CN104359957A

CN104359957A - 一种电化学传感器及其制备与应用

Info

Publication number: CN104359957A
Application number: CN201410626360.2A
Authority: CN
Inventors: 丁世家; 颜玉蓉; 张晔; 袁泰先; 李胜强; 丁小娟; 杨建儒; 李新民; 袁睿; 吴茳铃
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2014-11-06
Filing date: 2014-11-06
Publication date: 2015-02-18
Anticipated expiration: 2034-11-06
Also published as: CN104359957B

Abstract

本发明提供了一种检测MicroRNA-21的电化学传感器以及包含所述电化学传感器的检测系统，所述电化学检测电极系统包括工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极为在金电极表面固定针对MicroRNA-21的捕获探针所得。应用本发明的传感器或检测系统对MicroRNA-21进行检测，MicroRNA-21的浓度在0.001-25nmolml^-1范围内呈线性关系，线性方程式为Y=1.19999E^-5+3.63774E^-6X，相关系数为0.9973，最低检测限为0.6pmolml^-1。与现有技术比较，所述传感器或检测系统灵敏度高、特异性好、成本低、操作简便，检测周期短，适用于实际样品中MicroRNA-21的测定等，有望成为具有实际应用价值的传感器或检测系统。

Description

一种电化学传感器及其制备与应用

技术领域

本发明涉及电化学领域，尤其涉及一种电化学传感器及其制备与应用。

背景技术

传统的miRNA检测方法主要有Northern印迹、微阵列杂交、RT-PCR等，但各种方法互有优劣，目前尚缺乏简便、快速、高灵敏、高特异的检测方法。Northern印迹是最早用于各种miRNA分析的技术，被认为是miRNA研究分析的金标准，该方法由于检测步骤复杂、耗时长、通量低、灵敏度低且需对大量的样品进行检测，不适于对日常miRNA进行分析。微阵列技术具有高通量检测能力并能对多种miRNAs进行分析，然而序列短及序列相似性高的miRNA具有交叉杂交的可能性，导致该方法的灵敏度及特异性均降低，因而只适于一般的筛查分析，而不适于精确定量分析。qRT-PCR的方法因其高度的特异性和灵敏度而被广泛用于miRNAs的检测，但操作过程需要逆转录步骤和温度循环，且需设计引物及昂贵仪器，从而限制了该方法的使用。因此，为适应临床诊断治疗，特别是个体化诊断治疗的需求，从miRNA传感器着手，发展快速、简便、高灵敏、高特异的可用于细胞、血液、体液及组织中miRNA检测的分析方法是当今生物传感研究领域一项亟待解决的课题，也是近年来研究热点之一。

为了弥补现有技术MicroRNA检测的不足，旨在建立一种新型电化学传感器用于MicroRNA的快速、灵敏检测。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的第一方面提供一种检测MicroRNA-21的电化学传感器，包括工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极为在基底电极金电极表面固定针对MicroRNA-21的捕获探针所得。

