을 갖도록 할 수 있다. 이는 대표적으로 사용되는 CdSe 양자점이 전술한 바와 같이 유기 용매 내에서 합성되어 트리오틸포스핀 옥사이드(TOPO), 트리옥틸포스핀(TOP), 테트라데실포스폰산(TDPA) 등의 소수성 표면 리간드를 갖는 점을 고려한 것이다.

양자점의 친수화 방법으로서 하기에서 예시되는 방식을 사용할 수 있다:

(1) 리간드 교환

양자점 표면 상의 소수성 리간드를 수용성 양작용성(bifunctional) 분자로 치환할 수 있는데, 그 결과 일 단부는 양자점 표면 원자에 연결되는 한편, 다른 단부는 친수성이면서 또는 생분자(예를 들면, 핵산)에 반응성을 가질 수 있다. 이러한 수용성 이작용성 분자의 대표적인 예로는 화학식 [HS-(CH₂)_n-COOH(n은 1 내지 15)으로 표시되는 머캡토카르본산(mercapto carbonic acid), 2-아미노에탄에티올, 디하이드로리포산(dihydrolipoic acid), DTT(dithiothreitol) 등이 있다.

(2) 소수성 상호작용

긴 사슬의 양친화성 고분자를 사용하여 미셀과 같은 구조를 형성하는 방법이 있다. 예를 들면, 폴리아크릴산을 EDC-커플링을 통하여 옥틸아민으로 부분 그래프팅시켜 양친화성화한 다음, 미셀과 유사한 구조를 형성한다. 이때, 소수성 양자점은 캡슐화되고 -COOH가 외부로 향하게 된다. 안정성 및 수용성을 더욱 향상시키기 위하여, 몇몇 카르복실기는 EDC-커플링을 통하여 아미노-말단 폴리에틸렌글리콜(PEG) 분자에 의하여 추가적으로 그래프팅될 수 있다. 이러한 방법은 양자점 표면 원자와 직접적인 상호작용을 하지 않기 때문에 양자점의 본래 양자 효율을 유지할 수 있고, 고분자의 많은 소수성 측쇄로 인하여 소수성 상호작용이 강화되어 보다 안정적인 수용성 양자점을 얻을 수 있는 장점을 갖는다. 특히, PEG 등을 도입할 경우, 수용성 양자점의 안정성이 증가하고 타겟팅(targeting)에 효과적일 수 있다.

(3) 실리카 캡슐화

양자점은 실리카 층에 의하여 캡슐화됨으로써 생호환성(biocompatible)을 가질 수 있다. -NH₂ 또는 -SH를 갖는 작용성 유기실리콘 분자가 쉘 내로 혼입되어 생물학적 응용에 적합한 표면 작용기들을 제공한다.

본 발명이 비록 전술한 특정 친수화 표면 개질 방법으로 반드시 한정되는 것은 아니며, 경우에 따라서는 상용화된 제품, 예를 들면 Invitrogen사의 Qdot^®시리즈와 eBioscience사의 eFluor™ Nanocrystals 시리즈를 구입하여 본 발명에 적용할 수도 있다.

올리고뉴클레오티드( oligonucleotide ) 및 표적 핵산( target nucleic acid )

본 명세서에 있어서, "올리고뉴클레오티드"는 단일 사슬 뉴클레오티드 다량체(multimer)를 의미하는데, 전형적으로 약 10 내지 100개의 뉴클레오티드, 경우에 따라서는 수백 개(예를 들면, 200 내지 300개)의 뉴클레오티드로 이루어질 수도 있다.

또한, "핵산"은 유기 염기(사이토신, 티미딘 또는 우라실과 같은 치환된 피리미딘이거나 아덴 또는 구아닌과 같은 치환된 퓨린)에 연결된 당으로 이루어지는 복수의 뉴클레오티드를 의미할 수도 있다. 즉, 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 펩티드 핵산(PNA), 메틸포스포네이트 핵산, S-올리고, c-DNA, cRNA, miRNA, siRNA, 압타머(aptamer) 등을 예시할 수 있고, 천연적으로 발생하거나 인공적으로 합성된 것 모두 포함하는 개념일 수 있다.

