CN114295594B

CN114295594B - 一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器

Info

Publication number: CN114295594B
Application number: CN202111475488.XA
Authority: CN
Inventors: 肖志友; 司恒丹; 杨晓丹; 杨大航
Original assignee: Guizhou Institute of Technology
Current assignee: Guizhou Institute of Technology
Priority date: 2021-12-06
Filing date: 2021-12-06
Publication date: 2023-09-19
Anticipated expiration: 2041-12-06
Also published as: CN114295594A

Abstract

本发明公开了一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器，其特征在于：所述的传感器包含一条具有茎环结构的双标记DNA CCP2和一条双螺旋DNA T18AB，所述的双标记DNA序列如所示SEQ ID No.1，所述的双螺旋DNA序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

Description

一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器

技术领域

本发明涉及一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器，属于生物传感器领域。

背景技术

三螺旋DNA在分子识别、基因表达调控和基因疾病的诊疗等方面有重要作用，一直是人们关注的热点。三螺旋DNA通常由第三条链(TFO)与同型嘌呤·同型嘧啶双螺旋DNA(dsDNA)形成。平行三螺旋DNA因为TFO中胞嘧啶碱基需要质子化才能形成C·G*C⁺三碱基体(其中·表示Watson-Crick键，*表示 Hoogsteen键)，在生理条件下很难形成。构成三螺旋DNA的Hoogsteen氢键的稳定性也远低于双螺旋DNA的Watson-Crick氢键。由于这些原因，三螺旋 DNA在生理条件下的实际应用大大受限，克服这一限制的方法就是筛选嵌入剂增加三螺旋DNA的稳定性。因此建立筛选三螺旋DNA嵌入剂的传感器具有重要意义。

筛选三螺旋DNA嵌入剂的方法有金纳米溶胶法、高效液相色谱-质谱法、竞争透析法、紫外-可见分光光度法解链实验等。但这些方法大多劳动强度较大，相对较复杂和缓慢，有些还需要昂贵的精密设备。相对而言，荧光法具有操作简单、成本低、灵敏度高等优点，得到广泛应用。Tseng等报道了一种筛选三螺旋DNA稳定试剂的“turn-off”型荧光法。然而，最理想的荧光传感器具有“turn-on” 型特性，以降低背景噪声，同时具有高灵敏度和高选择性。Vasquez等构建了一种嵌入剂置换法用于筛选三螺旋DNA稳定试剂，该方法虽然简单、快速，但要求被筛选的稳定试剂与三螺旋DNA的键合能力必须高于嵌入剂-甲氧檗因。

分子信标(Molecular beacon，MB)最早由Tyagi和Kramer于1996年提出，是一种中间为环、两端碱基互补为茎的发夹结构寡聚核苷酸序列，其茎的两端分别标记有荧光基团和猝灭基团。MB已成为一种DNA探针，广泛应用于各种目标分析物，如凝血酶、转录因子、核酸、信使RNA(mRNA)、重金属离子、 microRNA(miRNA)等。这里，发明人拟利用MB与目标双螺旋DNA之间三螺旋DNA的形成需要嵌入剂的稳定作用，构建了一种“turn-on”型荧光法筛选稳定三螺旋DNA嵌入剂的传感器。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种基于分子信标筛选三螺旋 DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器，解决构成三螺旋DNA的 Hoogsteen氢键稳定性较差的技术问题。

本发明的技术方案是：一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器，所述的传感器包含一条具有茎环结构的双标记DNA CCP2和一条双螺旋DNAT18AB，所述的双标记DNA序列如所示SEQ ID No.1，所述的双螺旋DNA序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

进一步的，所述的传感器还包含精胺。

进一步的，所述的传感器的工作条件为：5～50mmol/L PBS作为工作缓冲溶液，0.01～0.15mmol/L精胺，传感器序列CCP2与T_18AB均为20～200nmol/L。