优选地，所述捕获探针为巯基修饰的捕获探针。

优选地，所述捕获探针的序列如SEQ ID NO.1所示，

具体为：TTTTGAGTAGAGTCTGA。

更优选地，所述巯基修饰的捕获探针的具体序列为：

5'-SH-(CH₂)₆TTTTGAGTAGAGTCTGA-3'。

优选地，每个所述工作电极上，含有所述捕获探针的摩尔量为10^-3～10^-2nmol，更优选为2x10^-3nmol。

进一步地，所述电化学传感器中的参比电极和对电极与工作电极构成三电极系统。

优选地，所述参比电极选自饱和甘汞电极或银氯化银电极(Ag/AgCl)之任意一种；更优选地，所述参比电极为银/氯化银(Ag/AgCl)电极。

优选地，所述对电极为铂丝电极。

本发明第二方面提供了前述电化学传感器中的工作电极的制备方法，所述方法为先在基底电极金表面固定针对MicroRNA-21的捕获探针，而后进行封闭电极所得。

优选地，所述工作电极按照以下步骤制备：

(1)金电极表面处理：将金电极表面进行抛光处理，使其表面光洁；

(2)固定针对MicroRNA-21的捕获探针：将捕获探针滴涂在处理干净的金电极表面；

(3)封闭电极：封闭非特异性吸附位点，即得工作电极。

优选地，步骤(1)中，可采用氧化铝粉对所述基底电极进行抛光处理。

优选地，步骤(2)中，所述捕获探针的浓度为100nM～1000nM,更优选为200nM。

优选地，步骤(3)中，采用MCH、BSA封闭非特异性吸附位点。

本发明第三方面提供了一种检测MicroRNA-21的检测系统，包括本发明第一方面所述的电化学免疫传感器。

进一步的，所述检测系统还包括液相扩增反应体系，所述液相扩增反应体系为包括针对MicroRNA-21的两个配对的茎环H1、H2的缓冲液。

优选地，所述液相扩增反应体系中，所述茎环H1的序列SEQ ID NO.2～4所示，具体为：

H1的序列如SEQ IDNO.2所示：

5'-TTTTCAACATCAGTCTGATAAGCTACCATGTGTAGATAGCTTATCAGACTCTACTCA-3'。

H1D1M2,亦即在如SEQ IDNO.2所示的H1茎环的D1位置上错配两个碱基，所得序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

5'-TTTTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAAATGTGTAGATAGCTTATCAGACTCTACTCA-3'。

H1D4M2，亦即在如SEQ IDNO.2所示的H1茎环的D4位置上错配两个碱基，所得序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：

5'-TTTTCAACATCAGTCTGATAAGCTACCATGTGTACGTAGCTTATCAGACTCTACTCA-3'。

更优选地，所述茎环H1的5'端为生物素(Biotin)修饰。

优选地，所述液相扩增反应体系中，所述茎环H2的序列SEQ ID NO.5～10所示，具体为：

H2序列如SEQ ID NO.5，具体为：

5'-TAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCAGACTCCATGTGTAGA-3'。

H2D2M2，亦即在如SEQ IDNO.5所示的H2茎环的D2位置上错配两个碱基，所得序列如SEQ ID NO.6，具体为：

5'-TAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCAGAGACCATGTGTAGA-3'。

实验证明，信噪比随着错配位点的不同而不同，当轮到H2D2M2时，信噪比达到最大值33.6，比不错配的茎环(H1-SEQ IDNO.2和H2-SEQ IDNO.5)扩大了将近4倍，说明H2D2M2这个错配位点为最佳位点。

H2D3M2，亦即在如SEQ IDNO.5所示的H2茎环的D3位置上错配两个碱基，所得序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：

