CN112961907B - 一种同时检测两种rna的荧光生物传感器及其制备和使用方法 - Google Patents

一种同时检测两种rna的荧光生物传感器及其制备和使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112961907B
CN112961907B CN202110240203.8A CN202110240203A CN112961907B CN 112961907 B CN112961907 B CN 112961907B CN 202110240203 A CN202110240203 A CN 202110240203A CN 112961907 B CN112961907 B CN 112961907B
Authority
CN
China
Prior art keywords
complementary
qdna
double
cdna1
cdna2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110240203.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112961907A (zh
Inventor
向娟
郭雅鑫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Central South University
Original Assignee
Central South University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Central South University filed Critical Central South University
Priority to CN202110240203.8A priority Critical patent/CN112961907B/zh
Publication of CN112961907A publication Critical patent/CN112961907A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112961907B publication Critical patent/CN112961907B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种同时检测两种RNA的荧光生物传感器及其制备和使用方法。当目标检测物miRNA出现在反应体系中，抓捕链cDNA1、cDNA2分别与目标microRNA结合，CQDs及Cy5荧光恢复。同时，使用双链特异性核酸酶(DSN)作用于pDNA与目标MicroRNA形成的双链，使得microRNA参与下一轮的反应，从而达到信号放大的作用。本发明构建方法简单，检测灵敏度高，可实现同时定量检测样本中两个miRNA的表达量，且反应条件温和、传感体系稳定有效，对比临床上基因测序的昂贵繁琐，具有很大的实际意义和发展潜力，有利于推广使用。

Description

一种同时检测两种RNA的荧光生物传感器及其制备和使用 方法
技术领域
本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种同时检测两种RNA的荧光生物传感器及其制备和使用方法。
背景技术
目前常用的针对miRNA的检测手段主要有Northern印记技术、solexa测序技术、微阵列、荧光原位杂交技术、实时定量荧光PCR(QRT-PCR)等，可准确鉴别基因组，虽然灵敏度高，但操作复杂、耗时长且检测成本高昂。生物传感器方面，电化学、紫外、SPR、比色法等检测方法多与分子信标、酶等反应原理联用，极大降低了检测成本和等待时间，但仍然存在检测限高、灵敏度低、重现性差、实际样干扰多等缺点。其中，荧光法以其原理简单、即时检测、成本低廉等优点表现突出，在实际样的检测中优势明显。因此，设计一种模型可变、构建稳定、操作简单、成本低廉的以功能化DNA为模型的生物传感器，通过荧光信号检测直接获得一个或多个待测物表达量被提上日程。
本发明提供了一种同时检测两种RNA的荧光生物传感器，以检测阿尔兹海默症(AD)相关的两个miRNA为例，仅需一次构建，便同时检测出与阿尔兹海默症相关的两个miRNA在血清中的表达量，降低了假阳性的概率。本发明中构建的双信号荧光传感器采用了碳量子点作为其中一个荧光信号，具有优良的光致发光性能，同时具有化学惰性和良好的生物相容性、生物毒性低、稳定性好、制备方法简单且制备成本低，是一种良好的荧光纳米材料。同时，本发明中采用了双链特异性核酸酶，能够特异性识别并降解RNA-DNA杂合双链中的DNA链，使得RNA链被释放，释放的RNA链可以继续参加下一轮的杂交-酶降解过程，如此循环，达到信号扩增的目的。与传统的生物传感器相比，本发明中的荧光生物传感器具有检测限低、灵敏度高、简单快速的优点。
发明内容
本发明的首要目的旨在提供一种同时检测样本中两个RNA的生物传感器的制备方法。本发明的生物传感器制备简单，可通过修改少量DNA序列设计以用于任意RNA，尤其是miRNA的检测，而且具有检测限低、灵敏度高、简单快速等优势，同时反应条件温和，大大提升可操作性。