进一步的，所述的PBS中包含15mmol/L NaNO₃。

进一步的，所述的嵌入剂包含黄藤素和新霉素。

优选的，所述的传感器的工作条件为：20mmol/L PBS作为工作缓冲溶液，0.06mmol/L精胺，传感器序列CCP2与T_18AB均为100 nmol/L。

本发明的有益效果：本发明涉及一条具有茎环结构的双标记DNA (CCP2)和一条特定的双螺旋DNA(T_18AB)作为筛选三螺旋DNA嵌入剂的传感器序列。当没有嵌入剂(有机药物分子)存在时，双标记 DNA两端碱基互补配对形成茎环结构，标记的荧光团与淬灭基团密切靠近，荧光信号相对较弱；当有嵌入剂存在时，由于嵌入剂具有稳定三螺旋DNA的作用，两条传感器序列形成分子间三螺旋DNA，双标记 DNA的茎环结构打开，荧光信号增强，基于这一原理构筑了双标记荧光法筛选三螺旋DNA嵌入剂的传感器。优化后确定传感器的实验条件为：20mmol/L PBS(pH 7.5，含15mmol/L NaNO₃)作为工作缓冲溶液，0.06mmol/L精胺，传感器序列CCP2与T_18AB均为100nmol/L。采用该传感器方法对黄藤素、黄连素、新霉素、卡那霉素、EB、DAPI、四环素等有机药物分子进行嵌入剂筛选，通过多次实验发现加入黄藤素、黄连素、新霉素三种药物分子的荧光强度增加较为明显，说明这些药物分子有稳定三螺旋DNA的嵌入剂效果，然而卡那霉素、EB、 DAPI、四环素等则没有明显的嵌入剂作用。对药物本身的荧光及其对荧光团的干扰进行了测试，发现信号都非常弱，则三种药物分子的加入导致荧光增强是由于其稳定三螺旋DNA引起。采用圆二色谱对有无有机药物分子的溶液进行研究，发现存在黄藤素、黄连素、新霉素时三螺旋DNA的特征圆二色谱峰强度明显增加，与荧光光谱结果一致。。

附图说明

图1为实验可行性分析，(a)100nmol/L CCP2；(b)a+100nmol/L T_18AB；(c)b+4μmol/L黄连素；

图2为有无黄连素溶液的圆二色谱，(a)7.5μmol/L CCP2；(b) a+7.5μmol/L T_18AB；(c)b+0.13mmol/L黄连素；

图3为精胺浓度的优化，(A)不同精胺浓度溶液在705nm的荧光强度(a：无黄连素，b：有4μmol/L黄连素)；(B)不同精胺浓度下加与不加黄连素的溶液荧光强度的增加百分比。精胺的浓度分别为0.02mmol/L、0.06mmol/L、0.12mmol/L、0.18mmol/L、0.30 mmol/L；

图4为pH的优化，(A)不同pH溶液在705nm的荧光强度(a：无黄连素，b：有4μmol/L黄连素)；(B)不同pH下加与不加黄连素的溶液荧光强度的增加百分比；

图5为存在不同有机药物分子溶液的荧光光谱，(A)有机药物分子分别为：(a)无药物分子，(b)8μmol/L新霉素，(c)8μmol/L 黄藤素，(d)8μmol/L黄连素，(e)2μmol/LCoralyne；(B) 有机药物分子分别为：(a)无药物分子，(f)8μmol/L EB，(g) 8μmol/L DAPI，(h)8μmol/L卡那霉素，(i)8μmol/L四环素；

图6为存在不同有机小分子溶液在705nm的荧光强度，有机药物分子分别为：无药物分子，8μmol/L黄藤素，8μmol/L黄连素，2 μmol/L Coralyne，8μmol/L新霉素，8μmol/L四环素，8μmol/L 卡那霉素，8μmol/L DAPI，8μmol/L EB；

图7为不同有机药物分子无T_18AB溶液在705nm的荧光强度，实验条件与图6类似，仅不含双链DNA(T_18AB)；

图8为不同药物分子本身的荧光背景强度；有机药物分子分别为：无药物分子，8μmol/L黄藤素，8μmol/L黄连素，2μmol/L Coralyne，8μmol/L新霉素，8μmol/L四环素，8μmol/L卡那霉素， 8μmol/L DAPI，8μmol/L EB；