5'-TAAGCTATCTACACATGGGTGCTTATCAGACTCCATGTGTAGA-3'。

H2D2M1，亦即在如SEQ IDNO.5所示的H2茎环的D2位置上错配一个碱基，所得序列如SEQ ID NO.8，具体为：

5'-TAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCAGACACCATGTGTAGA-3'。

H2D2M3，亦即在如SEQ IDNO.5所示的H2茎环的D2位置上错配三个碱基，所得序列如SEQ ID NO.9，具体为：

5'-TAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCAGTGACCATGTGTAGA-3。

H2D2M4，亦即在如SEQ IDNO.5所示的H2茎环的D2位置上错配一个碱基，所得序列如SEQ ID NO.10，具体为：

5'-TAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCACTGACCATGTGTAGA-3'。

优选地，所述液相扩增反应体系中，所述缓冲液为TNak缓冲液、PBS缓冲液或Tris-HCL缓冲液。更优选为TNak缓冲液。

优选地，所述液相扩增反应体系中，所述茎环H1与茎环H2的摩尔比为0.5:1～4:1；更优为1:1。

优选地，所述液相扩增反应体系中，所述茎环H1的浓度为10～100，更优选为50nmolmL^-1。

优选地，所述液相扩增反应体系中，所述茎环H2的浓度为10～100nmol mL^-1，更优选为50nmol mL^-1。

进一步地，所述检测系统还包括碱性磷酸酶标记的链霉亲和素和反应缓冲体系。

优选地，所述反应缓冲体系为含α-NP的二乙醇胺(DEA)缓冲液。

更优选地，所述反应缓冲体系中α-NP的浓度为0.25～1.5mg ml^-1；最佳为0.75mg mL^-1。

本发明第四方面提供了一种检测MicroRNA-21的方法，为采用前述的电化学传感器或检测系统对样品中的MicroRNA-21进行检测，所述方法具体包括以下步骤：

(a)将含有MicroRNA-21的样品溶液加入到液相扩增反应体系中，反应，得扩增产物；

(b)将所得扩增产物加到前述构建的电化学传感器的工作电极上，孵育，清洗工作电极；

(c)加亲和素化的碱性磷酸酶，孵育，清洗工作电极；

(d)将工作电极置于反应缓冲体系中，并将工作电极、参比电极以及对电极正确连接到电化学工作站上，用差分脉冲伏安(DPV)进行测定。

优选地，步骤(a)中，反应的时间为4～47℃，孵育时间为15～60min；更优为：37℃，30min。

优选地，步骤(b)中，孵育的温度为37℃，孵育时间为30min。

优选地，步骤(c)中，孵育的温度为37℃，孵育时间为30min。

优选地，步骤(d)中，所述反应缓冲体系为含α-NP的二乙醇胺(DEA)缓冲液。

更优选地，所述反应缓冲体系中α-NP的浓度为0.25～1.5mg ml^-1；最佳为0.75mgmL^-1。

优选地，步骤(d)中，所述参比电极选自饱和甘汞电极或银氯化银电极(Ag/AgCl)之任意一种；更优选地，所述参比电极为银/氯化银(Ag/AgCl)电极。

优选地，步骤(d)中，所述对电极为铂丝电极。

本发明第五方面提供了前述电化学传感器或检测系统在检测MicroRNA-21中的用途。

本发明的有益效果为：

(1)本发明研制了一种基于错配的催化茎环自组装的扩增方法的电化学传感器，可以用于灵敏地检测MicroRNA-21。首先设计稳定性良好的两个配对的茎环，再通过对环内的碱基进行错配从而降低背景信号。检测时，通过液相扩增反应后，获得的产物被电极上的固定探针所捕获，再加入亲和素化的碱性磷酸酶，进而碱性磷酸酶催化底物α-萘基磷酸盐水解，在电极表面产生电信号。所述电化学传感器的线性范围为0.001-25nmol ml^-1，线性方程式为Y＝1.19999E^-5+3.63774E^-6X，相关系数为0.9973。

(2)与此同时，信号放大是影响检测灵敏度的另一个重要因素。本发明采用了基于催化茎环自组装和碱性磷酸酶的双放大策略，极大地实现了信号放大。在本发明中，碱性磷酸酶(AP)被引进电极表面催化α-萘基磷酸盐(α-NP)水解而产生电化学信号，增强了电化学响应信号，可对MicroRNA浓度进行准确的定量。

(3)综上所述，本发明成功构建了可用于检测MicroRNA的电化学传感器及检测体系，应用本发明的传感器，对MicroRNA的测定显示了灵敏度高、稳定、重现性好的能力。与现有技术比较，本发明的传感器成本低，操作简单方便，检测周期短，特异性好，假阳性率和假阴性率低。适用于实际样品的测定等，有望成为具有实际应用价值的传感器。

