CN106442690A - 基于卟啉与dna双螺旋的沟槽镶嵌作用的无标记dna的ecl检测方法 - Google Patents

基于卟啉与dna双螺旋的沟槽镶嵌作用的无标记dna的ecl检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于卟啉与DNA双螺旋的沟槽镶嵌作用的无标记DNA的ECL检测方法，通过固定在电极上的cDNA与目标DNA缔合后，引入互补配位的引物引发杂交链式反应，延长游离的末端达到纳米级长的双螺旋，并鉴于卟啉可插入作为支架的双链DNA的沟槽，大量ZnPPIX分子作为高效的ECL信号源，原位地将卟啉‑dsDNA复合物转变为杂化的ECL纳米链，形成了一个显著的ECL信号放大，其ECL光强与tDNA浓度呈正比。本检测方法灵敏度高，检测下限可达亚飞摩尔水平，拓展了以卟啉为中心的生物分析应用的范围。

Description

基于卟啉与DNA双螺旋的沟槽镶嵌作用的无标记DNA的ECL检 测方法
技术领域
本发明属于DNA生物传感器领域，涉及一种基于卟啉与DNA双螺旋的沟槽镶嵌作用的无标记DNA的ECL检测方法。
背景技术
以DNA结构材料为基础的检测在医疗诊断、食品分析、生化袭击、环境监测等方面有非常重要的作用。DNA结构材料构建过程的信号放大策略也发展起来。目前常用的核酸探针信号放大策略主要包括聚合酶链式(PCR)放大技术、杂交链反应(HCR)放大技术、DNAzyme信号放大技术、滚环(RCA)放大技术及链置换(SDA)技术等。
HCR技术以核酸链之间竞争杂交作用为基础实现信号放大，可以在室温下进行，不需要变温和其它酶的辅助，特别适于检测应用。HCR技术的反应机理为发夹型探针H1和H2二者在溶液中均能稳定存在，不会相互杂交而彼此打开，当目标DNA存在时，H1可以与目标DNA部分互补，从而打开发卡的颈部，伸出一条臂来，与H2部分互补配对，使H2的末端露出再与H1互补，如此依次循环打开，延伸DNA链，实现信号放大。HCR作为无酶信号放大技术，简单易于操作，在核酸的分析检测中表现出极大的优势，已经成为核酸放大策略的理想选择。
化学发光(CL)是由化学反应引起的发光现象。大多数CL是由氧化还原反应引起的，常存在试剂不稳定、难以实现时间和空间上的控制、CL试剂难以重复使用和溶液混合不均匀所带来的重现性相对较差等问题。ECL分析法除了具有CL分析法所具有的灵敏度高、线性范围宽和仪器简单等优点外，还具有电化学方法的许多优点：(1)采用电化学方法可以很容易改变物质的氧化还原能力，可选择更加稳定的试剂、便于电化学可逆的物质的循环利用和便于实现需要极端不稳定的试剂参与的化学发光分析；(2)由于发光是通过电化学激发的，便于调节发光的时间和空间；(3)可以同时提供电流信号，便于发光机理研究等。
基于HCR反应的CL检测，将信号因子——联吡啶钌，作为标记嵌入HCR反应后的双链DNA沟槽中(Xu J,et.al.Manganese Porphyrin-dsDNA Complex:A Mimicking Enzymefor Highly Efficient Bioanalysis[J].Anal.Chem.,2013,85:3374～3379)。受常规联吡啶钌分子的电子结构启发，具有相对较低HOMO和LUMO能级、存在金属-配体电荷传递的金属卟啉经理论推测可成为阴极ECL的备选发光体，并经实验证实其代表性配合物ZnPPIX有极佳的发光性能。卟啉分子具有良好的生物相容性，相比经典光电分子联吡啶钌更加适合用于生物传感器。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简易的基于卟啉与DNA双螺旋的沟槽镶嵌作用的无标记DNA的ECL检测方法，该方法基于卟啉与DNA双螺旋的沟槽镶嵌作用，实现无标记DNA的ECL检测，利用DNA纳米结构的空间组合，通过形成杂化的ECL组装体实现对DNA的灵敏检测。