一种同时检测两种RNA的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将设计与qDNA有碱基互补的氨基修饰的抓捕链cDNA1以及与qDNA有碱基互补的荧光基团修饰的抓捕链cDNA2与两端分别修饰猝灭基团的qDNA预先杂交，得到cDNA2的荧光基团信号被猝灭的双链DNA；
(2)将羧基修饰的碳量子点与cDNA1修饰的氨基反应，结合到双链DNA中，碳量子点的荧光信号被另一端的猝灭基团猝灭，组成探针体系。
所述的制备方法，
步骤(1)中cDNA1从3’端开始依次与qDNA有5-8个碱基互补，5-7个碱基不互补，5-7个碱基互补；cDNA2从5’端开始依次与qDNA有5-8个碱基互补，5-7个碱基不互补，5-7个碱基互补。
进一步地，优选步骤(1)中cDNA1从3’端开始依次与qDNA有8个碱基互补，5个碱基不互补，5个碱基互补；cDNA2从5’端开始依次与qDNA有8个碱基互补，5个碱基不互补，5个碱基互补。
所述的制备方法，
所述cDNA1或cDNA2长20-30bp,待测RNA能够与cDNA1或cDNA2完全互补配对，cDNA1一端修饰有氨基；cDNA2一端修饰有荧光基团；所述qDNA长40-70bp。
进一步地，优选所述cDNA1或cDNA2长20-23bp,所述qDNA长40-50bp。
所述的制备方法，
荧光基团包括：Cy5或TAMRA荧光基团；所述qDNA两端分别修饰猝灭基团BHQ；碳量子点表面具有羧基，粒径小于100nm，优选5-10nm。
cDNA1和cDNA2连接的荧光基团可以互换，即cDNA1可以连接Cy5或TAMRA，而cDNA2可以修饰氨基，再连接羧基修饰的碳量子点。
进一步地，优选的方案，所述双链DNA的合成，是取等体积等浓度的cDNA1、cDNA2与qDNA混合，使最终浓度均为1-5μM，优选1μM，溶剂为30-40mM(优选34mM)Tris-HCl(pH7.4)缓冲液。
进一步地，所述碱基互补配对杂交反应条件为70-98℃的温度水浴5-10min后冷却至30-40℃左右水浴2-4h。
优选的方案，所述碱基互补配对杂交反应条件为95℃下水浴5min后自然降温至37℃水浴2h。
所述的制备方法，
碳量子点表面的羧基基团被EDC、NHS活化反应后再与cDNA1的氨基基团进行反应从而结合；通过将制备好的碳量子点与杂交形成的双链DNA在30-50℃，震荡条件下反应6-14h,优选的方案是37℃，震荡条件下反应12h。
进一步地，碳量子点的制备方法优选通过溶剂热法合成制备：将0.9g邻苯二胺和90mL乙醇置于聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，在烘箱中180℃反应12h，得到橙色悬浮液的粗产物。将其通过离心处理，参数设置为14000rpm/min，离心15分钟，去除不溶物。进一步，通过0.22μm的微孔滤膜进行过滤后，通过1000kd的渗透膜进行处理除去生成的较大颗粒的纳米碳。将纯化好的溶液进行冷冻干燥处理，获得固体粉末碳量子点。
进一步地，优选的方案，分别称取一定量的EDC和NHS，溶于PBS溶液中，使其最终浓度为100mM；将2mg的碳量子点加入到上述溶液中；超声10min后于室温下震荡混匀15min，即可得到浓度为20μM的表面羧基活化的碳量子点溶液。
进一步地，将上述方法步骤(1)杂交形成的双链DNA(qcDNA)与活化羧基基团的碳量子点溶液反应，将碳量子点与双链DNA通过氨基与羧基的酰胺化反应结合在一起形成两端碱基互补双螺旋结构，中间部分碱基互补，且荧光基团Cy5信号被BHQ-3，碳量子点荧光信号被BHQ-2猝灭的探针链(pDNA)，组成探针体系。
进一步地，所述探针链pDNA的合成是取1-5μM的双链DNA(qcDNA)与100-500μM的碳量子点溶液混合，使qcDNA最终浓度为500-1000nM,碳量子点最终浓度为10-20μM，qcDNA与碳量子点的物质的量浓度比为1:5-1:20；溶剂为30-40mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液。
优选的方案，所述探针链pDNA的合成是取1μM的双链DNA与20-40μM(优选20μM)的碳量子点溶液混合，使qcDNA最终浓度为500nM,碳量子点最终浓度为10μM，qcDNA(qcDNA是未与碳量子点反应的杂交双链)与碳量子点的物质的量浓度比为1:20；溶剂为34mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液。
所述的制备方法，
所述cDNA1碱基序列为
5'-AGAATCCTTGCCCGGGTGCATT-3'-NH2 C6；见SEQ ID NO.1；
所述cDNA2碱基序列为
Figure BDA0002961910830000041
见SEQ ID NO.2；
所述qDNA碱基序列为
Figure BDA0002961910830000042
见SEQID NO.3；
cDNA1和cDNA2划线部分与qDNA划线部分碱基互补。
所述的制备方法，
所述的生物传感器还包括：信号循环放大反应所需的双链特异性核酸酶(DSN酶)以及双链特异性核酸酶反应所需的试剂。