이와 관련하여, "표적 핵산"은 수개, 수백 개, 수천 개 또는 수백만 개의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있으며, 또한 DNA, RNA 등의 절편(fragment)도 해당될 수 있다. 이러한 표적 핵산(또는 이의 절편)의 염기 서열은 프로브에 존재하는 올리고뉴클레오티드의 염기 서열과 상보적 관계를 갖고 있어 혼성화될 수 있다.

본 명세서에 있어서, "상보적"이라는 용어는 뉴클레오티드 또는 핵산 사이의 염기쌍을 혼성화할 수 있는 것을 의미하며, 통상 A와 T(또는 U), 또는 C와 G이다. 또한, "프로브"라는 용어는 표적 핵산 내에 함유된 특정 염기 서열과 상보적 염기 서열을 포함하고 있어, 적절한 조건 하에서 혼성화될 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 나노센서 시스템은 특정 표적 핵산으로 그 응용이 한정되는 것은 아니며, 예를 들면, 선천성 부신과형성증, 신원발성 요붕증, 안드로젠 내성 증후군, 알포트 증후군, 윌슨병, 주버트 증후군, 중증근무력증, 중증합병 면역 결핍증 지중해빈현, 카나반병, 투렛증후군, 파브리병, 페닐케톤뇨증, 헌팅턴병, 혈우병 A형, B형, 후를러증후군과 같은 다양한 유전병 관련된 유전자 등의 검출(detection)에 적용 가능하다. 또한, hepatitis B virus 유전자와 그 돌연변이를 검출하거나, 포유류 세포에서 RNAi 대한 상당히 효과적인 siRNA 서열의 사전 선별시 간편하고 신속한 작업을 가능하게 한다.

특히 유용하게는, 인체 악성 종양억제 유전자인 human p53 유전자(gene)의 검출에 적용할 수 있다. 일반적으로, 종양 억제 유전자(Tumor-suppressor gene)는 정상적인 세포에서 무분별한 세포의 분열 및 성장을 억제하는 기능을 갖는 유전자로서 암의 발생에서 중요한 역할을 한다. 가장 대표적인 종양억제유전자인 Human p53 gene으로부터 발현된 p53 단백질은 P21 유전자를 활성화한다. p21 단백질은 세포 주기를 조절하는 단백질인 cyclin의 작용을 방해하고 DNA 손상이 회복될 때까지 세포주기를 동결시킨다. 그러나 p53에 돌연변이가 일어나게 되면 p21이 생성되지 않으며, 세포의 계속적인 성장과 분열이 정지되지 않아서, 결국 암이 발생하게 되는 것이다.

본 발명에 따른 나노센서의 응용에 있어서, 상기 p53 유전자 내에 존재하는 특정 염기 서열(표적 핵산)에 상보성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 프로브를 구성할 수 있다. 이때, 상기 표적 핵산은 종래기술과 달리 형광 색소 등으로 라벨링할 것을 요하지 않는다.

삽입 색소(intercalating dye)

삽입 색소는 DNA 이중 나선의 주된 홈(major groove)에 결합하는 성질을 가지고 있다. 일반적으로 충분한 형광 신호를 얻기 위하여는 색소 농도를 높이는 것이 요구될 수 있는데, 그 과정에서 비특이적 결합(non-specific binding)이 발생하여 검출 선택성이 저하될 수 있다. 이에 대하여, 본 발명은 양자점과 삽입 색소 간의 FRET 현상을 이용하여 적은 량의 삽입 색소로도 높은 형광 신호를 유도함으로써 표적 핵산을 효과적으로 검출할 수 있다. 특히, 상보적 염기 서열을 갖는 생접합된 양자점-프로브의 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산이 삽입 색소의 존재 하에서 혼성화되면서 형성되는 이중 가닥(나선) 내로 삽입 색소가 끼어들어 도너인 양자점과 FRET 현상을 발생시키는데 적합한 거리에 존재하게 된다. 이와 같이, 본 발명에서는 혼성화 과정에서 이중 가닥 내로 삽입 가능한 색소를 사용할 수 있으며, 대표적으로는 프로포디움 이오다이드(propodium iodide; PI), EtBr(etrium bromide), SYBR Green, PicoGreen, Hoechst 시리즈(series), BOBO, TOTO, YOYO, JOJO, POPO, LOLO, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, LO-PRO, SYTO 시리즈 등이 있다. 상기 삽입색소는 양자점의 파장에 따라 적절하게 선택될 수 있다.