图9为存在不同有机药物分子溶液的圆二色谱，20mmol/L PBS (pH 7.5，含15mmol/L NaCl，0.06mmol/L精胺)缓冲溶液，7.5μmol/L CCP2，7.5μmol/L T_18AB，反应溶液保留30分钟。(A)有机药物分子分别为：(a)无有机药物分子，(b)0.13mmol/L Coralyne，(c) 0.13mmol/L黄藤素，(d)0.13mmol/L黄连素，(e)0.03mmol/L 新霉素；(B)有机药物分子分别为：(a)无有机药物分子，(f) 0.13mmol/L四环素，(g)0.13mmol/L卡那霉素；(h)0.13mmol/L DAPI，(i)0.13mmol/L EB。

具体实施方式

溶液的配制

(1)3mol/L NaNO₃溶液的配制

用万分之一的电子天平称取12.7485g NaNO₃粉末倒入容量瓶中，在容量瓶中加入50mL蒸馏水，定容、摇匀，将其放到产品型号为 HS-3120的超声波中震荡使其溶解，贴上标签纸，放在冰箱上层(3℃) 冷藏备用。

(2)2mol/L NaCl溶液的配制

用万分之一的电子天平称取5.844g NaCl粉末，将其转移到50mL 的容量瓶中，加适量蒸馏水后定容，摇匀，放在产品型号为HS-3120 的超声波中震荡使NaCl粉末溶解完全后，取出贴上标签纸，放在冰箱上层冷藏备用。

(3)双标记和无标记DNA序列溶液的配制

用移液枪往双标记DNA序列(CCP2)的离心管中加入指定体积的 20mmol/L PBS(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄磷酸缓冲盐溶液，pH 7.5)的缓冲溶液，然后将离心管放在微型旋涡混合仪上震荡，配制成粗略的100 μmol/L CCP2溶液，无标记(CCP2)的配制和上诉方法一样，最后使用紫外分光光度计对它们进行定量，然后将它们分装放入冰箱冷藏备用，用的时候将其稀释至所需浓度。

(4)单链DNA(T_18A、T_18B)溶液的配制

往单链DNA的离心管中准确加入指定体积的20mmol/L PBS7.5 缓冲溶液后置于WH-2微型旋涡混合仪上震荡，配制成粗略的100 μmol/L单链DNA溶液，使用紫外分光光度计对单链DNA进行定量，然后将它们分装放入冰箱冷藏备用。

(5)双链DNA(T_18AB)溶液的配制

往互补序列(T_18A和T_18B)中加入20mmol/L PBS7.5(含50mmol/L NaNO₃)的溶液加热到90℃保持5分钟后退火，配制成浓度为5μmol/L 双链DNA的溶液。

(6)20mmol/L PBS缓冲溶液的配制

用万分之一的电子天平称取1.504g Na₂HPO₄和0.125g NaH₂PO₄倒入烧杯中，在烧杯中加入250mL超纯水(二次蒸馏水)，在烧杯里面放入一枚圆柱形磁力搅拌子，将烧杯放在磁力搅拌器上进行搅拌，使Na₂HPO₄和NaH₂PO₄溶解完全，用pH计测溶液的pH值，将溶液的pH值调至7.5；用另外一个搅拌子吸出溶液里面的搅拌子，将溶液用玻璃棒引流到250mL容量瓶中，然后用胶头滴管滴加PBS缓冲溶液定容至250mL，最后在容量瓶上贴上标签纸，放在室温备用。根据配制pH 7.5的步骤，分别配制pH值为7.3、7.4、7.5、7.6、 7.7、7.8的20.0mmol/L PBS缓冲溶液。

(7)20mmol/L PBS7.5(含15mmol/L NaNO₃)工作缓冲溶液的配制

75μL 3mmol/L NaNO₃+14925μL 20mmol/L PBS7.5混合摇匀，备用。(通过查阅文献本论文选定NaNO₃最终浓度为15mmol/L)

