CN111781262B - 基于交流阻抗技术的末端转移酶活性动态分析方法构建及应用 - Google Patents

基于交流阻抗技术的末端转移酶活性动态分析方法构建及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于交流阻抗技术的末端转移酶活性分析方法构建及应用，利用TdT将三磷酸胞嘧啶核苷(dCTP)引入5’巯基DNA修饰的金电极表面，形成富C DNA长链。该DNA长链在pH 7.0条件下保持无规则单链状态，获得较大的电化学阻抗值，相反，在pH 5.8条件下由于C被部分质子化会形成稳定的i‑motif结构，获得较小的电化学阻抗值(i‑motif中半质子化富C DNA有利于电子传导)，形成一种十分有意义电化学阻抗开关，电化学阻抗值取决于TdT活性大小，基于此实现不同微环境下TdT活性动态分析及其小分子抑制剂筛选。

Description

基于交流阻抗技术的末端转移酶活性动态分析方法构建及 应用
技术领域
本发明涉及末端转移酶活性动态分析，特别涉及基于交流阻抗技术的末端转移酶活性电化学分析方法构建，属于功能生物材料和生物传感技术领域。
背景技术
众所周知，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)是一种特别的DNA聚合酶，能够在含三个或三个以上核苷酸的DNA 3’-OH端重复添加脱氧核糖核苷酸(dNTP)，形成一种特殊DNA长链。大多数人体细胞中TdT表达被抑制，仅在未成熟淋巴细胞和急性淋巴细胞白血病细胞上表达，因此TdT可作为该类疾病的临床诊断标志物。可见，TdT活性水平对探索TdT相关病理功能及疾病诊断和治疗具有十分重要的意义。常规TdT活性测定方法是放射免疫分析、免疫荧光等方法，但这些方法非常昂贵且具有一定危险性，要求操作人员具有专门技能，随后一些新颖的电化学方法和荧光方法涌现，但是由于人体内丰富的新陈代谢及其异常引起的体内微环境改变，目前的传感方法尚不能满足这种动态变化研究，且基于TdT活性的生物传感动态研究目前还处于初级阶段，简单、快速的新型TdT便携式动态分析方法仍被迫切需求。
近年来，研究发现一种富含胞嘧啶(C)的DNA分子在特定条件下可形成i-motif结构，这是因为富C DNA分子在酸性条件下部分发生质子化，质子化C+与未质子化C通过氢键相互作用形成稳定的平行双螺旋，两个平行双螺旋交替排列和互相嵌入形成i-motif。另外，在中性或碱性条件下i-motif解开变成DNA单链结构。自Willner小组通过界面电子转移电阻研究pH 5.8和7.0下i-motif形态变化以来，这种不同pH下的i-motif构型变化引起很多科学家关注。
本发明基于交流阻抗技术的末端转移酶活性分析方法构建及应用，将三磷酸胞嘧啶核苷(dCTP)引入5’巯基DNA修饰的金电极表面，利用TdT工具酶角色催化延长该DNA的3’-OH端，形成富C DNA长链。该链在中性条件下保持无规则单链状态，相反，在酸性条件下由于C被部分质子化会形成稳定的i-motif结构。利用[Fe(CN)6]3-/4-作为氧化还原探针通过电化学阻抗谱(EIS)探讨TdT催化延长作用及富C DNA的构型变化。由于富C DNA的形成，获得较大的电化学阻抗值，因为i-motif的形成，获得较小的电化学阻抗值(半质子化富C DNA有利于电子传导)，形成一种十分有意义电化学阻抗开关。这种电化学阻抗值取决于TdT活性大小，在没有TdT情况下，这种“off-on-off”开关无法构建，本发明基于此实现不同微环境下TdT活性动态分析及其抑制剂筛选。目前国内外尚未发现基于i-motif阻抗开关实现不同微环境下TdT活性动态监测及其小分子抑制剂筛选的相关报导。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的基于交流阻抗技术的末端转移酶活性动态分析方法构建及应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于交流阻抗技术的末端转移酶活性动态分析方法构建及应用，具体步骤如下：
(1)传感器制备
Electrode 1：金电极用0.05～0.3μm氧化铝(Al2O3)在麂皮上抛光打磨，依次于无水乙醇和超纯水中超声清洗5～10min，在0.1～0.5M H2SO4中于-0.4～1.5V下进行循环伏安扫描，直到得到稳定重复循环伏安曲线，超纯水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 1。