附图说明

图1为本发明实施例1每一步不同修饰电极在5mM的铁氰化钾溶液中的方波伏安响应曲线，其中

a为裸金电极；

b为固定上捕获探针；

c为MCH、BSA封闭后的电极；

d为加入无靶物质催化的扩增产物后；

e为加入有MicroRNA-21催化的扩增产物后。

图2为本发明实施例1每一步不同修饰电极所对应的交流阻抗图，其中

a为裸金电极；

b为固定上捕获探针；

c为MCH、BSA封闭后的电极；

d为加入无靶物质催化的扩增产物后；

e为加入有MicroRNA-21催化的扩增产物后。

图3为催化茎环自组装扩增体系中两个茎环的错配位点图。

图4为催化茎环自组装扩增体系中两个茎环的错配位点效果图。

图5为不同错配数量碱基的所构建的电化学传感器差分脉冲伏安扫描结果。

图6为不同温度的所构建的电化学传感器差分脉冲伏安扫描结果。

图7为不同茎环比例浓度的所构建的电化学传感器差分脉冲伏安扫描结果。

图8为不同扩增时间所构建的电化学传感器差分脉冲伏安扫描结果。

图9为本发明的错配型茎环的电化学传感器在七个不同浓度(25nmol ml^-1,2.5nmol ml^-1,0.25nmol ml^-1,0.025nmol ml^-1,0.0025nmol ml^-1,0.001nmol ml^-1,0nmol ml^-1)的MicroRNA-21标准品溶液中孵育，DPV法记录电流值ip所得曲线图。

图10为本发明的对比中无错配型茎环的电化学传感器在五个不同浓度(25nmol ml^-1,2.5nmol ml^-1,0.25nmol ml^-1,0.025nmol ml^-1,0nmol ml^-1)的MicroRNA-21标准品溶液中孵育，DPV法记录电流值ip所得曲线图。

图11为本发明的错配型茎环的电化学传感器检测MicroRNA-21时的标准曲线。

图12为本发明的对比中无错配型茎环电化学传感器检测MicroRNA-21时的标准曲线。

图13为本发明制备的传感器的特异性分析实验结果。

a为25pmol ml^-1MicroRNA-21；

b为250pmol ml^-1单碱基突变的RNA序列；

c为250pmol ml^-1双碱基突变的RNA序列；

d为250pmol ml^-1完全不互补的RNA序列；

e为空白信号。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1制备电化学传感器

1.材料与方法

1.1材料

本发明所涉及序列合成和纯化都在上海生工、碱性磷酸酶标记的链霉亲和素、6-巯基己醇(MCH)、牛血清白蛋白(BSA)、α-萘基磷酸盐(α-NP)均购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2检测仪器

CHI660D型电化学工作站为上海辰华仪器公司产品。

1.3检测原理

先在金电极表面通过巯基固定上针对MicroRNA-21的捕获探针得工作电极，再将设计好的两个茎环H1、H2与要检测的靶物质MicroRNA-21同时加入缓冲液中进行扩增一段时间后，将得到的扩增产物滴加至工作电极上，再加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，通过碱性磷酸酶与底物α-萘基磷酸盐(α-NP)反应产生的电化学信号绘制标准曲线和得到实测样品MicroRNA-21水平。

2.工作电极的制备

2.1所有序列的预处理

将H1、H2茎环先通过95℃5min变性，再缓慢降温，得到的序列在使用之前，于4℃低温保存。所述茎环H1的序列SEQ ID NO.2，具体为：

5'-TTTTCAACATCAGTCTGATAAGCTACCATGTGTAGATAGCTTATCAGACTCTACTCA-3'。且所述茎环H1的5'为Biotin修饰。

所述茎环H2的序列SEQ ID NO.5，具体为：

5'-TAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCAGACTCCATGTGTAGA-3'。

2.2工作电极的修饰

(1)金电极表面处理：金电极在使用前用氧化铝粉抛光至镜面，先后分别用超纯水和体积比为1：1的丙酮和硝酸中超声几分钟。随后再次将电极用超纯水超声几分钟，再用去离子水冲洗干净，在室温下晾干。