생접합(bioconjugation)

본 발명에 있어서, 프로브용 올리고뉴클레오티드를 양자점에 연결하여 생접합된 양자점-프로브를 제조한다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 링커(linker)를 사용하여 양자점의 표면에 올리고뉴클레오티드를 접합할 수 있다. 이때, "링커"는 양자점과 올리고뉴클레오티드 사이에서 공유 또는 비공유 결합에 의한 연결할 수 있는 화합물을 의미할 수 있는데, 예를 들면 양자점 표면의 C, N, S, O 등과 같은 원자에 결합 또는 부착될 수 있다. 링커를 통한 생접합 방법의 일반적인 내용은 당업계에 알려져 있는 바, 상기 생접합 방법은 링커와 올리고뉴클레오티드(프로브)의 조성에 따라 정하여질 수 있다. 이때, 링커는 아미노기, 카르복시기, 옥소기 또는 티올기와 같은 작용기(functional group)를 갖는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 티올기를 갖는 링커를 사용할 수 있는 바, 먼저 티오-알코올로 인큐베이션(incubation)하여 티올-수식 올리고뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 상기 링커는 탄소수 3 내지 10의 알킬 체인을 포함할 수 있는데, 이러한 링커의 길이는 Fㆆrster 거리를 고려하여 정할 수 있으며, 특히 C₆-티올 링커(티오-알코올로서 C₆ 머캡토헥산올을 사용함)가 바람직하다.

상술한 바와 같이, 티올-링커에 관한 구체적인 사항은 Loweth 등의 논문(Angew. Chem. Int. Edit. 38: 1808-12 (1999))에 기술되어 있는 바, 상기 문헌은 본 발명의 참고자료로서 포함된다. 티오-알코올 및 올리고뉴클레오티드는 용액 내 올리고뉴클레오티드의 농도가 약 100 μM 이하가 되도록 사용량을 정하는 것이 바람직하며, 인큐베이션 동안 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 티오-알코올의 히드록시기와 공유 결합된다.

그 다음, 티올-수식된 올리고뉴클레오티드와 양자점을 접촉시켜 티올기의 황 원자와 양자점 표면이 결합될 수 있도록 한다. 이를 위하여, 바람직하게는 인산염 완충용액(예를 들면, 약 0.1 M의 농도) 내에서 생접합할 수 있다. 그 결과, 링커로 말단(양자점의 표면 방향의 말단)이 수식된 올리고뉴클레오티드를 양자점에 직접 연결 또는 부착시켜 양자점-프로브를 제작할 수 있는 것이다.

이와 관련하여, 상술한 방법은 종래에 무기물 또는 금속의 표면에 생분자를 접합하는 방법을 적용하는 경우에 비하여 보다 유리하다. 그 이유는 종래의 대표적인 생접합 방식, 즉 생분자의 말단에 바이오틴(biotin)을 부착하고, 무기물 또는 금속의 표면에 아비딘 또는 스트렙타비딘과 같은 단백질을 코팅하여 바이오틴과 아비딘 간의 강력한 결합력을 이용하는 방법이 생분자 및 양자점 모두를 표면 처리 또는 개질(수식)하는 번거로움을 야기할 수 있기 때문이다.

