CN103698375A - 一种检测miRNA的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测miRNAs的方法,其包括:(1)合成DNA四面体探针;(2)将所述的DNA四面体探针的三个顶点连接到电化学装置的工作电极表面,即得带有捕获探针的工作电极;(3)向反应体系中加入待测目标miRNAs、信号探针和辅助链进行杂交反应形成复合体I,再将工作电极浸入反应体系中进行杂交反应形成复合体II;(4)将复合体II与能催化氧化还原反应的酶进行反应;(5)加入所述的酶催化反应的底物,进行电化学检测分析。本发明无需对目标miRNAs进行标记,也无需对miRNAs进行预先PCR扩增,即可直接采用本发明的方法进行检测,操作简单,从而大大降低了实验成本,提高了实验效率。
Description
技术领域
本发明属于核酸杂交检测领域,涉及一种检测miRNA的方法,具体地,本发明涉及一种基于DNA三维纳米结构自支撑界面、采用电化学间隙分析手段检测miRNA的方法。
背景技术
微小RNA(miRNAs)是一类新发现的长度为19-23个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA,广泛存在于各种生物体的不同器官中,主要是通过特异识别靶信使RNA(mRNA)调控mRNA的表达。对人类基因组的研究表明,miRNAs不仅在细胞发育的一系列过程中起着重要的调控作用,而且miRNA的表达与疾病的发生发展有关,尤其值得关注的是与人类多种类型的癌症直接相关(Nature Reviews Cancer,2006,6,259-269)。近来,一些研究发现,miRNAs可以在血清或唾液中稳定存在而不被降解(Proc.Natl.Acad.Sci,2008,05,10513-10518),许多疾病患者的血清或唾液中的一些miRNAs的表达明显与正常人不同,加上取材的相对无创性,突显了miRNAs作为早期诊断和无创诊断癌症标志物的价值和意义。
无论是基础生物学研究还是癌症的早期诊断和筛选都迫切需要定量检测miRNAs的方法,然而由于miRNAs在体内的含量极少,序列短,相似性高并且容易被环境中的RNA酶降解等难点使得miRNAs的检测一直面临很多的技术挑战。Northern blotting一直被公认为是miRNAs检测的黄金标准方法,但是由于它操作繁琐,费时费力,灵敏度相对较低并且样品需要量大(10μg样品)等缺点使得它不适用于常规的临床诊断。定量PCR(qPCR)和微芯片技术也是人们常用的miRNAs检测方法,如中国专利CN201010119369.6公开了一种基于荧光定量PCR方法应用特别设计的引物和合成的MGB探针对成熟miRNAs进行检测、鉴定的实验试剂设计、制备与技术方法应用;2004年Liu等首次发表了利用微阵列芯片在哺乳动物的不同肿瘤细胞中检测到了245个miRNAs,而且被Northern blotting和qPCR所证实(Nature,2005,435,834-838);中国专利CN101608232A公开了一种新型的微小RNA芯片,用于筛选和检测那些已被鉴定或预测的内源性微小RNA,该方法可以灵敏地检测到细胞/组织中低丰度表达的微小RNA分子,可用于鉴定和比较细胞分化前后微小RNA的变化,以及诊断和评价肿瘤细胞的来源和分化程度。但这些方法常常需要昂贵的仪器和复杂的操作以及对miRNAs进行标记等,无法满足miRNAs床边检测(point-of-care tests,POCTs)的全部要求,例如不需要标记,不需要放大,在检测非常少的血清样品中miRNAs时具有足够高的灵敏度和选择性,能够很好地区分miRNAs家族中1~2碱基的错配,廉价且便携,适用于小型临床或者家庭诊断等。
电化学传感器被认为是最有希望实现POCT的器件,目前已经有一些廉价而且小体积的电化学检测器存在(如基于电化学原理的家用血糖仪)(Nat.Protoc.,2007.2,2888-2895;Nature Chemistry,2011.3,697-703)。但是电化学DNA传感器的灵敏度常常由于异相电极表面的传质过程减慢和表面拥挤效应的影响使探针分子与目标DNA或RNA分子之间很难接触而受限制。目前的电化学传感器检测miRNAs的方法需要对miRNAs进行电活性标记或者操作步骤比较复杂,并且灵敏度都不高,只能检测pM-fM水平的miRNAs,不能满足在不进行PCR前处理情况下直接检测十分微量的miRNAs的要求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有的miRNAs检测技术一般都存在灵敏度低、检测耗时长、操作复杂且成本高等缺陷,而提供一种普适性的、灵敏度高、检测方便快捷、成本低的miRNAs定量检测方法。本发明在对miRNAs进行定量检测时,无需对目标miRNAs进行标记,也无需对miRNAs进行预先PCR扩增,即可直接采用本发明的方法进行检测,操作简单,从而大大降低了实验成本,提高了实验效率。