实现本发明目的的技术解决方案为：
基于卟啉与DNA双螺旋的沟槽镶嵌作用的无标记DNA的ECL检测方法，采用DNA纳米技术，以纳米金为基底，固定cDNA，顶端利用cDNA与tDNA互补形成双链DNA大沟槽，与卟啉的相互作用结合信号分子，利用卟啉的光电特性，以电致化学发光作为检测手段，构建DNA检测用的ECL生物传感器，具体步骤如下：
步骤1，在经打磨、去除杂质的玻碳电极表面滴加纳米金溶液，室温干燥，清洗后氮气吹干；
步骤2，将巯基化的cDNA溶液滴加在纳米金修饰的电极表面，水汽饱和条件下过夜，之后用PBS缓冲液洗去未结合的巯基化的cDNA，然后滴加6-巯基-1己醇(MCH)封闭，防止非特异性吸附，PBS缓冲液冲洗未结合的MCH，之后将待检测的tDNA滴加到电极表面，水汽饱和条件下孵育，PBS缓冲液冲洗后，滴加发卡探针H1和H2到电极表面，水汽饱和条件下孵育3～4h，PBS缓冲液冲洗，最后滴加锌卟啉(ZnPPIX)溶液到电极表面，孵育；
步骤3，以步骤2得到的电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，以0.1M四丁基高氯酸铵(TBAP)的二氯甲烷(DCM)溶液为电解液，采用循环伏安法检测ECL信号，调节电位为-2.2～0V，扫描速度为100mV S-1，根据tDNA浓度对数值与ECL信号变化值的线性关系式计算出tDNA的浓度，得出待测液中tDNA的含量。
步骤1中，所述的纳米金的半径为5-20nm。
步骤2中，所述的巯基化的cDNA溶液为含有三(2-羧基乙基)膦(TCEP)和cDNA的PBS溶液，PBS溶液的浓度为0.01M，pH＝4，三(2-羧基乙基)膦(TCEP)的浓度为100μM，cDNA的浓度为1μM。
步骤2中，所述的PBS缓冲液的浓度为0.01M，pH＝7.4。
步骤2中，ZnPPIX溶液为含有NaCl和ZnPPIX的PBS溶液，PBS溶液的浓度为0.01M,pH＝7.4，NaCl的浓度为0.5M，ZnPPIX的浓度为50μM。
本发明以生物相容性好的阴极发光材料锌卟啉为信号分子，利用卟啉与DNA的结合作用，采用了HCR放大技术，提高了传感器的灵敏度和信噪比，可以有效的区分碱基错配序列，能够应对基因多态性的检测问题。
附图说明
图1为本发明的基于卟啉与DNA双螺旋的沟槽镶嵌作用的无标记DNA的ECL检测方法的流程示意图。
图2为电极组装过程中各阶段的ECL信号图，其中，a为HCR放大后，b为未经HCR放大，c为tDNA/cDNA-BSA/AuNPs/GCE，d为cDNA-BSA/AuNPs/GCE，e为AuNPs/GCE，f为裸电极。
图3为HCR反应电泳结果图。
图4为HCR反应时间与ECL强度曲线关系图。
图5为tDNA、单碱基错配、双碱基错配和三碱基错配的ECL检测结果图。
具体实施方式
本发明中的纳米金的合成按现有方法制备，实施例参考文献【Jie J F,et.al.CdSnanrystal-based electrochemiluminescence biosensor for the detection of low-density lipoprotein by increasing sensitivity with gold nanoparticleamplification[J].Anal.Chem.,79:5574～5581.】制备得到，具体步骤为：将100mL含0.01wt.％氯金酸的水溶液搅拌加热并保持沸腾，迅速加入2.5mL含1.0wt.％的三水合柠檬酸钠，持续搅拌待溶液颜色变为酒红色并维持15～20min，搅拌冷却至室温，制得纳米金。
实施例中使用的DNA序列如下：
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
实施例1
传感器的制备与检测