所述的制备方法，双链特异性核酸酶反应所需的试剂包括双链特异性核酸酶储存缓冲液，组成为：50mM Tris-HCl,pH 8.0以及10X DSN反应缓冲液，10X DSN反应缓冲液组成为：500mM Tris-HCl,50mM MgCl2，10mM DTT,pH 8.0。
本发明的第二个目的是提供一种同时检测两种RNA的荧光生物传感器，是由上述的方法制备而成的。
本发明的第三个目的是提供同时检测两种RNA的荧光生物传感器的使用方法：将待测样本溶液加入含探针体系以及双链特异性核酸酶(DSN酶)的反应溶液中进行杂交反应，检测荧光信号，获得目标待测RNA1的荧光信号值以及目标待测物RNA2的荧光信号值。
本发明排除诊断目的的使用或者检测。
优选的方案，将不同浓度的含待测特定序列的目标miRNA溶液加入含探针链以及DSN酶的反应溶液中进行杂交反应，使pDNA的最终浓度为50nM-100nM，优选50nM，DSN酶的最终浓度为0.01-0.05U/μL，优选0.01U/μL。
优选的方案，上述杂交反应的反应条件为，40-60℃水浴1-4h，优选50℃水浴1h。
进一步的，所述传感器的使用方法，为荧光分光光度法，检测条件为荧光分光光度计F-7000,检测参数设置为激发狭缝宽度为10.0nm，发射狭缝宽度为10.0nm，倍增管电压为950V,扫描速度为1200nm/min，激发波长分别为410nm(检测碳量子点荧光强度)，和620nm(检测Cy5荧光强度)。
本发明中的荧光生物传感器，优选抓捕链cDNA1由氨基修饰，氨基用于与碳量子点上的羧基反应，从而与碳量子点结合。优选抓捕链cDNA2由荧光基团Cy5修饰。碳量子点和Cy5作为荧光信号分子，于Tris-HCl缓冲液(34mM,pH7.4)中进行荧光分光光度计检测，分别在558nm和668nm左右存在两个明显的发射峰，以此峰对应的最大峰值作为本实验的定量信号。记传感器初始信号为F0,CQDS和F0,Cy5，加入目标待测物反应后，位于558nm的碳量子点荧光峰和668nm的Cy5荧光信号发生变化，此时荧光信号分别为FCQDS和FCy5。两次荧光信号的差值与初始荧光值的比值N△F＝(F-F0)/F0为纵坐标，对应的检测物的浓度值cmiRNA为横坐标，构建标准曲线。
本发明中荧光生物传感器的构建基于DNA分子杂交原理和氨基羧基脱水缩合反应，其反应及检测原理基于抓捕cDNA与待测目标物miRNA有更多的配对碱基，可以形成更加稳定的结构，以及DSN酶作用于DNA与RNA形成的双链，特异性切割杂合结构中的DNA链，释放出miRNA可以继续与未反应的探针链结合达到增强信号的效果。本发明实现了同时定量检测血清中两个阿尔兹海默症特异性miRNA的目的。
抓捕链cDNA1、cDNA2与猝灭链qDNA率先通过高温退火的方式形成两端碱基互补双螺旋结构，中段部分互补的双链DNA结构；再通过氨基羧基缩合反应将碳量子点与双链DNA结合，形成探针链，构成传感体系。此时由于荧光能量共振转移FRET，碳量子点和Cy5的荧光信号分别被猝灭链的BHQ-2和BHQ-3所猝灭。当待测目标物miR-455-3p及miR-501-3p被捕获后，原来的双链DNA被打开，抓捕链cDNA1、cDNA2分别与其杂交形成DNA-RNA杂合结构，qDNA被释放在体系溶液中。此时CQDS和Cy5的荧光信号得到恢复。并且反应溶液中存在DSN酶，起作用于DNA与RNA形成的双链，特异性切割杂合结构中的DNA链，从而释放出的miRNA可以继续与未反应的探针链结合，使得CQDS与Cy5的荧光信号得到进一步增强，且其信号恢复程度与目标物的浓度成正比。
相比现有技术，本发明的优点技术在于：
(1)本发明采用碳量子点作为其中的一个荧光信号分子，其具有制备方法简单，成本低、荧光较强以及高稳定性等多方面的优点。并且可通过改变其制备过程中的条件制备出尺寸不同从而发射峰位置不同的碳量子点，以满足实验的需求。
(2)本发明中碳量子点与双链DNA的结合是通过抓捕链cDNA1 3'端的氨基基团与碳量子点表面的羧基基团的缩合反应形成共价键。因此本发明传感器构建方法操作简单，且探针链稳定性强，可长时间存放，在较长时间内均可用于目标物的检测。
(3)本发明中采用双链特异性核酸酶(DSN酶)，可作用于DNA与RNA形成的双链，特异性切割杂合结构中的DNA链，释放出miRNA继续与未反应的探针链结合达到增强信号的效果，有效提升了检测灵敏度，拥有较低的检测限和较宽的检测范围。
(4)本发明中的荧光生物传感器从投放目标待测物miRNA到检测结果仅需1小时，简单快速，且仅需一次构建，后续可分步操作得到两个有效信息，同时本发明仅需改碱基设计便可实现对各类miRNA的检测，有效提升了实际待测样本的检测效率。
(5)本发明的生物传感器的检测方法是荧光分光光度法，本传感器由于其特殊结构具有两个较弱的初始信号，取后两步检测信号分别与初始信号的差与初始信号的比值来定量，进一步缩小了由于荧光检测的系统误差、人为误差和重现性误差，使检测数据可靠性更高。
(6)本发明的生物传感器及其检测方法创新性地探究了血清中阿尔兹海默症特异性miRNA，仅一次构建可分别检测目标序列两种miRNA。通过检测血清中两种阿尔兹海默症特异性miRNA的表达量，极大地减少了检测假阳性的概率，对目前现有的单信息输出传感器体系，优势明显。同时，本实验中浓度梯度的设置也建于实际样本中检测对象的真实浓度范围，确保了本传感器及其检测法可于实际待测样检测，这是以往同类型发明所未探究的。