Electrode 2：将2～5μL浓度为0.05～5μM的巯基DNA溶液滴加到Electrode 1表面，4℃冰箱放置6～18h，再用0.1～1.0mM巯基乙醇(MCH)处理10～80min(置换电极表面非Au-S键固定的捕获探针)，超纯水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 2。
Electrode 3：配制总体积为5～14μL的TdT反应液，其中含有2～7μL超纯水，0.5～2.5μL 5×TdT缓冲液，0.5～2.5μL浓度为5～15mM的dCTP和0.5～2μL浓度为1×10-5～0.5U/mL的TdT，混合均匀滴于Electrode 2表面，在30～45℃下放置0.5～2h，超纯水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 3。
(2)TdT活性检测
在Electrode 3制备过程中，改变TdT浓度，用于Electrode 3制备，然后如步骤(1)制备一系列不同的传感器，用来检测不同浓度TdT下EIS响应。
本发明将Electrode 3置于10mM磷酸缓冲溶液(PB，Na2HPO4/NaH2PO4)(pH 7.0或5.8)孵育30min，再转移到5mM[Fe(CN)6]3-/4-中进行EIS测量。
本发明用到的巯基DNA探针序列为(5’-3’)：SH-TTCAGG。
利用上述基于交流阻抗技术的末端转移酶活性动态分析方法构建及应用，通过电化学阻抗法(交流频率范围为10-2～105Hz，设置初始电压为0.245V，振幅为5mV)在5mM[Fe(CN)6]3-/4-中进行电化学检测，获得一系列不同浓度TdT对应的电化学阻抗大小，建立电化学阻抗值与TdT之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中TdT含量，并利用这种“off-on-off”的阻抗型开关对微环境动态变化进行监测。
发明原理：本发明是基于交流阻抗技术的一种新型TdT电化学方法，利用TdT工具酶作用，将三磷酸胞嘧啶核苷(dCTP)不断添加到巯基DNA 3’-OH端，形成富C DNA长链。当pH为7.0时，由于DNA长链形成对[Fe(CN)6]3-/4-排斥作用增加，得到一个较大阻抗值；当pH为5.8时，由于DNA长链部分质子化导致i-motif形成，对[Fe(CN)6]3-/4-排斥作用减小有利于电极表面电子传递，得到一个较小阻抗值。这种交流阻抗开关不仅能够实现TdT量化，并能对微环境的动态变化进行监测，构建了一种简单、快速、无损伤、无标记的TdT活性动态分析方法。
与现有技术相比，本发明的优点在于：该发明基于巯基DNA修饰的金电极基底(阻抗值较小)，利用TdT将三磷酸胞嘧啶核苷(dCTP)引入到巯基DNA 3’-OH端，形成富C DNA长链(阻抗值较大)，当PB溶液pH从7.0降低到5.8时，因为i-motif形成使得阻抗值呈现一个下降进程。TdT活性变化会影响DNA长链形成，进而影响阻抗大小，通过交流阻抗法检测不同浓度TdT下的电化学阻抗响应，同时利用这种阻抗开关可以实现TdT所处微环境动态变化监测。显然，pH 7.0时，在浓度一定范围内，TdT浓度越大，阻抗值越大；pH 5.8时，在浓度一定范围内，TdT浓度越大，阻抗值越小。实验结果表明，电化学阻抗值与TdT浓度在一定范围内呈线性关系，实现对TdT活性及其小分子抑制剂的检测及其所处微环境监测，其优点在于：
(1)高灵敏度。本发明实验得出该电化学传感器的交流阻抗值对TdT浓度的线性相关方程：pH 7时，线性相关方程为Ret＝2029lgTdT+10247，R2＝0.9991，线性范围为5×10-5～0.1U/mL，检测限为2.1×10-5U/mL；pH 5.8时，线性相关方程为Ret＝348lgTdT+2997，R2＝0.9972，线性范围为5×10-5～0.1U/mL，检测限为1.8×10-5U/mL。由此说明该传感器对TdT可实现高灵敏动态分析检测。
(2)高特异性。在众多DNA聚合酶中，只有TdT具有催化延长DNA 3’-OH端的功能，而其它酶无此特性，因此该电化学传感器能够实现TdT高特异检测。
(3)结果准确。回收率均在90％～110％之间。
(4)实用性好。一方面，该电化学传感器可用于TdT小分子抑制剂(如焦磷酸钠)的分析检测，IC50分别为39.7μM和30.1μM；另一方面，可用于复杂基质中TdT相关微环境变化监测。
(5)制备与检测方法成本低、速度快。本发明只需消耗少量材料和试剂就可实现对TdT的高灵敏高特异检测。