(2)将10μL预先准备好的浓度为200nM的捕获探针小心地滴涂在处理干净的金电极表面。然后，放入4℃的冰箱中过夜。

所述捕获探针为巯基修饰的捕获探针，具体序列为：

5'-SH-(CH₂)₆TTTTGAGTAGAGTCTGA-3'。

(3)采用MCH、BSA封闭电极：先通过滴加1mmol mL^-1MCH在电极上放于室温1个小时，再滴加2％的BSA在电极上半个小时。

3.电化学传感器的使用

(1)将10μL用TNak(pH7.5)稀释到一定浓度的MicroRNA-21(0～50nmol mL^-1)和10μL 50nmol mL^-1的H1茎环及H2茎环均匀混合，在37℃反应半小时后滴加在修饰了捕获探针的电极表面，37℃温育30min。

(2)然后再用DEA缓冲液(pH 9.6)清洗电极，置于10μL 1:200稀释的亲和素化的碱性磷酸酶中，37℃温育30min，DEA缓冲液(pH 9.6)清洗。

(3)以现配制的含0.75mg mL^-1α-NP的二乙醇胺(DEA)缓冲液作为反应缓冲体系，将工作电极置于其中，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，在室温下，用差分脉冲伏安法(DPV)进行测定。

实施例2电化学传感器的表征和检验

对实施例1所得电化学传感器进行如下表征：

1.不同修饰电极的电化学表征

如图1所示，是每一步不同修饰电极在5mM的铁氰化钾溶液中的方波伏安响应曲线：

a为裸金电极；

b为固定上捕获探针；

c为MCH、BSA封闭后的电极；

d为加入无靶物质催化的扩增产物后；

e为加入有MicroRNA-21催化的扩增产物后。

当裸金电极表面固定捕获探针之后，峰值电流明显减小(图1-曲线b)，结果说明捕获探针成功被固定在电极上。当MCH、BSA封闭电极后，由于MCH、BSA的空间位阻现象和绝缘作用对电子转移构成了阻碍，峰值电流再次呈现明显的降低(图1-曲线c)。当电极通过结合扩增产物后峰值电流进一步的降低(图1-曲线d)，表明制备的扩增体系中会产生一定的空白。当把一定浓度的靶物质催化的茎环产物滴加到修饰后的电极表面孵育过后，峰值电流再一步降低(图1-曲线e)，表明靶物质催化的作用成功的引入电化学传感器的工作电极上。

图2为每一步不同修饰电极所对应的循环伏安响应曲线，

a为裸金电极；

b为固定上捕获探针；

c为MCH、BSA封闭后的电极；

d为加入无靶物质催化的扩增产物后；

e为加入有MicroRNA-21催化的扩增产物后。

结果与图1呈现出有良好的一致性，有效地证明成功地对电极进行了每一步的操作。

实施例3电化学传感器及其使用条件的优化

我们还对实验过程中几个重要的条件即碱基错配的数量、H1固定在50nmol ml^-1茎环H2的浓度、扩增体系的温度、扩增体系的反应时间这几个测定条件进行了进一步的优化。对每一个条件都由低浓度到高浓度分别选取五个点进行一系列实验。

为考察碱基错配的位点对电化学传感器的影响，本实验采用了不同碱基错配位点的茎环(H1D1M2、H2D2M2、H2D3M2、H1D4M2)，然后进行差分脉冲伏安扫描。如图3、4可见，信噪比随着错配位点的不同而不同，当轮到H2D2M2时，信噪比达到最大值33.6，比不错配的茎环(H1-SEQ IDNO.2和H2-SEQ IDNO.5)扩大了将近4倍，说明H2D2M2这个错配位点为最佳位点。