(7)本发明的生物传感器的使用方法，能够适用于多种非医学诊断的阿尔兹海默症的研究，以其他疾病的miRNA分子标记物的检测。
附图说明
图1为本发明传感器构建及检测原理示意图:
A为本发明荧光生物传感器的构建原理示意图，B为针对含目标序列的miRNA表达量的检测原理示意图。
图2为本发明中传感器检测方法的可行性探究:
A图为针对目标待测物miR-455-3p的检测，分别对应投放空白样以及miR-455-3p后Cy5荧光信号；
B图为针对目标待测物miR-501-3p的检测，分别对应投放空白样以及miR-501-3p后CQDS荧光信号。
图3为本发明中传感器检测中DSN酶浓度优化(A)与反应时间的条件优化(B)。
图4为本发明中传感器检测中荧光信号值变化幅度及miRNA的浓度-信号线性关系:
A图为Cy5荧光信号值变化幅度及miR-455-3p的浓度-信号线性关系，
B图为CQDS荧光信号值变化幅度及miR-501-3p的浓度-信号线性关系。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求的保护范围。本发明以阿尔兹海默症特异性生物标志物miR-455-3p以及miR-501-3p为例，说明论证本发明方法的可行性，但并不限于这两种特定序列miRNA的检测，是可通过变更基因序列设计以适用于其他多种miRNA的检测方法。
本发明的所有药品和试剂无特殊说明均直接通过购买得到，如西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司、阿拉丁生物技术(上海)有限公司、生工生物工程(上海)股份有限公司等。
实施例1
(1)碳量子点的制备及活化
通过溶剂热法合成制备碳量子点，将0.9g邻苯二胺和90mL乙醇置于100mL容积的聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，在烘箱中180℃反应12h，得到橙色悬浮液的碳量子点粗产物。将荧光碳点冷却值室温后，将其通过离心洗涤，参数设置为14000rpm/min，离心15分钟。进一步，通过0.22μm的微孔滤膜进行过滤后，通过1000kd规格的渗透膜进行处理出去生成的较大颗粒的纳米碳。将纯化好的溶液进行冷冻干燥处理，获得固体粉末碳量子点。
分别称取一定量的EDC和NHS，溶于PBS溶液中，使其最终浓度为100mM。将2mg的碳量子点后加入到上述溶液中。超声10min后于室温下震荡混匀15min即可得到浓度为20μM的表面羧基活化的碳量子点溶液，放入冰箱，4℃下保存备用。
(2)qcDNA与传感体系的制备
cDNA1序列：5'-AGAATCCTTGCCCGGGTGCATT-3'-NH2 C6
cDNA2序列：
Figure BDA0002961910830000081
qDNA序列：
Figure BDA0002961910830000082
分别配制10μMcDNA1、10μMcDNA2和10μMqDNA溶液，溶剂为34mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液。取等量的cDNA1、cDNA2及qDNA溶液混合得到终浓度各为1μM的混合溶液，混匀后置于95℃水浴5min后降温至37℃并持续2h，得到qcDNA溶液。
取1μM的qcDNA与20μM的碳量子点溶液，使qcDNA最终浓度为500nM,碳量子点最终浓度为10μM，qcDNA与碳量子点的物质的量浓度比为1:20，于37℃下震荡混匀12h，使得CQDS被固定在qcDNA上，得到两端分别为CQDS和Cy5荧光基团且都被猝灭的pDNA探针链(500nM)，构成生物传感体系。溶剂为34mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液。
(3)目标待测物miR-455-3p和miR-501-3p的检测
miR-455-3p序列：5'-GCAGUCCAUGGGCAUAUACAC-3'，见SEQ ID NO.4；
miR-501-3p序列：5'-AAUGCACCCGGGCAAGGAUUCU-3'，见SEQ ID NO.5。
分别配制10μM miR-455-3p和10μM miR-501-3p溶液，溶剂为焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水。
单独检测miR-455-3p
取探针链pDNA溶液(500nM)5μL，使其最终浓度为50nM。分别取不同浓度的目标检测物miR-455-3p加入到上述溶液中，使其最终浓度分别为0fM,10fM，100fM,250fM,500fM,750fM,1000fM。加入DSN酶溶液，使其最终浓度为0.01U/μL。此时进行qDNA与待测miRNA的杂交反应，反应条件为50℃水浴1h。