本发明的发明人利用DNA三维纳米结构自支撑、抗蛋白质吸附表面等优点,将一个顶点延伸出一段miRNA的识别序列,其它三个顶点含有巯基基团的三维DNA纳米结构的四面体探针通过金-硫键作用固定在金电极表面,发现这种电极具有无需其他辅助分子(如巯基己醇等)维持DNA探针在界面上的形态、取向;抗蛋白质吸附表面,可以抵抗非特异性吸附,背景信号小,可大大提高检测信噪比;有效地控制了表面组装密度,充分保证了探针的识别活性,避免了探针之间的相互作用。本发明人采用间隙分析法模式,miRNAs在信号探针和捕获探针与辅助链杂交的间隙与辅助链杂交,发现间隙分析方法提高了错配识别能力,特异性好,有利于具有高度相似的序列和高度同源性的miRNAs检测。本发明在此基础上,提供下述技术方案。
本发明提供的技术方案之一是:一种基于DNA三维纳米结构自支撑界面检测miRNAs的方法,包括以下步骤:
(1)通过DNA纳米自组装技术一步法合成DNA四面体探针;
(2)将步骤(1)所述的DNA四面体探针的三个顶点通过自组装连接到电化学装置的工作电极表面,另一个顶点延伸出一段游离的miRNAs识别序列,即得带有捕获探针的工作电极;
(3)向反应体系中加入待测目标miRNAs、信号探针和辅助链进行杂交反应形成复合体I,再将步骤(2)所述的带有捕获探针的工作电极浸入反应体系中,使捕获探针与复合体I进行杂交反应,在工作电极表面形成复合体II,所述信号探针的游离端修饰有基团X,所述辅助链的一端具有与信号探针相互补结合的序列,所述辅助链的另一端具有与捕获探针相互补结合的序列,所述辅助链的中间区段具有与待测目标miRNAs相互补结合的序列;
(4)将步骤(3)所得的复合体II与能催化氧化还原反应的酶进行反应,使所述酶连接于信号探针的游离端,所述酶修饰有能与步骤(3)中所述的基团X特异性结合的基团Y;
(5)加入步骤(4)所述的酶催化反应的底物,进行电化学检测分析。
本发明中,步骤(1)为通过DNA纳米自组装技术一步法合成DNA四面体探针;其中,所述的DNA纳米自组装技术为本领域常规所述,检测所有miRNAs的DNA四面体探针都可以使用同一种四面体探针,为一步法合成制得。目前在本领域内,一步法合成DNA四面体探针为常规的技术,一般由四条单链DNA通过自组装而得,如中国专利CN102899418A中就提到以四条DNA单链自组装形成一个DNA四面体探针。
在本发明中,所述的DNA四面体探针如常规所述,较佳地,所述的DNA四面体探针由序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的4条ssDNA单链通过自组装形成。优选地,所述的序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的4条ssDNA单链可以用低盐浓度的缓冲液配制,如TE缓冲溶液(10mM Tris,1mM EDTA,pH8.0),本发明优选将溶于低盐浓度的缓冲液中的该4条ssDNA单链与TCEP(三(2-羧乙基)膦)和TM缓冲溶液(20mM Tris,50mM MgCl2,pH8.0)混合以制备所述的DNA四面体探针,更优选在制备DNA四面体探针的过程中,所述的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的4条ssDNA单链的浓度比为1:1:1:1,较佳的浓度为4条ssDNA单链分别都为0.5~2μM。优选地,所述的一步法合成DNA四面体探针可以采用控温仪进行操作,较佳地,所述的一步法合成DNA四面体探针可以采用控温仪控制90~95℃加热2~10min,迅速降温到4~10℃,持续20s以上,所述的控温仪优选PCR仪。最优选地,步骤(1)所述的一步法合成DNA四面体探针通过以下步骤实现:将序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的4条ssDNA单链分别溶解在TE缓冲溶液(10mM Tris,1mMEDTA,pH8.0)中,使终浓度分别都为为50μM,取50μM的序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的四条链各1μL、30mM的TCEP5μL和TM缓冲溶液(20mM Tris,50mM MgCl2,pH8.0)41μL混合均匀,然后于95℃加热2min,迅速降温到4℃,持续30s以上,用PCR仪控温,得到终浓度为1μM的四面体捕获探针。