더욱이, 바이오틴과 스트렙타비딘을 이용할 경우에 안정된 생접합을 확보할 수는 있으나, 양자점과 타겟 바이오 물질에 각각 바이오틴과 스트렙타비딘을 연결하는 작업이 필수적으로 수행되어야 하기 때문에 시간 및 비용 면에서 불리할 수 있다.

혼성화

본 발명의 구체예에 따르면, 생접합된 양자점-프로브의 올리고뉴클레오티드는 삽입 색소의 존재 하에서 표적 핵산과 상보적 염기 서열에 따른 결합을 하게 된다. 혼성화에 관한 일반적인 개념은 당업자에게 알려져 있는 바, 예를 들면 미국특허번호 제4,647,529호 등의 다수 문헌에 기술되어 있다.

본 발명에 있어서, 이중 가닥으로 이루어진 표적 핵산(예를 들면, DNA)을 검출하고자 하는 경우에는 이중 가닥을 분리하기 위한 처리가 요구될 수도 있다. 이러한 이중 가닥의 분리는 가닥을 분리하는데 충분히 긴 시간 및 온도 조건 하에서 가열함으로써 달성될 수 있다. 이를 위하여, 예를 들면, 약 90 내지 95℃의 온도에서 약 5 내지 10분 동안 가열할 수 있다. 필요하다면, 변성제(denaturing agent)를 사용할 수도 있으며, 이때 혼성화 및 변성화는 적절한 온도 조건 하에서 동시에 일어날 수도 있을 것이다.

본 발명에 있어서, 혼성화는 염을 함유하지 않은 용액 내에서 실시할 수 있으나, 경우에 따라서는 염의 존재 하에서 수행될 수 있는 바, 이 경우 염의 농도는 전형적으로 약 500 mM 이하, 보다 전형적으로는 약 200 mM 이하, 특히 전형적으로 100 mM의 NaCl을 사용할 수 있다.

혼성화 온도는 상보적인 가닥의 길이 등에 따라 영향을 받을 수 있는데, 긴 가닥의 경우에는 보다 높은 혼성화 온도에서 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 혼성화 온도는 전형적으로 약 22℃ 이상, 보다 전형적으로는 약 30℃ 이상일 수 있다.

혼성화를 위한 인큐베이션 시간은 특별히 한정되는 것은 아니나, 통상적으로 대략 약 1시간 내이면 혼성화 반응이 충분히 이루어질 수 있다. 또한, 생접합된 양자점-프로브 : 표적 핵산의 몰 비는, 예를 들면 약 1 : 2 내지 약 1 : 100, 보다 전형적으로는 약 1 : 10 내지 약 1: 100 정도의 범위에서 표적핵산의 농도에 따른 형광의 강도를 확인할 수 있으나, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 다만, 표적 핵산이 생접합된 양자점-프로브에 비하여 지나치게 많은 량으로 존재할 경우, FRET의 형광 강도에 따른 감도 특성이 낮아질 수 있다.

또한, 생접합된 양자점-프로브와 삽입 색소 간의 사용량 비율, 표적 핵산과 삽입 색소의 사용비는 양자점-프로브의 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 간의 혼성화가 이루어지지 않는 이상 삽입 색소량과 표적 핵산량이 FRET의 형광 강도에는 영향을 미치지 못할 것이나, 혼성화에 의하여 삽입되는 색소의 량이 증가할수록 형광강도 역시 증가할 것이다. 본 발명이 특정 삽입 색소의 사용량 및 표적 핵산량으로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 삽입 색소의 사용량은 전형적으로 약 20 ㎎/㎕ 이하, 보다 전형적으로는 약 2 내지 10 ㎎/㎕ 범위일 수 있으며, 또한 표적 핵산량은 전형적으로 약 100 μM 이하, 보다 전형적으로는 약 20 내지 100 μM의 양일 수 있다.

한편, 혼성화 후에는 선택적으로 후처리 단계를 수행할 수 있는 바, 예를 들면 세정 완충용액(buffer)을 사용한 일련의 세척 과정을 통하여 비혼성화된 양자점-프로브를 제거할 수 있다. 이러한 세정 완충용액으로는, 예를 들면 염화나트륨 완충용액(약 0.3M), 시트르산나트륨 완충용액(약 0.03M), PBS(phosphate buffered saline) 등을 들 수 있다.