综上所述，本发明是基于交流阻抗技术的末端转移酶活性动态分析方法构建及应用，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、易于操作、重现性好等优点，可实现较低浓度TdT检测及其小分子抑制剂筛选，并可实现TdT相关微环境动态检测，在疾病诊断与生物分析上具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明传感器的可行性实验图；
图2为本发明传感器对有无TdT的电化学响应图；
图3为本发明传感器对不同浓度TdT的电化学响应图；
图4为本发明传感器对不同浓度焦磷酸钠对TdT抑制作用的电阻响应对浓度的校准曲线图；
图5为本发明传感器的选择性图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1传感器制备
Electrode 1：金电极用0.05氧化铝(Al2O3)在麂皮上抛光打磨，依次于无水乙醇和超纯水中超声清洗5min，在0.5M H2SO4中于-0.4～1.5V下进行循环伏安扫描，直到得到稳定重复的循环伏安曲线，超纯水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 1。
Electrode 2：将2.5μL浓度为1μM的巯基DNA溶液滴加到Electrode 1表面，4℃冰箱放置12h，再用1.0mM巯基乙醇(MCH)处理30min(置换电极表面非Au-S键固定的捕获探针)，超纯水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 2。
Electrode 3：配制总体积为5μL的TdT反应液，其中含有3μL超纯水，0.5μL 5×TdT缓冲液，0.5μL浓度为10mM的dCTP和1μL浓度为0.1U/mL的TdT，混合均匀滴于Electrode 2表面，在37℃下放置2h，超纯水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 3。
本发明将Electrode 3置于10mM磷酸缓冲溶液(PB，Na2HPO4/NaH2PO4)(pH 7.0或5.8)孵育30min，再转移到5mM[Fe(CN)6]3-/4-中进行EIS测量。
实验结果如图1所示，pH 7.0时，随着巯基DNA的固化和TdT的催化延长作用，阻抗值不断增加，在pH 5.8时，因为富C DNA长链的部分质子化导致阻抗值较pH 7.0时小(插入图)。
实施例2可行性实验
为了证明本发明中的电化学传感器可以实现对TdT检测及其相关微环境动态分析，基于实施例1中所制备传感器，交替使用pH 7.0和pH 5.8的10mM PB溶液孵育，并在5mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中进行EIS测定。见图2，相比较于无TdT存在时，传感器在10mM PB(pH7.0)和10mM PB(pH 5.8)孵育后所测电化学阻抗值变化十分明显，并呈现一定的规律(off-on-off)。证明该传感器可用于TdT活性检测及其相关微环境动态分析。
实施例3传感器用于TdT活性检测
基于实施例1所制备传感器，在制备Electrode 3步骤中，改变TdT的浓度，控制TdT终浓度分别为：0，5×10-5，1×10-4，2×10-4，5×10-4，0.001，0.002，0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5U/mL，如实施例1制备一系列电化学生物传感器。实验结果如图3所示，在10mMPB溶液(pH 7.0)处理后，TdT浓度越大，电化学阻抗值越大，电化学阻抗值对TdT浓度对数值的线性相关方程为Ret＝2029lgTdT+10247，R2＝0.9991，线性范围为5×10-5～0.1U/mL，线性相关方程为检测限为2.1×10-5U/mL，在10mM PB溶液(pH 5.8)处理后，TdT浓度越大，电化学阻抗值增加，但增加幅度较少，这是因为部分质子化的富X DNA长链虽然能够加速电极表面的电子传递，但DNA磷酸骨架效应也同时存在，电化学阻抗值对TdT浓度对数值的线性相关方程为pH 5.8时，线性相关方程为Ret＝348lgTdT+2997，R2＝0.9972，线性范围为5×10-5～0.1U/mL，线性相关方程为检测限为1.8×10-5U/mL。这表明该传感器可实现TdT活性高灵敏检测。
实施例4焦磷酸钠(PP)抑制作用分析
按上述实施例1传感器制备步骤，制备Electrode 3时，在TdT反应液中加入不同浓度焦磷酸钠(PP)，浓度依次为：0、0.005、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.06mM，其它实验步骤不变。结果如图4所示，分别在5mM[Fe(CN)6]3-/4-(pH7.0)和5mM[Fe(CN)6]3-/4-(pH 5.8)溶液中检测时，电化学阻抗值与PP浓度的关系，计算得PP对TdT的半抑制浓度IC50分别为39.7μM、30.1μM，说明PP对TdT活性具有良好的抑制效果。