检测Cy5荧光信号，检测条件为荧光分光光度计F-7000,检测参数设置为激发狭缝宽度为10.0nm，发射狭缝宽度为10.0nm，倍增管电压为950V,扫描速度为1200nm/min，激发波长为620nm。记miR-455-3p最终浓度分别为0fM时为F0,Cy5，其余情况记作FCy5。记两次荧光信号的差值△FCy5(△FCy5＝FCy5-F0,Cy5)与F0的比值N△F-Cy5＝(FCy5-F0,Cy5)/F0,Cy5为纵坐标，对应的检测物的浓度值cmiR-455-3p为横坐标，构建标准曲线。
同理，单独检测miR-501-3p也如上述步骤。
取探针链pDNA溶液(500nM)5μL，使其最终浓度为50nM。分别取不同浓度的目标检测物miR-501-3p加入到上述溶液中，使其最终浓度分别为0fM,10fM，100fM,250fM,500fM,750fM,1000fM。加入DSN酶溶液，使其最终浓度为0.01U/μL。此时进行qDNA与待测miRNA的杂交反应，反应条件为50℃水浴1h。
检测CQDS荧光信号，检测条件为荧光分光光度计F-7000,检测参数设置为激发狭缝宽度为10.0nm，发射狭缝宽度为10.0nm，倍增管电压为950V,扫描速度为1200nm/min，激发波长为410nm。记miR-501-3p最终浓度分别为0fM时为F0,CQDS，其余情况记作FCQDS。记两次荧光信号的差值△FCQDS(△FCQDS＝FCQDS-F0,CQDS)与F0的比值N△F-CQDS＝(FCQDS-F0,CQDS)/F0,CQDS为纵坐标，对应的检测物的浓度值cmiR-501-3p为横坐标，构建标准曲线。
从图1可以看出，A为本发明荧光生物传感器的构建原理示意图，B为针对含目标序列的miRNA表达量的检测原理示意图。
从图2可以看出，A图为针对目标待测物miR-455-3p的检测，分别对应投放空白样以及miR-455-3p后Cy5荧光信号。B图为针对目标待测物miR-501-3p的检测，分别对应投放空白样以及miR-501-3p后CQDS荧光信号。Cy5和CQDS猝灭的信号都有所恢复，说明本发明传感器及其检测方法均可行。
从图3可以看出，A图为本发明中传感器检测中DSN酶浓度优化，说明当DSN酶浓度为0.01U/μL时检测效果最佳；B图为本发明中传感器反应时间的条件优化，说明当反应时间为1h时检测效果最佳；
从图4可以看出，A图为检测miR-455-3p浓度时，标准化信号大小N△F-Cy5与miR-455-3p的浓度成线性关系(N△F-Cy5＝5.5623×10-4cmiR-455-3p+0.03945)，B图为CQDS荧光信号值变化幅度及miR-501-3p的浓度-信号线性关系，标准化信号大小N△F-CQDS与miR-501-3p的浓度成线性关系(N△F-CQDS＝6.3417×10-4cmiR-455-3p+0.05694)。
从表1、表2可以看出，此传感器在实际样本中的检测不同浓度的含目标序列miRNA的回收率接近100％，相对标准偏差较小，说明该检测干扰较小，可运用于实际样品的检测。
表1稀释10倍正常人血清中miR-455-3p回收率的测定
Figure BDA0002961910830000101
表2稀释10倍正常人血清中miR-501-3p回收率的测定
Figure BDA0002961910830000102
表3稀释10倍血清中miR-455-3p和miR-501-3p的同时测定
Figure BDA0002961910830000103
序列表
<110> 中南大学
<120> 一种同时检测两种RNA的荧光生物传感器及其制备和使用方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaatccttg cccgggtgca tt 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgtatatgc ccatggactg c 21
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatgcacctt tttaaggagg ggtttttcca tttttatata cac 43
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
gcaguccaug ggcauauaca c 21
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
aaugcacccg ggcaaggauu cu 22

Claims (8)

1.一种同时检测两种RNA的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将设计与qDNA有碱基互补的氨基修饰的抓捕链cDNA1以及与qDNA有碱基互补的荧光基团修饰的抓捕链cDNA2与两端分别修饰猝灭基团的qDNA预先杂交，得到cDNA2的荧光基团信号被猝灭的双链DNA；
（2）将羧基修饰的碳量子点与cDNA1修饰的氨基反应，结合到双链DNA中，碳量子点的荧光信号被另一端的猝灭基团猝灭，组成探针体系；
步骤（1）中cDNA1从3’端开始依次与qDNA有5-8个碱基互补，5-7个碱基不互补，5-7个碱基互补；cDNA2从5’端开始依次与qDNA有5-8个碱基互补，5-7个碱基不互补，5-7个碱基互补；