(8)20mmol/L PBS7.5(含0.06mmol/L精胺、15mmol/L NaCl) 工作缓冲溶液的配制

30μL 6mmol/L精胺+2970μL 20mmol/L PBS7.5(含15mmol/L NaCl)。

(9)不同有机药物分子溶液的配制

用万分之一的电子天平称取0.0561g四环素倒入100mL烧杯中，在烧杯中加入适量超纯水，放在超声波中震荡使其溶解，然后将四环素溶液倒到50mL的容量瓶中，定容到50mL，摇匀，配制成0.5048 mmol/L四环素溶液。在容量瓶上贴标签后放在冰箱上层保存。依照上诉步骤，分别配制1.532mmol/L黄藤素、1.06mmol/L黄连素、 2.19mmol/L新霉素、2.24mmol/L卡那霉素、1mmol/L EB、2.5mmol/L 9-氨基吖啶、2mmol/L 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液，用时再稀释至所需浓度。

方案的设计和序列的选择

设计了特定的双标记DNA序列(选择合适的淬灭基团与荧光团搭配)作为嵌入剂(有机药物分子)筛选序列。DNA序列碱基组成见表 1。

表1 DNA序列碱基组成

双标记荧光法筛选三螺旋DNA嵌入剂的原理如下：

双标记DNA序列和双链DNA(互补序列通过加入20mmol/L PBS7.5，50mmol/L NaNO₃溶液加热到90℃保持5分钟后退火)结合，加入嵌入剂(有机药物分子)后，DNA结构发生转化，折叠形成分子间三螺旋DNA，两端标记的荧光团与淬灭基团相互远离，荧光信号增强；当无有机药物分子存在时，荧光信号相对较弱；另外还在体系里面加入了精胺，精胺在三螺旋DNA形成的过程中起到辅助作用，据此建立双标记荧光法筛选三螺旋DNA嵌入剂的传感器研究。

DNA浓度的测定

分别在CCP2、CCP2(无标记)、T_18A、T_18B的离心管中加入指定体积的20mmol/LPBS7.5的缓冲溶液(开盖前先离心30～60s)，放在旋涡混合仪上震荡使其充分溶解，取出10μL加20mmol/L PBS7.5 的缓冲溶液稀释100倍，然后用紫外可见分光光度计对它们进行定量。

荧光光谱的测定

(1)样品的制备

实验步骤：室温24℃下，在pH 7.5的20mmol/L PBS缓冲溶液 (含15mmol/L NaNO₃)中，加入10μL 5μmol/L T_18AB，再加入10μL 3mmol/L精胺溶液，然后再分别加入①无有机药物小分子、②10μL 400μmol/L黄藤素、③10μL 400μmol/L黄连素、④10μL 400μmol/L 新霉素、⑤10μL 400μmol/L四环素、⑥10μL 400μmol/L卡那霉素、⑦10μL 400μmol/L DAPI、⑧10μL 400μmol/L EB，最后卡表每过一分钟加入10μL 5μmol/L双标记DNA序列(CCP2)，摇匀，保留55min，其余荧光光谱的测定实验步骤和上述步骤类似。

(2)样品荧光光谱的测定

准备好待测样品，保留55min后开始测量，①先打开电脑；② 打开仪器；③打开软件Fluoracle，初始化完成后，软件跳出Signal rate对话框，在其界面调节样品信号，在Source of light path中选择光源为Xenon Lamp，Detector of light path中选择检测器为Visible PMT-900，选完后，将Excitation和Emission的 bandwidth(也就是狭缝)调到4.00nm；④在Setup里面打开氙灯； ⑤在λ里面设置参数，激发波长为684nm，扫描范围为694～750nm； ⑥将待测样品放入卡槽里面，点击Emission Scan模式(Ctrl+M+回车)，开始扫描溶液的荧光发射光谱，每间隔一分钟测量一个样。