형광 검출

본 발명에 따르면, 상술한 바와 같이 혼성화 과정에서 발생하는 FRET 형광은 당업계에서 공지의 방법(예를 들면, 형광분석법)에 따라 검출하여 분석될 수 있다. 이러한 검출 방법이 특정 장치로 한정되는 것은 아니지만, 예시적으로는 유세포분석기(Flow cytometry) 등을 사용할 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 명확히 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적에 불과하며 발명의 영역을 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 예시된 FRET-기반 나노센서 시스템의 원리를 개략적으로 도시하는 도면이다.

도시된 바와 같이, 본 실시예에서는 p53 유전자 중 Exon 7의 염기서열을 통하여 프로브 및 표적 핵산(뉴클레오티드)을 설정하고 제작한다. 또한, 카르복실화 양자점(carboxyl-functionalized quantum dot)을 티올-수식(thiolated) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 접합시킨다. 그 다음, 생접합된 양자점 프로브를 표적 핵산과 혼성화하고, 혼성화 과정 중 이중 가닥 사이에 염료를 삽입시킨다. 혼성화에 의하여 양자점(도너)과 삽입 염료(어셉터) 간의 거리는 감소하고, 그 결과 높은 효율의 FRET 현상이 유도된다.

본 실시예에 있어서, 사용 물질 및 측정장치는 다음과 같다.

양자점

카르복실 양자점의 붕산염 완충 용액(Qdot^ㄾITK^™)을 Invitrogen사(뉴욕)로부터 구입하였다(직경은 약 10 내지 20㎚ 수준). 도 2는 본 실시예에서 사용된 양자점의 광물리적 특성을 나타내는 흡수 및 방출 스펙트럼이다. 상기 도면에 따르면, 카르복실화 양자점은 FWHM(full width at half maximum)이 30㎚로서 좁은 방출 특성을 나타내었으며, 최대 피크는 525㎚에서 발견되었다.

삽입 색소

삽입 색소는 BioVision(미국, 캘리포니아)로부터 플로피디움 이오다이드(propidium iodide; PI, Ex=525㎚, Em=617㎚)를 구입하였다. 또한, 바이오니어(Bioneer; 대한민국, 대전)로부터 EtBr를 구입하였다. 도 3은 본 실시예에서 사용된 삽입 색소(dsDNA에 결합되었을 때)인 PI의 광물리적 특성을 나타내는 흡수 및 방출 스펙트럼이다. 상기 도면에 따르면, PI의 최대 흡수 파장은 495㎚이었으며, 최대 형광 방출은 625㎚에서 발견되었다.

상기 양자점과의 관계에서, 양자점의 방출 대역은 삽입 색소의 흡수 스펙트럼과 중첩되고, 삽입 색소의 최대 방출 대역이 양자점의 최대 방출 대역과는 멀리 떨어져 있다는 것은 양자점 도너와 삽입 색소 어셉터 간에 효율적인 FRET 효과가 얻어질 수 있음을 의미한다.

완충용액

붕산염(borate) 완충용액(pH 4)은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였으며, 인산염 완충용액(pH 7)은 Across Organic(미국, 뉴저지)으로부터 구입하였다. 모든 완충용액은 고압멸균된(autoclaved) 이중 증류수(double distillated water)를 사용하여 제조되었으며, 0.2㎛ 시린지 필터에 의한 필터링을 거친 후에 사용되었다.

표적 핵산 및 프로브의 올리고뉴클레오티드

p53 유전자는 20kb의 크기를 갖는 유전자로서 11개의 exon으로 이루어져 있는 바, Human p53 암 억제 유전자 서열이 가장 작은 exon 7에 대한 염기 서열을 National Center or Biotechnology Information의 BLAST로부터 입수하였다. 티올기로 수식된 올리고뉴클레오티드(exon 7과 상보적 염기서열을 가짐)를 바이오니어사에 의뢰하여 제조하였다. 상기 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산에 상당하는 올리고뉴클레오티드의 염기 서열은 각각 하기 표 1 및 2와 같았다.