实施例5选择性分析
选择性实验中TdT及其他干扰物质的浓度均为0.1U/mL，所用到的其它对照酶如下：尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)、蛋白激酶A(PKA)、碱性磷酸酶(ALP)、葡萄糖氧化酶(GOx)、三磷酸腺苷(ATP)。按上述实施例1中传感器制备步骤，在Electrode 3制备进程中，用其它相同浓度对照酶代替TdT，其它的制备步骤相同，分别在10mM PB溶液(pH 7.0)和10mM PB(pH 5.8)溶液孵育后进行检测，结果如图5所示，相对于blank(电极2的阻抗值)，只有TdT存在时会引起显著的信号变化，表明本发明所制备传感器的良好选择性。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。

Claims (6)

1.一种基于交流阻抗技术的末端转移酶TdT活性动态分析方法，其特征在于，所述动态分析方法用于非疾病的诊断目的，包括如下步骤：
(1)传感器制备
Electrode 1：金电极用0.05～0.3μm氧化铝Al2O3在麂皮上抛光打磨，依次于无水乙醇和超纯水中超声清洗5～10min，在0.1～0.5M H2SO4中于-0.4～1.5V下进行循环伏安扫描，直到得到稳定重复循环伏安曲线，超纯水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 1；
Electrode 2：将2～5μL浓度为0.05～5μM的巯基DNA溶液滴加到Electrode 1表面，4℃冰箱放置6～18h，再用0.1～1.0mM巯基乙醇MCH处理10～80min，超纯水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 2；
Electrode 3：配制总体积为5～14μL的TdT反应液，其中含有2～7μL超纯水，0.5～2.5μL 5×TdT缓冲液，0.5～2.5μL浓度为5～15mM的dCTP和0.5～2μL浓度为1×10-5～0.5U/mL的TdT，混合均匀滴于Electrode 2表面，在30～45℃下放置0.5～2h，超纯水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 3，即得传感器；
(2)末端转移酶TdT活性检测
在Electrode 3制备过程中，改变末端转移酶TdT浓度，用于Electrode 3制备，然后如步骤(1)制备一系列不同的传感器；
将Electrode 3置于10mM磷酸缓冲溶液孵育30min，再转移到5mM[Fe(CN)6]3-/4-中进行电化学阻抗EIS测量；其中所述磷酸缓冲溶液pH＝7.0或pH＝5.8。
2.根据权利要求1所述的基于交流阻抗技术的末端转移酶TdT活性动态分析方法，其特征在于，巯基DNA序列为：SH-TTCAGG。
3.根据权利要求1所述的基于交流阻抗技术的末端转移酶TdT活性动态分析方法，其特征在于，电化学阻抗EIS测量测定条件为：交流频率范围为10-2～105Hz，设置初始电压为0.245V，振幅为5mV。
4.根据权利要求1-3任一项所述的基于交流阻抗技术的末端转移酶TdT活性动态分析方法，其特征在于，pH＝7.0时，在浓度一定范围内，TdT浓度越大，阻抗值越大；pH＝5.8时，在浓度一定范围内，TdT浓度越大，阻抗值越小；电化学阻抗值与TdT浓度在一定范围内呈线性关系，实现对TdT活性及其小分子抑制剂的检测。
5.根据权利要求4所述的基于交流阻抗技术的末端转移酶TdT活性动态分析方法，其特征在于，pH＝7时，电化学阻抗值对TdT浓度对数值的线性相关方程为Ret＝2029lgTdT+10247，R2＝0.9991，线性范围为5×10-5～0.1U/mL，检测限为2.1×10-5U/mL；pH＝5.8时，电化学阻抗值对TdT浓度对数值的线性相关方程为Ret＝348lgTdT+2997，R2＝0.9972，线性范围为5×10-5～0.1U/mL，检测限为1.8×10-5U/mL。
6.根据权利要求4所述的基于交流阻抗技术的末端转移酶TdT活性动态分析方法，其特征在于，所述小分子抑制剂为焦磷酸钠，IC50分别为39.7μM和30.1μM。
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