圆二色谱的测定

1.样品的制备

(1)空白缓冲溶液：工作缓冲溶液(20mmol/L PBS 7.5(含有0.06mmol/L的精胺、15mmol/L NaCl))；(2)T_18AB溶液：工作缓冲溶液+7.5μmol/L T_18AB；(3)无标记CCP2溶液：工作缓冲溶液 +7.5μmol/L无标记-CCP2；(4)无标记CCP2与T_18AB混合溶液：7.5 μmol/L T_18AB+工作缓冲溶液+7.5μmol/L无标记-CCP2；(5)(4)+0.13 mmol/L黄藤素；(6)(4)+0.13mmol/L黄连素；(7)(4)+0.03 mmol/L新霉素；(8)(4)+0.13mmol/L四环素；(9)(4)+0.13 mmol/L卡那霉素；(10)(4)+0.13mmol/L DAPI；(11)(4)+0.13 mmol/L EB。配制待测溶液的时候需要卡表，每间隔5分钟配一个样，保留30分钟后开始测量。

2.圆二色谱的测定

配制好待测样品，保留30分钟后开始测量，首先打开氮气的阀门，通氮气吹扫10min左右，再打开电源，打开电脑和软件，将步长设置为1nm，宽带设置为1nm，响应时间设置为0.25s，采用圆二色谱仪扫描溶液在200～320nm的光谱图，每一个样要扫描3次，样品平均扣除空白缓冲溶液平均得到每个对应样的结果。

可行性分析

为了检验双标记DNA序列(CCP2)筛选三螺旋DNA嵌入剂实验可行性。选择了比较经典的稳定三螺旋DNA的嵌入剂(黄连素)进行试验，测试如下：(a)CCP2+精胺；(b)CCP2+T_18AB+精胺；(c)CCP2+5 μmol/L T_18AB+黄连素+精胺的三种反应溶液，结果如图1所示。

20mmol/L PBS(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄磷酸缓冲盐溶液，pH 7.5，含15 mmol/L NaNO₃)缓冲溶液，0.06mmol/L精胺，混合保留时间55分钟。 (a)100nmol/L CCP2；(b)a+100nmol/LT_18AB；(c)b+4μmol/L 黄连素。

上述实验结果表明，当反应溶液中没有T_18AB和黄连素时，荧光强度较弱(如图1曲线a)；当反应溶液中有T_18AB但无黄连素时，荧光强度略有增强(曲线b)，说明有少量三螺旋DNA形成；当反应溶液中同时有T_18AB和黄连素存在时，荧光强度明显增强(曲线c)，说明黄连素有稳定三螺旋DNA的效果。该结果表明利用双标记DNA序列 (CCP2)作为传感器序列筛选稳定三螺旋DNA的嵌入剂切实可行。

实验机理的探讨

为了进一步证明双标记DNA序列(CCP2)作为传感器序列筛选嵌入剂的实验可行性，考察了黄连素对稳定三螺旋DNA的作用机理，采用圆二色谱对有无黄连素的溶液进行研究。20mmol/L PBS(pH 7.5，含15mmol/L NaCl，0.06mmol/L精胺)缓冲溶液，反应溶液保留30分钟。(a)7.5μmol/L CCP2；(b)a+7.5μmol/L T_18AB；(c) b+0.13mmol/L黄连素。

如图2所示，210nm处的负峰为三螺旋DNA的特征峰，当溶液中无黄连素存在时，在210nm处有一个较弱的负圆二色峰(曲线b)，这是由于形成少量三螺旋DNA的缘故；但当溶液中存在黄连素时，210 nm处的负圆二色峰变得更强(曲线c)，说明黄连素在该体系中促进了三螺旋DNA形成。该实验结果表明，实验可行性分析中加入黄连素导致的荧光增强是通过其稳定三螺旋DNA引起。

精胺浓度对体系的影响

双标记荧光法筛选三螺旋DNA嵌入剂的传感器受多种因素的影响，为了获得加入相同量嵌入剂(黄连素)产生最大信号变化值，对影响溶液荧光值的实验条件进行优化，以便加入嵌入剂能产生最大荧光值改变值ΔI_f(ΔI_f＝I_f-I_f0)(I_f：有黄连素；I_f0：无黄连素)。测量溶液在694-750nm波长范围的荧光光谱图，结果见图3所示。