所述cDNA1或cDNA2长20-30bp,待测RNA能够与cDNA1或cDNA2完全互补配对，cDNA1一端修饰有氨基；cDNA2一端修饰有荧光基团；所述qDNA长40-70bp。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
荧光基团包括：Cy5或TAMRA荧光基团；所述qDNA两端分别修饰猝灭基团BHQ；碳量子点表面具有羧基，粒径小于100nm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
碳量子点表面的羧基基团被EDC、NHS活化反应后再与cDNA1的氨基基团进行反应从而结合；通过将制备好的碳量子点与杂交形成的双链DNA在30-50℃，震荡条件下反应6-14h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述cDNA1碱基序列为
5'-AGAATCCTTGCCCGGGTGCATT-3'-NH2 C6；
所述cDNA2碱基序列为
5'-Cy5-GTGTATATGCCCATGGACTGC-3'；
所述qDNA 碱基序列为
5'-BHQ-2-AATGCACCTTTTTAAGGAGGGGTTTTTCCATTTTTATATACAC-3'-BHQ-3；
cDNA1和cDNA2划线部分与qDNA划线部分碱基互补。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的生物传感器还包括：信号循环放大反应所需的双链特异性核酸酶以及双链特异性核酸酶反应所需的试剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，双链特异性核酸酶反应所需的试剂包括双链特异性核酸酶储存缓冲液，组成为：50 mM Tris-HCl, pH 8.0以及10X DSN 反应缓冲液，10X DSN 反应缓冲液组成为：500 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2，10 mM DTT, pH 8.0。
7.一种同时检测两种RNA的荧光生物传感器，是由权利要求1-6任一项所述的方法制备而成的。
8.权利要求7所述的同时检测两种RNA的荧光生物传感器的使用方法，其特征在于，将待测样本溶液加入含探针体系以及双链特异性核酸酶的反应溶液中进行杂交反应，检测荧光信号，获得目标待测RNA1的荧光信号值以及目标待测物RNA2的荧光信号值。
CN202110240203.8A 2021-03-04 2021-03-04 一种同时检测两种rna的荧光生物传感器及其制备和使用方法 Active CN112961907B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110240203.8A CN112961907B (zh) 2021-03-04 2021-03-04 一种同时检测两种rna的荧光生物传感器及其制备和使用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110240203.8A CN112961907B (zh) 2021-03-04 2021-03-04 一种同时检测两种rna的荧光生物传感器及其制备和使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112961907A CN112961907A (zh) 2021-06-15
CN112961907B true CN112961907B (zh) 2022-11-15

Family

ID=76276528

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110240203.8A Active CN112961907B (zh) 2021-03-04 2021-03-04 一种同时检测两种rna的荧光生物传感器及其制备和使用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112961907B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114295594B (zh) * 2021-12-06 2023-09-19 贵州理工学院 一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器
CN114574553B (zh) * 2021-12-31 2024-08-30 南京医科大学第二附属医院 一种碳点-纳米金球形核酸及其制备方法和应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107267604B (zh) * 2017-06-08 2021-02-26 中山大学 一种基于短链核酸探针和双链特异性核酸内切酶的高特异性microRNA荧光检测方法
CN108037100B (zh) * 2017-11-16 2019-09-03 江南大学 一种基于FRET效应的同时检测两种miRNA的方法
CN108982439A (zh) * 2018-06-07 2018-12-11 南京市妇幼保健院 一种一步法同时检测miR-486、miR-146b和miR-15b的方法及其应用