5'-TTTTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAAATGTGTAGATAGCTTATCAGACTCTACTCA-3'。

5'-TTTTCAACATCAGTCTGATAAGCTACCATGTGTACGTAGCTTATCAGACTCTACTCA-3'。

5'-TAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCAGAGACCATGTGTAGA-3'。

5'-TAAGCTATCTACACATGGGTGCTTATCAGACTCCATGTGTAGA-3'。

2.同理，为考察1条件中碱基错配数量对使用电化学传感器的影响，本实验采用了不同数量的(0，1，2，3，4)错配碱基(H2、H2D2M1、H2D2M2、H2D2M3、H2D2M4)，然后进行差分脉冲伏安扫描。如图5可见，信噪比最佳数量为2个。

H2序列如SEQ ID NO.5，具体为：

5'-TAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCAGACTCCATGTGTAGA-3'。

5'-TAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCAGACACCATGTGTAGA-3'。

5'-TAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCAGTGACCATGTGTAGA-3。

5'-TAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCACTGACCATGTGTAGA-3'。

3.同理，为考察扩增体系的反应温度对使用传感器的影响，本实验采用了不同反应温度(4，25，37，42，47℃)的反应缓冲体系，然后进行差分脉冲伏安扫描。如图6可见，扩增体系的最佳反应温度为37℃。

4.同理，为考察扩增体系中茎环浓度比例对使用电化学传感器的影响，本实验采用了固定H1浓度为50nmol ml^-1,H2稀释浓度为(10，25，50，75，100nmol ml^-1)，然后进行差分脉冲伏安扫描。如图7可见，H2最佳稀释比例为50nmol ml^-1。

5.同理，为考察扩增体系反应时间对使用传感器的影响，本实验采用了含不同反应时间(0，15，30，45，60min)的反应缓冲体系，然后进行差分脉冲伏安扫描。如图8可见，扩增体系的最佳反应时间为30min。

实施例4制备的电化学传感器的性能分析

为了评估电化学传感器的性能，对以TNak(pH7.5)配备的不同浓度的MicroRNA-21标准品进行分析。具体的，在最优实验条件下，

(1)将10μL用TNak(pH7.5)稀释到六个不同浓度的MicroRNA-21(50nmol ml^-1,5nmol ml^-1,0.5nmol ml^-1,0.05nmol ml^-1,0.005nmol ml^-1,0.002nmol ml^-1)和10μL 50nmol mL^-1的最优错配茎环H1、H2(H2D2M2)均匀混合，滴加在固定上捕获探针的电极表面，37℃温育30min。最优错配茎环H1、H2(H2D2M2)具体是指：

H1序列如SEQ IDNO.2：

5'-BiotinTTTTCAACATCAGTCTGATAAGCTACCATGTGTAGATAGCTTATCAGACTCTACTCA-3'。

5'-TAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCAGAGACCATGTGTAGA-3'。

(2)然后再用DEA缓冲液(pH 9.6)清洗电极，置于10μL 1:200稀释的亲和素化的碱性磷酸酶，37℃温育30min，DEA缓冲液(pH 9.6)清洗。采用DPV法记录电流值ip(如图9所示)，绘制标准曲线，如图12所示。实验结果显示，当MicroRNA-21浓度在1pmol mL^-1到25nmolmL^-1之间时，得到的峰电流与MicroRNA-21浓度的对数呈线性相关，线性方程式为Y＝1.19999E-5+3.63774E-6X，相关系数为0.9973。将传感器在空白溶液(是指没有MicroRNA-21标准品加入扩增体系的溶液)中连续扫描10次，根据空白信号加上3倍标准差所对应的信号值估计检出限，计算得0.6pmol mL^-1。