20mmol/L PBS(pH 7.5，含15mmol/L NaNO₃)缓冲溶液，100 nmol/L T_18AB，100nmol/L CCP2。(A)不同精胺浓度溶液在705nm 的荧光强度(a：无黄连素，b：有4μmol/L黄连素)；(B)不同精胺浓度下加与不加黄连素的溶液荧光强度的增加百分比。精胺的浓度分别为0.02mmol/L、0.06mmol/L、0.12mmol/L、0.18mmol/L、 0.30mmol/L。

如图3所示，虽然加与不加黄连素溶液的荧光强度差异随着精胺浓度的增加而增加(图A)，但荧光强度增加百分比在精胺浓度为0.06 mmol/L时最高(图B)，当精胺浓度小于或大于0.06mmol/L时，溶液加与不加黄连素导致的荧光强度增加的百分比明显更低，因此，选择浓度为0.06mmol/L的精胺作为最佳实验条件。

缓冲溶液pH值对体系的影响

双标记荧光法筛选三螺旋DNA嵌入剂的传感器受多种因素的影响，为了获得加入相同量嵌入剂(黄连素)产生最大信号变化值，对影响溶液荧光值的实验条件进行优化，以便加入黄连素能产生最大荧光值改变值ΔI_f(ΔI_f＝I_f-I_f0)(I_f：有黄连素；I_f0：无黄连素)。

20mmol/L PBS(pH 7.5，含15mmol/L NaNO₃)缓冲溶液，100nmol/L T_18AB，100nmol/LCCP2，精胺反应浓度为0.06mmol/L，混合溶液保留55分钟。(A)不同pH溶液在705nm的荧光强度(a：无黄连素， b：有4μmol/L黄连素)；(B)不同pH下加与不加黄连素的溶液荧光强度的增加百分比。

如图4所示，虽然pH为7.3时加与不加黄连素的溶液荧光强度的增加百分比最大(图B)，但pH为7.3时有无黄连素溶液的荧光背景较高(图A)，所以不选用pH 7.3作为最佳实验条件，而当pH 为7.5时，有无黄连素溶液的荧光背景相对较低，加与不加黄连素溶液的荧光强度增加的百分比也比较合适，因此，选择pH值为7.5的缓冲溶液作为最佳实验条件。

不同有机药物分子溶液的荧光光谱

为了筛选稳定三螺旋DNA的嵌入剂，考察了Coralyne(Cor)、黄藤素(Pal)、黄连素(Ber)、新霉素(Neo)、四环素(TC)、卡那霉素(Kan)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、EB等8种有机药物分子与传感器作用的荧光光谱，记录含有不同有机药物分子的反应溶液在波长λ为705nm处的荧光强度，并根据所测结果绘图6。 20mmol/L PBS(pH 7.5，含15mmol/LNaNO₃)缓冲溶液，0.06mmol/L 精胺，100nmol/L T_18AB，100nmol/L CCP2，混合保留时间55分钟。 (A)有机药物分子分别为：(a)无药物分子，(b)8μmol/L新霉素，(c)8μmol/L黄藤素，(d)8μmol/L黄连素，(e)2μmol/L Coralyne；(B)有机药物分子分别为：(a)无药物分子，(f)8μmol/L EB，(g)8μmol/L DAPI，(h)8μmol/L卡那霉素，(i)8μmol/L 四环素。

如图5和图6所示，加入黄藤素、黄连素、新霉素荧光值都有所增强，说明这些有机药物分子有稳定三螺旋DNA的作用；加入卡那霉素、四环素的反应溶液荧光强度增加较弱，说明它们稳定三螺旋DNA 的作用不明显；然而加入EB、DAPI等荧光值降低，说明它们对该体系的三螺旋DNA没有稳定作用。

不同有机药物分子对荧光团荧光的影响

为了考察荧光增强是否由有机药物分子干扰双标记DNA荧光团的荧光导致，去掉参与形成三螺旋的无标记双链DNA(T_18AB)开展荧光试验。如图7所示，与无药物分子(Blank)的荧光强度相比，存在不同有机药物分子的溶液荧光强度变化不大。该结果表明，前图6存在不同有机药物分子引起的荧光增强，是由于对应药物稳定三螺旋 DNA导致荧光强度的增长，而不是药物本身干扰双标记荧光团的荧光引起的变化；而荧光强度的降低基本上是由于有机药物分子稳定双标记CCP2的茎部分导致的。