올리고뉴클레오티드^*	염기서열
티올-수식 올리고뉴클레오티드	5'-HS-(CH₂)₆-GTGTTGTCTCCTAGGTTGGCTCTG-3'

*T_m=57.9℃

표적 핵산	염기서열
올리고뉴클레오티드	5'-CAGAGCCAACCTAGGAGACAACAC-3'

측정장치

흡수 스펙트럼은 UV-Vis 스펙트로포토메터(agilent Technology)를 사용하여 측정하였으며, 광 발광 스펙트럼은 QuantaMaster PTI 스펙트로프루오로메터(Photon Technology International, Birmingham, NJ, USA)를 사용하여 측정하였다. 여기 파장은 450㎚이었고, 방출 스펙트럼을 구하였다.

혼성화(hybridization)는 다음과 같이 실시하였다.

티올-수식(thiolated) 올리고뉴클레오티드를 양자점과 접합시키기 위하여, 8μM의 양자점을 100μM의 티올-수식 올리고뉴클레오티드 및 0.1M의 인산염 완충용액(NaCl: 0.1M)과 혼합하였다. 그 다음, 상온에서 세이킹 인큐베이터(BioFree 사의 모델 SI-600-R; 25 ℃, 100 rpm) 내에 밤 시간 동안(overnight) 유지하였다. 생접합된 양자점 프로브는 100 μM의 표적 핵산(올리고뉴클레오티드)과 혼합하여 상온에서 1시간 동안 유지하여 혼성화시켰다.

삽입 염료로서 PI의 농도를 0 내지 20㎎/㎕ 범위에서 변화시키면서 혼성화하였으며, 이로부터 얻어지는 형광 강도를 측정하였다. 이때, 양자점 및 표적 핵산의 농도는 각각 8 μM 및 100 μM으로 일정하게 유지하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다(여기 파장: 450㎚). 상기 도면에 따르면, 양자점으로부터의 형광 강도는 약 525㎚에서 점차적으로 감소하는 반면, PI로부터의 형광 강도는 약 625㎚에서 증가하였다. 양자점으로부터의 방출 강도가 PI로부터의 방출 강도에 비하여 현저히 크기 때문에 PI로부터의 형광 강도 변화는 별도의 박스에 나타내었다. 상기 도면으로부터, 도너인 양자점과 어셉터인 PI 간에 FRET 현상이 일어났음을 확인할 수 있었다.

또한, 삽입 염료로서 PI의 농도(2㎎/㎕), 및 양자점의 농도(8μM)를 고정하고, 표적 핵산의 농도를 20 내지 100 μM 범위에서 변화시키면서 혼성화를 수행하였으며, 이로부터 얻어지는 형광 강도를 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다(여기 파장: 450㎚). 상기 도면에 따르면, FRET 효율은 표적 핵산의 농도에 따라 변화하였다. 표적 핵산의 농도가 증가함에 따라, 양자점으로부터의 방출 강도는 감소한 반면, PI로부터의 방출 강도는 증가하였다. 이는 표적 핵산의 농도가 증가할수록 보다 많은 색소(PI)가 삽입되어 FRET 효율이 증가하는 것으로 추측할 수 있다.

한편, FRET 효율은 도너-어셉터 거리에 의존하며, 어셉터의 존재 하에서 도너의 형광 강도의 감소를 측정함으로써 결정될 수 있다.

FRET 효율의 계산을 위하여 하기 수학식 1이 사용된다.

[수학식 1]

E=1-(I _DA /I _D )

상기에서, I _DA 및 I _D 는 각각 어셉터의 존재 하에서 및 어셉터의 부존재 하에서의 도너의 형광 강도이다.