本发明中,步骤(2)为将步骤(1)所述的DNA四面体探针的三个顶点连接到电化学装置的工作电极表面,另一个顶点延伸出一段游离的miRNAs识别序列,即得捕获探针。其中,所述的电化学装置的工作电极为本领域常规所述,可以是金电极,也可以是玻碳电极、芯片电极、印刷电极等,较佳地是2mm直径的金电极。所述的DNA四面体探针的三个顶点连接到电化学装置的工作电极表面,可以通过共价自组装连接,较佳地是使用巯基和金之间的金硫键,即采用三个顶点修饰有巯基的DNA四面体探针,与金电极结合。本发明优选将3μL的1μM三个顶点修饰有巯基的DNA四面体探针滴加到金电极表面于室温反应过夜,更优选地,用电极帽盖住电极,减少电极表面溶液的蒸发,防止液体蒸干后DNA三维纳米结构探针变形。
本发明中,步骤(3)为向反应体系中加入待测目标miRNAs、信号探针和辅助链进行杂交反应形成复合体I,再将步骤(2)所述的带有捕获探针的工作电极浸入反应体系中,使捕获探针与复合体I进行杂交反应,在工作电极表面形成复合体II,所述信号探针的游离端修饰有基团X,所述辅助链的一端具有与信号探针相互补结合的序列,所述辅助链的另一端具有与捕获探针相互补结合的序列,所述辅助链的中间区段具有与待测目标miRNAs相互补结合的序列。
其中,所述的信号探针为通用信号探针,可以用于检测任意的目标miRNAs,所述的基团X用于后续反应中与其他基团特异性结合以连通信号探针和反应体系中的其它结构。本发明所述的信号探针较佳地是生物素修饰或地高辛(Digoxigenin)修饰的通用信号探针,本发明优选信号探针的序列为5'-Biotin-AGG TCG CA-3'。
所述的捕获探针即为将步骤(1)所述的DNA四面体探针的三个顶点通过自组装连接到电化学装置的工作电极表面,另一个顶点延伸出一段游离的miRNAs识别序列所形成的探针,该捕获探针也是通用探针,可以用于检测任意的目标miRNAs。
所述的辅助链为一条ssDNA链,其具体的序列组成一般与待检测的目标miRNAs的序列有关。在所述的复合体II中,所述的辅助链的一端与通用信号探针互补结合,另一端与通用的捕获探针互补结合,形成的中间段间隙与待检测的目标miRNAs互补结合。在本发明的检测方法中,由于信号探针和捕获探针是通用的,与之相对应的辅助链的两端序列也相应可以是通用的,只需要根据待检测的目标miRNAs设计相应的辅助链的中间段序列即可,因此可以大大方便实验,降低实验成本。
优选地,步骤(3)为,首先将目标miRNA、生物素修饰的通用信号探针与辅助链预杂交,然后再与组装在工作电极表面的通用四面体探针杂交。更优选地,步骤(3)为,将目标miRNA、生物素修饰的通用信号探针(100~500nM)和辅助链(20~60nM)在含有0.8~1.2M NaCl和10~30mM MgCl2的5~15mM PB缓冲溶液(pH7.2~7.6)中混合,混合均匀之后于75~85℃变性4~10min,室温冷却15~30min后,将混合液加入RNase-free的小管中,然后将带有捕获探针的工作电极浸入小管中与目标miRNA、信号探针和辅助链进行孵育杂交,RNase-free的小管置于Eppendorf的舒适性恒温仪中,控温40~45℃,杂交反应30~60min后取出电极用0.01~0.02M PBS于20~30℃浸泡电极3~6min并用N2(或其他惰性气体)吹干。
本发明最优选地,步骤(3)为,将目标miRNA、生物素修饰的通用信号探针(100nM)和辅助链(50nM)在含有1M NaCl和20mM MgCl2的10mMPB缓冲溶液(pH7.4)中混合,混合均匀之后于80℃变性5min,室温冷却20min后,将混合液加入2mL RNase-free的小管中,然后将修饰了通用四面体探针的金电极浸入小管中与目标miNRA、信号探针和辅助链进行孵育杂交,2mL RNase-free的小管置于Eppendorf的舒适性恒温仪中,控温45℃,杂交反应30min后取出电极用0.01M PBS于25℃浸泡电极5min并用N2吹干。
本发明中,步骤(4)为将步骤(3)所得的复合体II与能催化氧化还原反应的酶进行反应,使所述酶连接于信号探针的游离端,所述酶修饰有能与步骤(3)中所述的基团X特异性结合的基团Y。其中,所述的能催化氧化还原反应的酶为本领域常规所述的具有催化氧化还原反应能力的酶,如可以是辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等氧化还原酶,但不限于此,较佳地是辣根过氧化物酶。在本发明中,步骤(3)所述信号探针的游离端修饰有基团X,该基团X与步骤(4)所述的基团Y能够特异性结合,从而将所述的信号探针的游离端和能催化氧化还原反应的酶通过该基团之间的特异性结合实现连接。例如,当信号探针的游离端修饰有地高辛(Digoxigenin)或生物素分子时,所述的能催化氧化还原反应的酶可以连接抗地高辛或抗生物素的分子,通过地高辛分子与抗地高辛分子或者生物素与抗生物素分子的结合连接所述酶和信号探针的游离端。