不同有机药物分子本身的荧光背景

为了进一步考察荧光是不是有机药物分子本身被激发产生的，做了一组无标记DNA序列的选择性分析。20mmol/L PBS(pH 7.5，含 15mmol/L NaNO₃)缓冲溶液，0.06mmol/L精胺，100nmol/L T_18AB， 100nmol/L CCP2(无标记)，混合保留时间55分钟。有机药物分子分别为：无药物分子，8μmol/L黄藤素，8μmol/L黄连素，2μmol/L Coralyne，8μmol/L新霉素，8μmol/L四环素，8μmol/L卡那霉素， 8μmol/L DAPI，8μmol/L EB。

如图8所示，与无药物分子(Blank)的荧光强度相比，存在不同药物分子的溶液荧光强度变化不大。该结果表明，前图6存在不同药物分子引起的荧光增强，是由于对应药物稳定三螺旋DNA导致荧光强度的增长，而不是有机药物分子本身被激发产生的荧光强度。

筛选三螺旋DNA嵌入剂的圆二色谱

为了考察存在不同有机药物分子引起的溶液荧光强度变化是否由三螺旋DNA形成引起，采用圆二色谱对存在不同有机药物分子的溶液进行研究。

实验方案同圆二色光谱的测定的实验步骤一样，配制好待测溶液，采用圆二色谱仪扫描溶液在200～320nm的光谱图。

20mmol/L PBS(pH 7.5，含15mmol/L NaCl，0.06mmol/L精胺)缓冲溶液，7.5μmol/L CCP2，7.5μmol/L T_18AB，反应溶液保留30分钟。(A)有机药物分子分别为：(a)无有机药物分子，(b) 0.13mmol/L Coralyne，(c)0.13mmol/L黄藤素，(d)0.13mmol/L 黄连素，(e)0.03mmol/L新霉素；(B)有机药物分子分别为： (a)无有机药物分子，(f)0.13mmol/L四环素，(g)0.13mmol/L 卡那霉素；(h)0.13mmol/L DAPI，(i)0.13mmol/L EB。

如图9所示，无药物分子的无标记DNA溶液在210nm处有一个负圆二色峰，说明有少量三螺旋DNA形成。然而，当溶液中存在黄藤素、黄连素、新霉素时，210nm处的负圆二色谱峰明显增强，说明它们促进了三螺旋DNA的形成，有稳定三螺旋的作用；而卡那霉素也有稳定三螺旋DNA的作用，只是相对较弱；EB和四环素则没有对应的变化，说明基本没有稳定三螺旋DNA的作用。圆二色谱实验结果与荧光光谱结果基本一致。

序列表

<110> 贵州理工学院

<120> 一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> MB

<400> 1

gtggagttct ttcttctctt tcctctccac 30

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> T18A

<400> 2

aagaaagaag agaaagga 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> T18B

<400> 3

tcctttctct tctttctt 18

Claims

1.一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器，其特征在于：所述的传感器包含一条具有茎环结构的双标记DNA CCP2和一条双螺旋DNA T18AB，所述的双标记DNA序列如所示SEQ ID No.1，所述的双螺旋DNA序列如SEQ ID No.2和SEQID No.3所示；所述的传感器的工作条件为：5～50mmol/L PBS作为工作缓冲溶液，0.01～0.15mmol/L精胺，传感器序列CCP2与T_18AB均为20～200nmol/L；所述的PBS中包含15mmol/L NaNO₃。

2.根据权利要求1所述的一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器，其特征在于：所述的传感器还包含精胺。

3.根据权利要求1所述的一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器，其特征在于：所述的嵌入剂包含黄藤素和新霉素。

4.根据权利要求1所述的一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器，其特征在于：优选的，所述的传感器的工作条件为：20mmol/L PBS作为工作缓冲溶液，0.06mmol/L精胺，传感器序列CCP2与T_18AB均为100nmol/L。