상기 FRET 파라미터는 PI 및 표적 핵산의 다양한 농도를 이용한 형광 강도 데이터에 의하여 결정되었다. 상기 값을 하기 표 3 및 4에 나타내었다.

다양한 PI 농도에서의 혼성화 생성물로부터 얻어진 FRET 파라미터

	양자점-표적핵산(2㎎/㎕ PI)	양자점-표적핵산(10㎎/㎕ PI)	양자점-표적핵산(20㎎/㎕ PI)
I_D	1.5011	1.5011	1.5011
I_DA	1.5721	0.8311	0.5749
E	-	0.45	0.62

다양한 표적핵산 농도에서의 혼성화 생성물로부터 얻어진 FRET 파라미터

	양자점-표적핵산 (8μM : 20μM)	양자점-표적핵산 (8μM : 60μM)	양자점-표적핵산 (8μM : 100μM)
I_D	524.22	524.222	524.22
I_DA	493.43	446.80	402.08
E	0.06	0.15	0.23

실시예 2

실시예 1과는 별도로, 양자점과 티올-수식 올리고뉴클레오티드의 접합(conjugation) 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 혼성화를 통하여 얻어진 생성물을 분석함으로써 간접적으로 양자점과 티올-수식 올리고뉴클레오티드 간의 생접합 여부를 확인하였는 바, 구체적으로 1㎍/㎖의 EtBr를 사용하여 혼성화시킨 후에 2% 아가로즈 겔(agarose gel) 상에서 전기영동 실험을 수행하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

상기 도면에 따르면, 녹색(green) 밴드는 양자점과 올리고뉴클레오티드의 생접합에 기인하는 것이고, 붉은색(red) 밴드는 양자점과 올리고뉴클레오티드가 접합되지 않은 것에 기인한다. 이는 접합되었을 때 전기 영동 과정에서 보다 느리게 이동하기 때문이다. 따라서, 생접합된 경우의 생성물은 겔-전기영동 후에 접합된 생성물과 분리될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims

a) 양자점을 제공하는 단계;
b) 표적 핵산에 대한 상보적 염기서열의 올리고뉴클레이티드가 구비된 프로브를 상기 양자점의 표면에 연결하여 생접합된 양자점-프로브를 형성하는 단계; 및
c) 삽입 색소(intercalating dye)의 존재 하에서 상기 표적 핵산과 상기 생접합된 양자점-프로브를 혼성화하는 단계;
를 포함하며,
상기 삽입 색소는 혼성화에 의하여 상기 양자점과 형광공명에너지전이(FRET)를 발생시키고,
상기 표적 DNA는 라벨링되지 않은 것을 특징으로 하는 핵산의 검출 방법.
제1항에 있어서,
d) 상기 형광공명에너지전이에 따른 형광 신호를 검출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 양자점은 CdSe(코어)/ZnS(쉘)의 코어/쉘 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 양자점은 수용성을 나타내도록 표면 처리된 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서,
상기 양자점의 표면은 히드록시기(-OH), 카르복실기(-COOH), 아민기(-NH₂), 또는 티올기(-SH)로 캡슐화 또는 표면 개질된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 양자점의 사이즈는 1 내지 10㎚ 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 프로브는 말단(양자점의 표면 방향의 말단)이 수식된 올리고뉴클레오티드가 구비된 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는 티올기로 수식된 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 티올기는 C₆-티올기인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 삽입 색소는 프로포디움 이오다이드(PI)인 것을 특징으로 하는 방법.
양자점; 및
상기 양자점의 표면에 연결되고, 표적 핵산에 대한 상보적(complementary) 염기 서열의 올리고뉴클레오티드를 갖는 생접합된 양자점-프로브를 포함하며,
상기 표적 핵산과 상기 생접합된 양자점-프로브의 혼성화(hybridization)에 의하여 삽입되는 색소(intercalating dye)가 상기 양자점과 형광공명에너지전이(FRET)를 발생시키고,
상기 표적 DNA는 라벨링되지 않은 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 형광공명에너지전이-기반 나노센서 시스템.