5mm直径玻碳电极(GCE)分别在0.3nm、0.05nm氧化铝的麂皮上面各抛光3min，每次皆以超纯水冲洗掉吸附在电极表面的氧化铝，之后以丙酮、乙醇、去离子水超声，氮气吹干待用。发卡探针H1和H2先在95℃条件下孵育5min之后降至室温1h用以活化。SH-cDNA用10mMPBS配制成1μM溶液，并加入TCEP防止巯基之间形成二硫键，溶液中TCEP的浓度为100μM。
将25μL上述步骤合成的纳米金修饰电极，室温干燥，超纯水滴洗后氮气吹干。将20μL SH-cDNA滴涂在纳米金修饰的电极表面，水汽饱和条件下室温过夜；之后以PBS缓冲液轻轻冲洗掉未吸附的SH-cDNA，以1mM MCH封闭2h；PBS缓冲液冲洗后，修饰20μL不同浓度的tDNA，设浓度梯度为10-11M～10-7M tDNA滴加于电极表面，水汽饱和条件下37℃孵育3h；洗去未与cDNA结合的tDNA，将10μL H1(1μM)和10μLH2(1μM)混合滴加在电极表面，水汽饱和条件下37℃孵育3h；PBS缓冲液轻柔冲洗后，以50μM ZnPPIX的PBS溶液修饰传感表面，孵育4h。
电极组装过程中，以Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，调节电位为-2～0V，扫描速度为100mV S-1，在3mL以TBAP作为电介质，浓度为0.1M的DCM溶液中，以电致化学发光检测系统检测各阶段的ECL信号，结果如图2所示。
如图2所示，a为0.01μM目标核酸存在下通过HCR放大后的ECL，b为0.01μM目标核酸存在下无HCR放大步骤的ECL，c为tDNA/cDNA-BSA/AuNPs/GCE，d为cDNA-BSA/AuNPs/GCE，e为AuNPs/GCE(e)，f为裸电极。结果表明只有加入ZnPPIX之后才能检测到电致化学发光现象(c，d，e，f均无ECL信号)；且通过HCR反应延长DNA链进行信号放大之后，同样浓度目标核酸的条件下，ECL信号强度相差近十倍(如图所示a与b之间)，说明通过HCR策略对信号放大的效果非常明显，可以使检测限变低。
实施例2
1、HCR反应核酸分子量观察，其步骤如下：
2.5％的琼脂糖凝胶以TBE缓冲液配制，加入10μL EB/100mL溶液混匀，微波炉加热5min，待温度降至50℃左右倒入模板冷却成胶。将各泳道样品通过溴酚蓝染色后，各取6μM分别滴加。电压设为80mV，时间为90min。泳道1为购买自上海生工的50-1000bp DNALadder-H2；泳道2为10μM H1、10μM H2、0.1μM tDNA的10mM pH7.4PBS 37℃加速反应2h后的溶液；3为10μM H1的PBS溶液；4为10μM H2的PBS溶液；5、6为空白。如图3所示，通过一段时间，H1、H2的条带移动距离最远，而HCR反应后的溶液显示聚集在条带开始处的离散带，从而说明HCR反应后溶液中的DNA分子量变大，序列变长，且独立的H1、H2几乎不存在，说明HCR反应的发生并且效率很高。
2、HCR反应时间的优化
本实施例中传感器的制备与检测与实施例1相同，不同的是将H1和H2的孵育时间为1～6h，结果如图4所示。
在电化学适体传感器的制备过程中，通过杂交链式反应在电极表面得到大量H1和H2双链复合物的步骤尤为关键，它直接决定了传感器的电化学响应性能。
对于不同孵育时间的传感器，进行ECL以Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，调节电位为-2～0V，扫描速度为100mV S-1，在3mL以TBAP作为电介质，浓度为0.1M的DCM溶液中以电致化学发光检测系统检测ECL信号。确定最佳反应时间。如图4所示是参与杂交链式反应的H1和H2反应时间与电致化学发光强度的关系图。由图示看出，当两小时以上时，强度增加变慢，三小时后有平稳的趋势，因此将HCR反应时间定为3h。
实施例3