本发明中,步骤(5)为加入步骤(4)所述的酶催化反应的底物,进行电化学检测分析。其中,所述的催化反应的底物可以是TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)和双氧水,但不限于此,还可以是其他的底物,如ABTS[(2,2-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))]等,较佳地是TMB和双氧水。当以TMB作为底物检测时,高价态的TMB在电极表面得到电子被还原,从而产生可感知的电流信号,进而可以对待测样品中的目标miNRA进行检测分析。
本发明优选地,在每一步反应结束后可以用洗液洗去反应体系中的游离物,所用的洗液可以为0.1M~0.2M NaCl的低盐浓度的洗液,更优选地,所述的低盐浓度的洗液为0.01M PBS(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mMNa2HPO4,2mM KH2PO4,pH7.4)。所述用洗液洗去反应体系中的游离物所用的洗涤方式可以是常规,如直接持续冲洗10-20s或先浸泡后持续冲洗10s均可,更优选先在25℃条件下在0.01M PBS溶液中浸泡5min,浸泡过程中不断上下移动电极,以除去非特异吸附的物质,然后用0.01M PBS溶液持续冲洗10s。
在本发明中,除步骤(4)洗完电极后不需要吹干外,其他步骤都优选以N2(或其他惰性气体)将金电极吹干。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:本发明采用DNA三维纳米结构检测探针,并采用间隙分析方法,实现了对miRNAs(如前列腺癌相关miRNAs)的快速、高灵敏度和高特异性的定量检测。相对于现有技术,本发明有下述优势:
1、自支撑DNA纳米结构四面体探针,无需其他辅助分子(如巯基己醇等)维持DNA探针在界面上的形态、取向;四面体探针抗蛋白质吸附表面,既可以抵抗非特异性吸附,又非常适合用于酶放大检测体系,提高了生物传感器的性能。
2、采用同一种四面体捕获探针和同一种信号探针可以实现对多种miRNA的检测,不需要对每一种miRNA分别设计相应的检测探针和信号探针,这样不仅可以降低实验的成本,还可以简化实验操作,非常适用于高通量的miRNA检测和多元的miRNA检测。
3、本发明的检测方法灵敏度高,可以检测低至1aM的miRNAs;检测动态范围广泛,可以横跨11个数量级,可以满足不同要求的miRNAs检测;选择性强,能够很好地区分let-7家族所有miRNAs的碱基错配。
4、能够很好地适应实际应用中对样品中存在的微量miRNAs的检测,对于临床样品的检测只需要很少的样品量。
附图说明
图1(A)~(C)为本发明方法检测的流程示意图。
图2(A)为实施例1中本发明的分析方法在没有加入、加入1pM和加入1nM hsa-miR-141的循环伏安图及时间-电流(i-t)曲线图(图2(B))。
图3为实施例2中目标miRNA浓度与电流信号的对应关系图,待测hsa-miR-141的浓度依次分别为1aM、10aM、100aM、1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM。
图4为实施例3中四面体探针检测miRNAs的特异性图。图4(A)是利用helper-let-7a对let-7家族所有miRNAs的区分图,图4(B)是利用helper-let-7d对let-7家族所有miRNAs的区分图,所有miRNAs浓度为1pM。
图5为实施例4中本发明的分析方法对前列腺癌细胞及正常细胞中总RNA的表达分析图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
下述实施例中所述的“室温”是指本领域常规的进行试验的操作间的温度,一般为20~25℃。
实施例1
1、试剂和材料
为了方便说明,现将序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的4条ssDNA单链分别称为Tetra-A,Tetra-B,Tetra-C和Tetra-D,由该4条ssDNA单链通过自组装形成四面体DNA纳米结构探针。具体信息为:Tetra-A(75bp,分子量23028.0,ssDNA)、Tetra-B(55bp,分子量17018.0,5'端修饰巯基的ssDNA)、Tetra-C(55bp,分子量16898.0,5'端修饰巯基的ssDNA)和Tetra-D(55bp,分子量16877.0,5'端修饰巯基的ssDNA),该4条ssDNA单链均购自大连Takara生物工程有限公司。构成四面体结构探针的四条DNA含有三个结构域,每个结构域分别和其它三条单链DNA的相对应结构域互补(17对碱基互补),每条单链DNA分别围绕四面体结构的一个面一圈,在每个顶点处含有两个碱基(非互补,柔性)起弯折作用,单链DNA3'端和5'端汇聚在四面体的四个顶点,Tetra-A在5'末端延伸出一段DNA序列作为识别序列,Tetra-B/C/D分别在5'末端修饰巯基,分别在四面体的顶点上衍生出来。
在检测中还需要利用一条借以形成杂交间隙的DNA单链(辅助链),各DNA链的序列如下所示:
Tetra-A:
5'-CAT CTT GCC TAA AAA AAA AAA CAT TCC TAA GTC TGA AACATT ACA GCT TGC TAC ACG AGA AGA GCC GCC ATA GTA-3';
Tetra-B:
5'-HS-C6-TAT CAC CAG GCA GTT GAC AGT GTA GCA AGC TGTAAT AGA TGC GAG GGT CCA ATA C-3';
Tetra-C:
5'-HS-C6-TCA ACT GCC TGG TGA TAA AAC GAC ACT ACG TGGGAA TCT ACT ATG GCG GCT CTT C-3';
Tetra-D:
5'-HS-C6-TTC AGA CTT AGG AAT GTG CTT CCC ACG TAG TGTCGT TTG TAT TGG ACC CTC GCA T-3';
辅助链(helper-miR-141):
5'-AGG CAA GAT GCC ATC TTT ACC AGA CAG TGT TAT GCG ACCT-3'(ssDNA,分子量为12280.0,由Invitrogen公司合成,SEQ ID NO.5);
目标miRNA(hsa-miR-141):
5'-UAA CAC UGU CUG GUA AAG AUG G-3'(ssRNA,由Invitrogen公司合成,分子量为6714.3,SEQ ID NO.6);
生物素修饰的DNA信号探针(URP8):5'-Biotin-AGG TCG CA-3'(8bp,分子量为2434.6,5'端标记生物素分子的ssDNA,由Invitrogen公司人工合成)。
生物素修饰的DNA信号探针(URP8)与辅助链的顶部的一段互补,捕获探针和信号探针与辅助链杂交后的间隙部分正好与目标miRNA杂交,这样,捕获探针、目标miRNA和信号探针三段通过碱基堆积作用和氢键作用与辅助链形成稳定的结构。
亲和素修饰的辣根过氧化物酶(avidin-HRP),购自Roche公司,参考产品说明书在使用前用100mM PBS稀释成0.5U/mL avidin-HRP。
3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液(TMB)购于Neogen公司,为K-blue低活性底物(已配有双氧水)。
所有的化学试剂都是分析纯,没有经过进一步的纯化直接使用。所有的溶液都用RNase-free水配制。RNase-free水用0.1%DEPC处理MilliQ水(18MΩ·cm,Millipore)得到。
2、检测过程
整个检测过程包括如下步骤:
(1)四面体DNA纳米探针自组装
取等量的Tetra-A、B、C、D四条单链DNA,用TM buffer(20mM Tris,50mM MgCl2,pH8.0)稀释,使其终浓度为1μM,体积50μL。上述溶液95℃反应2min后,立即降温到4℃,持续30s以上,即得四面体DNA纳米探针。
(2)清洗打磨电极并组装
取直径为2mm的金电极,先用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉依次打磨,然后用乙醇和超纯水各超声2min,在0.5M硫酸中测定其循环伏安曲线,最后用超纯水冲洗然后用N2吹干,备用。
在电极上分别滴加3μL四面体DNA纳米探针组装液,室温下组装过夜。
(3)杂交反应
将不同浓度(包括0aM即空白blank对照、1pM和1nM)的目标miRNA(hsa-miR-141)与生物素修饰的通用信号探针DNA(URP8,100nM)和与目标miRNA对应的互补链(辅助链,50nM)在含有1M NaCl和20mM MgCl2的10mM PB缓冲溶液(pH7.4)中混合。混合均匀之后80℃变性5分钟,室温冷却20分钟后,将混合液加入2mL RNase-free的小管中。最后将修饰了四面体DNA纳米探针的电极浸入小管中与目标miRNA、信号探针和辅助链进行孵育杂交,2mL RNase-free的小管置于Eppendorf的舒适性恒温仪中,控温45℃,杂交反应30min后取出电极用0.01M PBS于25℃浸泡电极5min并用N2吹干,再与3μL浓度为0.5U/mL的亲和素修饰的辣根过氧化物酶(avidin-HRP)在室温孵育15分钟。制备好的电极最后用0.01M PBS进行浸泡和冲洗用于电化学测试。