3.对比实验：

对以TNak(pH7.5)配备的不同浓度的MicroRNA-21标准品进行分析。具体的，在最优实验条件下，(1)将10μL用TNak(pH7.5)稀释到六个不同浓度的MicroRNA-21(50nmol ml^-1,5nmol ml^-1,0.5nmol ml^-1,0.05nmol ml^-1,0.005nmol ml^-1,0.002nmol ml^-1)和10μL 50nmol mL^-1的无错配的茎环H1、H2均匀混合，滴加在固定上捕获探针的电极表面，37℃温育30min。(2)然后再用DEA缓冲液(pH 9.6)清洗电极，置于10μL 1:200稀释的亲和素化的碱性磷酸酶，37℃温育30min，DEA缓冲液(pH 9.6)清洗。采用DPV法记录电流值ip(如图10所示)，绘制标准曲线，如图11所示。实验结果显示，当MicroRNA-21浓度在25pmol mL^-1到25nmol mL^-1之间时，得到的峰电流与MicroRNA-21浓度的对数呈线性相关，线性方程式为Y＝1.72614E-5+7.23591E-6X，相关系数为0.9987。

所述无错配的茎环H1、H2具体为：

H1序列如SEQ ID NO.2，具体为：

5'-BiotinTTTTCAACATCAGTCTGATAAGCTACCATGTGTAGATAGCTTATCAGACTCTACTCA-3'。

H2序列如SEQ ID NO.5，具体为：

5'-TAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCAGACTCCATGTGTAGA-3'。

实施例5制备的电化学传感器的特异性分析

电化学传感器的特异性，在分析不分离的生物样本中的生物标志物时具有重要的作用，主要取决于设计的茎环序列的特异性。我们所使用的是互补型的双茎环序列。为了评价本传感器的特异性，我们对在检测MicroRNA-21时可能会出现的其他的三种单碱基错配型RNA序列、双碱基错配型RNA序列、完全不互补型RNA序列进行了检测。具体的，将单碱基错配型RNA序列、双碱基错配型RNA序列、完全不互补型RNA序列各250pmol mL^-1以及25pmol mL^-1MicroRNA-21分别采用同实施例4所构建的电化学传感器进行测定。结果如图13所示，单碱基错配型RNA序列有明显的降低，其它两种RNA序列的DPV响应电流接近于空白样。这些结果说明制备的电化学传感器能够有效地分辨其他种类的MicroRNA，具有良好的特异性。

所述单碱基错配型RNA序列如SEQ ID NO.11所示，

具体为：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUUA；

所述双碱基错配型RNA序列如SEQ ID NO.12所示，

具体为：UAGCUUAUCAGACUGAUUUUUA；

所述完全不互补型RNA序列如SEQ ID NO.13所示，

具体为：AUUGAAUAUUCUUAUUAUAAUU。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种检测MicroRNA-21的电化学传感器，包括工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极为在基底电极金电极表面固定针对MicroRNA-21的捕获探针所得。

2.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，所述捕获探针为巯基修饰的捕获探针。

3.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，所述捕获探针的序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，所述参比电极选自饱和甘汞电极或银氯化银电极；所述对电极为铂丝电极。

5.根据权利要求1～4任一权利要求所述电化学传感器中的工作电极的制备方法，所述方法为先在基底电极金电极表面固定针对MicroRNA-21的捕获探针，而后进行封闭电极所得，具体包括如下步骤：

(3)封闭电极：封闭非特异性吸附位点，即得工作电极。

6.一种检测MicroRNA-21的检测系统，包括如权利要求1～4任一权利要求所述的电化学免疫传感器。

7.根据权利要求6所述的检测系统，其特征在于，所述检测系统还包括液相扩增反应体系，所述液相扩增反应体系为至少包括两个针对MicroRNA-21的配对茎环H1、H2的缓冲液。

8.根据权利要求6所述的检测系统，其特征在于，所述茎环H1的序列SEQ ID NO.2～4所示；所述茎环H2的序列SEQ ID NO.5～10所示。

9.根据权利要求6所述的检测系统，其特征在于，所述检测系统还包括碱性磷酸酶标记的链霉亲和素和反应缓冲体系。

10.根据权利要求9所述的检测系统，其特征在于，所述反应缓冲体系为含α-NP的二乙醇胺缓冲液。