25μL纳米金修饰处理好的GCE，干燥后将20μL SH-cDNA滴涂在纳米金修饰的电极表面，室温过夜；PBS缓冲液冲洗后，以10μL 1mM MCH封闭2h，修饰20μL不同浓度的tDNA，设浓度梯度为10-11M～10-7M，37℃孵育3h；洗去未与cDNA结合的tDNA，以10μL H1(1μM)和10μLH2(1μM)混合滴加在电极表面，37℃孵育3h；最后以50μM ZnPPIX的PBS溶液修饰传感表面，室温孵育4h。整个过程水汽饱和，每一步以PBS缓冲液轻轻冲洗。
将tDNA替换为单碱基，双碱基和三碱基的错配DNA，按照上述相同步骤构建传感器。
以tDNA以及错配DNA构建的玻碳电极作为工作电极，以Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，调节电位为-2～0V，扫描速度为100mV S-1，在3mL以TBAP作为电介质，浓度为0.1M的DCM溶液中以电致化学发光检测系统检测ECL信号，结果如图5所示。由图5A可以看出，随着目标DNA浓度的增加，电致化学发光强度相应增加。内插图说明浓度与发光强度的呈线性关系。碱基错配的ECL说明传感器具有很高的检测灵敏度与抗干扰能力，且仅以溶解氧作为共反应剂的条件下，检测下限达到10-11M，证明该种传感策略有很高的检测灵敏度。图5B可以看到碱基错配的ECL，说明传感策略有很高的抗干扰能力，能够有效的区分碱基错配，可以成功的应对单基因多态性的检测问题，具有很好的实用性。综上所述，本发明的无标记核酸分析手段，简单方便，便宜易操作，高效灵敏，可进一步发展为检测生物标志物核酸序列的生物医学传感，用于疾病的诊断。

Claims (5)

1.基于卟啉与DNA双螺旋的沟槽镶嵌作用的无标记DNA的ECL检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1，在经打磨、去除杂质的玻碳电极表面滴加纳米金溶液，室温干燥，清洗后氮气吹干；
步骤2，将巯基化的cDNA溶液滴加在纳米金修饰的电极表面，水汽饱和条件下过夜，之后用PBS缓冲液洗去未结合的巯基化的cDNA，然后滴加6-巯基-1己醇封闭，防止非特异性吸附，PBS缓冲液冲洗未结合的6-巯基-1己醇，之后将待检测的tDNA滴加到电极表面，水汽饱和条件下孵育，PBS缓冲液冲洗后，滴加发卡探针H1和H2到电极表面，水汽饱和条件下孵育3～4h，PBS缓冲液冲洗，最后滴加锌卟啉溶液到电极表面，孵育；
步骤3，以步骤2得到的电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，以0.1M四丁基高氯酸铵的二氯甲烷溶液为电解液，采用循环伏安法检测ECL信号，调节电位为-2.2～0V，扫描速度为100mV S-1，根据tDNA浓度对数值与ECL信号变化值的线性关系式计算出tDNA的浓度，得出待测液中tDNA的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1中，所述的纳米金的半径为5-20nm。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤2中，所述的巯基化的cDNA溶液为含有三(2-羧基乙基)膦和cDNA的PBS溶液，PBS溶液的浓度为0.01M，pH＝4，三(2-羧基乙基)膦的浓度为100μM，cDNA的浓度为1μM。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤2中，所述的PBS缓冲液的浓度为0.01M，pH＝7.4。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤2中，锌卟啉溶液为含有NaCl和锌卟啉的PBS溶液，PBS溶液的浓度为0.01M，pH＝7.4，NaCl的浓度为0.5M，锌卟啉的浓度为50μM。
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