(4)电化学检测
取1mL TMB底物到电解池中,将电极浸没到TMB底物中。电化学检测采用传统的三电极体系,以Ag/AgCl(3M KCl)为参比电极,铂丝电极为对电极,金电极为工作电极。使用瑞士万通公司的AUTOLAB TYPEⅢ型电化学工作站进行电化学检测,采用循环伏安法(CV)和稳态时间电流曲线法(amperometric i-t)进行电化学表征。循环伏安法起始电压为0V,最高电压为+0.7V,最低电压为0V,扫速为0.1V/s。时间电流曲线法测量的电位为150mV,检测时间为100s,此时氧化还原反应电流信号已经趋于稳定。电化学检测使用辣根过氧化物酶(HRP)的催化底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液(K-Blue低活性底物TMB,已含有双氧水)。
检测的流程示意图如图1(A)~(C)所示,其中,图1(A)表示带有一段miRNAs识别序列的DNA四面体纳米探针在电极表面自组装形成捕获探针的过程;图1(B)表示反应过程中需要加入的辅助链、目标miRNA、亲和素修饰的辣根过氧化物酶(avidin-HRP)以及通用的DNA信号探针;图1(C)表示加入这些物质后进行杂交反应,杂交反应的过程为首先是辅助链与通用的DNA信号探针以及目标miRNA结合,然后与电极表面的捕获探针结合,最后avidin-HRP特异性地与信号探针上的生物素结合,通过HRP酶催化H2O2氧化TMB连通电化学反应,右边的图示为电化学反应的实质。
图2(A)显示了基于HRP酶催化过程的间隙分析法电化学miRNA传感器检测与前列腺癌相关的miRNA(hsa-miR-141)的循环伏安图。从图中可以看出,当没有hsa-miR-141存在时,能够观察到TMB的两对清晰的氧化还原峰,对应于TMB的两个电子的氧化还原反应,证明了四面体结构探针的存在不影响TMB和金电极表面的电子传递。这说明了尽管单层四面体探针分子已相对较厚(按双链长度估算大约6nm),但是它的中空的结构仍然可以实现基于酶放大的电化学信号传导。由于四面体的厚度增加可以降低表面效应而又不牺牲电化学反应活性,这一独特的性质对于开发高灵敏度miRNAs传感器十分有利。
当加入hsa-miR-141的时候,可以发现在200mV左右的还原峰电流明显增加,形成了一对非对称的氧化还原峰,对应于典型的HRP酶电催化过程的出现。这一现象说明了hsa-miR-141、信号探针和辅助链与四面体探针(Tetrahedral Structure Probe,TSP)通过杂交和碱基堆积作用已经结合到电极表面。生物素修饰的信号探针DNA(URP8)与avidin-HRP特异性的结合使得avidin-HRP连接到电极表面。TMB就像电子穿梭机一样进出HRP酶的氧化还原活性中心,同时被H2O2在电极表面大量催化还原,使得催化电流迅速增加形成一个明显增大的电催化峰。
稳态时间电流法可以更加直接地表征HRP酶催化的电化学过程,结果如图2(B)所示。当初始电位保持在100mV(相对于Ag/AgCl参比电极)时,观察电流随时间变化的曲线关系,可以发现在很快的时间内电流就会达到平衡状态,在100s左右已经达到稳态电流。在图2(B)中,从上至下浓度依次为空白blank、1aM、10aM、100aM、1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM。不加入hsa-miR-141时,间隙(gap)分析法的背景电流为22nA左右,说明无论是DNA还是酶非特异性吸附(NSB)都非常小。在本发明中,当检测到1nM的目标miRNA时,信号电流可以达到2300nA,信噪比可以高达100倍,说明本发明的检测方法是可行的。
实施例2灵敏度试验
检测不同浓度的hsa-miR-141(1aM、10aM、100aM、1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM)。
检测的其他步骤同实施例1,结果如图3(A)和图3(B)所示,从图中结果可以看出,电化学信号随着目标miRNA hsa-miR-141的浓度(~10aM)的增加单调递增,在1aM至10pM的范围内呈线性变化,利用此曲线,可以实现对目标miRNA的定量分析。结果还表明,当检测低至1aM的hsa-miR-141时,电化学信号可以达到78nA,仍然要比背景信号高很多(>3SD)(SD表示标准偏差),说明本发明的检测限可以低至1aM。
实施例3特异性试验
将实例1中的helper-miR-141链分别换成helper-let-7a,helper-let-7d,用于对let-7家族miRNAs(let-7a,let-7b,let-7c,let-7d,let-7e,let-7f,let-7g,let-7i,miR-98)进行检测,以验证本发明的特异性,以hsa-miR-141作为阴性对照。各序列如下:
helper-let-7a:5'-AGG CAA GAT GAA CTA TAC AAC CTA CTA CCTCAT GCG ACC T-3'(SEQ ID NO.7);
helper-let-7d:5'-AGG CAA GAT GAA CTA TGC AAC CTA CTA CCTCTT GCG ACC T-3'(SEQ ID NO.8);
生物素修饰的DNA信号探针同实施例1。
目标miRNAs:
hsa-let-7a:5'-UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3'(SEQ IDNO.9);
hsa-let-7b:5'-UGA GGU AGU AGG UUG UGU GGU U-3'(SEQ IDNO.10);
hsa-let-7c:5'-UGA GGU AGU AGG UUG UAU GGU U-3'(SEQ IDNO.11);
hsa-let-7d:5'-AGA GGU AGU AGG UUG CAU AGU U-3'(SEQ IDNO.12);
hsa-let-7e:5’-UGA GGU AGG AGG UUG UAU AGU U-3’(SEQ IDNO.13);
hsa-let-7f:5’-UGA GGU AGU AGA UUG UAU AGU U-3’(SEQ IDNO.14);
hsa-let-7g:5’-UGA GGU AGU AGU UUG UAC AGU U-3’(SEQ IDNO.15);
hsa-let-7i:5’-UGA GGU AGU AGU UUG UGC UGU U-3’(SEQ IDNO.16);
hsa-miR-98:5’-UGA GGU AGU AAG UUG UAU UGU U-3’(SEQ IDNO.17);
hsa-miR-141:5'-UAA CAC UGU CUG GUA AAG AUG G-3'(SEQ IDNO.5)。
检测的其他步骤同实施例1,结果如图4所示,图4(A)显示了helper-let-7a对let-7家族miRNA检测的结果,尽管let-7家族miRNAs只有1~2个碱基不同,但是相互之间的结果却差异比较明显。完全互补的hsa-let-7a的电化学信号(~730nA)要明显高于其他let-7家族的miRNA;hsa-let-7b,hsa-let-7c和hsa-let-7d的检测信号都在250nA左右,也明显要比背景信号高,这可能是由于G/T可以替代G/C少量互补(具有相似的结合能)。图4(B)显示了helper-let-7d对let-7家族miRNA检测的结果,与图4(A)的结果类似,完全互补的hsa-let-7d的电化学信号(~730nA)要明显高于其他let-7家族的miRNAs。这一高的错配识别能力证明了本发明可以很好的区分同族miNRAs中的单碱基错配,具有很高的特异性。
实施例4
对前列腺癌细胞(22Rv1)和正常细胞(WPMY)提取的总RNA样品中的has-miR-141的表达水平进行分析。其他的试剂同实施例1。
检测步骤与实施例1相同,将合成的miRNA替换成组织的总RNA样品,其余参数不变。结果如图5所示,结果表明hsa-miR-141在肿瘤细胞中的表达水平要明显高于正常组织中的表达水平(P<0.05),说明hsa-miR-141在肿瘤细胞中的表达与之前的文献报道一致。同时,对所需总RNA样品的总量进行研究表明,间隙分析法甚至可以检测出50ng的总RNA中的hsa-miR-141,说明本发明的分析方法十分灵敏,在实际检测中只需要很少的样品量。这将对本发明的方法推广至实际应用和发展床边检测十分有利,既能快速地实现高灵敏度检测,又减少了检测样品的需求量。
效果实施例1
下面结合现有技术中其他的一些miRNA检测方法,包括中国专利CN102899418A和文献“Electrochemical Detection of MicroRNAs via GapHybridization Assay”(Christopher,Mathias,et al.,Anal.Chem.2010,82,4434–4440)中披露的方法与本发明的检测方法进行比较,结果如表1所示。
表1各检测方法的比较
由表1可以看出,本发明的检测方法由于只需要一种捕获探针和信号探针,大大方便了实验操作,降低了检测成本;本发明的检测过程简单、时间短、灵敏度高、杂交温度易于控制、方法具有普适性,可以适应任何miRNA的检测,在高通量检测中具有巨大的优势,而其他的检测方法不适用于高通量检测。
应理解,在阅读了本发明的上述内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种基于DNA三维纳米结构自支撑界面检测miRNAs的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)通过DNA纳米自组装技术一步法合成DNA四面体探针;
(2)将步骤(1)所述的DNA四面体探针的三个顶点通过自组装连接到电化学装置的工作电极表面,另一个顶点延伸出一段游离的miRNAs识别序列,即得带有捕获探针的工作电极;
(3)向反应体系中加入待测目标miRNAs、信号探针和辅助链进行杂交反应形成复合体I,再将步骤(2)所述的带有捕获探针的工作电极浸入反应体系中,使捕获探针与复合体I进行杂交反应,在工作电极表面形成复合体II,所述信号探针的游离端修饰有基团X,所述辅助链的一端具有与信号探针相互补结合的序列,所述辅助链的另一端具有与捕获探针相互补结合的序列,所述辅助链的中间区段具有与待测目标miRNAs相互补结合的序列;
(4)将步骤(3)所得的复合体II与能催化氧化还原反应的酶进行反应,使所述酶连接于信号探针的游离端,所述酶修饰有能与步骤(3)中所述的基团X特异性结合的基团Y;
(5)加入步骤(4)所述的酶催化反应的底物,进行电化学检测分析。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述的DNA四面体探针由序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的4条ssDNA单链通过自组装形成。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述的一步法合成DNA四面体探针通过以下步骤实现:将序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的4条ssDNA单链分别溶解在TE缓冲溶液中,使终浓度分别都为50μM,所述的TE缓冲溶液为含有10mMTris、1mM EDTA,pH为8.0的溶液,取50μM的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的四条链各1μL、30mM的TCEP5μL和TM缓冲溶液41μL混合均匀,所述的TM缓冲溶液为含有20mM Tris、50mM MgCl2,pH为8.0的溶液,然后于95℃加热2min,迅速降温到4℃,持续30s以上,用PCR仪控温,得到终浓度为1μM的四面体捕获探针。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述的电化学装置的工作电极为金电极、玻碳电极、芯片电极、印刷电极中的任一种。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述的DNA四面体探针的三个顶点连接到电化学装置的工作电极表面为通过共价自组装连接。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述的信号探针是生物素修饰或地高辛修饰的通用信号探针。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)为,首先将目标miRNA、生物素修饰的通用信号探针与辅助链预杂交,然后再与组装在工作电极表面的通用四面体探针杂交。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)为,将目标miRNA、100nM生物素修饰的通用信号探针和50nM在pH为7.4的含有1M NaCl和20mM MgCl2的10mM PB缓冲溶液中混合,混合均匀之后于80℃变性5min,室温冷却20min后,将混合液加入2mL RNase-free的小管中,然后将修饰了通用四面体探针的金电极浸入小管中与目标miNRA、信号探针和辅助链进行孵育杂交,2mL RNase-free的小管置于Eppendorf的舒适性恒温仪中,控温45℃,杂交反应30min后取出电极用0.01M PBS于25℃浸泡电极5min并用N2吹干。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)中所述的能催化氧化还原反应的酶为辣根过氧化物酶或葡萄糖氧化酶。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(5)中所述的催化反应的底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺和双氧水。
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