CN111118120B (zh) * 2020-02-07 2022-09-23 江苏科技大学 一种基于DSN循环扩增技术对多种microRNA同时进行检测的液相色谱法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112961907A (zh) 2021-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Degliangeli et al. Nanotechnology‐based strategies for the detection and quantification of MicroRNA
Guo et al. Amplified fluorescence sensing of miRNA by combination of graphene oxide with duplex-specific nuclease
CN109001167B (zh) 一种基于适配体和碳点的链置换信号放大荧光传感器检测三磷酸腺苷的方法及试剂盒
CN109517880B (zh) 基于链替换反应和dna修饰的金纳米粒子检测端粒酶活性的方法
CN112961907B (zh) 一种同时检测两种rna的荧光生物传感器及其制备和使用方法
Qu et al. Recent advances of fluorescent biosensors based on cyclic signal amplification technology in biomedical detection
CN109913546B (zh) 一种检测miRNA的荧光生物探针及检测方法和用途
CN106755460B (zh) 一种单碱基突变检测方法
Zhang et al. A DNA tetrahedral structure-mediated ultrasensitive fluorescent microarray platform for nucleic acid test
CN114317686B (zh) 一种基于CRISPR/Cas13a系统的SERS检测试剂盒、其制备方法与应用
KR20140025663A (ko) 실버나노클러스터 프로브 및 이를 이용한 표적 폴리뉴클레오티드 검출방법 그리고 실버나노클러스터 프로브의 설계방법
Zhang et al. Fluorescence turn-on detection of target sequence DNA based on silicon nanodot-mediated quenching
CN105400781A (zh) 一种双嵌段分子探针及其快速检测核酸方法
Ma et al. Single-molecule/particle counting for microRNA detection and imaging
Wang et al. Glucometer-based electrochemical biosensor for determination of microRNA (let-7a) using magnetic-assisted extraction and supersandwich signal amplification
CN105838790B (zh) 一种银纳米簇传感器及其制备方法和在检测病毒基因中的应用
CN111521592A (zh) 一种信号放大的荧光检测体系、荧光生物传感器及其用途
Nie et al. Enzyme-assisted amplification of target cycle triggers the unlocking of locked hairpin probes for let-7a detection
CN113549692B (zh) 一种基于杂交链反应检测鼻咽癌抗放疗生物标志物的方法
CN110938675B (zh) siRNA定向自组装量子点生物传感器及其检测方法和应用
CN113528666A (zh) 一种多类型非编码rna检测方法及其在胃癌预警中的应用
CN108646014B (zh) 基于适体构象变化的荧光检测血小板源性生长因子的方法
Zeng et al. Target aided self-assembly of DNA hyperbranched nanostructures for bacterial 16 S ribosomal DNA gene SERS detection
Wang et al. Label/immobilization-free Cas12a-based electrochemiluminescence biosensor for sensitive DNA detection
Nie et al. Entropy-driven DNA circuit with two-stage strand displacement for elegant and robust detection of miRNA let-7a

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant