CN109856212B - 一种同时检测HAT和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测HAT和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用，具体步骤如下：(1)将巯基己醇(MCH)滴加到Hg²⁺诱导的发卡DNA修饰电极表面，记为Electrode1；(2)分别取乙酰转移酶p300、多肽和乙酰辅酶A在磷酸缓冲溶液中(PBS，10mM，pH7.0)充分混合，滴涂于Electrode1表面，记为Electrode2；(3)取Exo I溶液滴涂于Electrode2电极表面，在室温下孵育，再将TdT反应液滴于电极表面，记为Electrode3；(4)向(3)中电极表面滴加Cu²⁺，再向电极表面滴加抗坏血酸溶液，记为Electrode4，于PBS(0.1M，pH7.0)电解质溶液中检测电化学响应。优点是特异性好、灵敏度高、检测速度快，并且可以同时检测两种酶的活性，结果准确可靠、成本低。

Description

一种同时检测HAT和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其 应用

技术领域

本发明涉及一种电化学生物传感器及其检测方法，尤其是涉及一种同时检测HAT和TdT的电化学生物传感器的制备方法及应用，属于功能生物材料和生物传感技术领域。

背景技术

蛋白质翻译后修饰是细胞对蛋白质实行复杂调控和信息传递的基础，不仅影响蛋白质的高级结构和生物活性，还调节其亚细胞定位、代谢周期以及与其它大分子物质的相互作用，癌症的发生发展与蛋白质翻译后修饰密切相关。其中，组蛋白乙酰化转移酶(HAT)多作用在核心组蛋白氨基酸碱性氨基酸集中区的特定赖氨酸残基上，其基本原理是将乙酰辅酶A的乙酰基转移到赖氨酸的NH₃ ⁺上。异常的组蛋白乙酰化修饰影响到恶性肿瘤细胞生长、分化、凋亡、增殖相关基因的调控，从而往往导致恶性肿瘤的发生、增殖。因此，研究HAT活性对于理解癌症成因和进展具有重要的意义。

末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，是一种无需DNA模板的DNA聚合酶，能催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的羟基端(3’-OH)从而延伸出具有“超长”序列的DNA分子。TdT在一些癌症类型中过表达，许多临床研究还表明，TdT的表达水平和活性的改变对癌症发展具有关键作用，并可能使对抗癌化疗的反应恶化。已经在B细胞和T细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓细胞白血病(AML)中观察到TdT过表达。通常，AML患者中的TdT表达变化很大，而在ALL患者中，TdT在约90％的病例中过表达，并且这种过表达与预后不良和对化疗的反应相关。因此，探测TdT活性对癌症相关的基础生化研究和药物开发具有重要意义。

本发明开发了一种用于检测HAT和TdT活性的电化学生物传感器的制备方法及应用。首先，由于T-Hg²⁺-T作用使得所设计的单链DNA形成发卡结构，利用乙酰化反应产物辅酶A(CoA，含有巯基)与Hg²⁺的竞争性结合，使得DNA恢复单链结构且能够被核酸外切酶(Exo I)水解，如乙酰化反应未发生，发卡结构不能被Exo I水解，再通过TdT延长形成富TDNA链并制备铜纳米簇(CuNCs)，进而通过铜的溶出伏安信号间接实现HAT和TdT活性。目前，国内外还没有公开任何关于此机理用于HAT和TdT活性检测的电化学生物传感器的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的一种同时检测HAT和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种同时检测HAT和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用，具体步骤如下：

(1)将DNA(2.5～7.5μL，0.25～0.75μM)和Hg²⁺(2.5～7.5μL，0.5～1.5μM)，混合均匀，在26～42℃下放置30～90min，滴于干净的裸金电极(Au)表面。蒸馏水缓缓冲洗电极，然后滴加巯基己醇(MCH，2.5～7.5μL，0.1～1.5mM)室温静置30～90min，蒸馏水缓缓冲洗电极，记为Electrode 1。

(2)分别取乙酰转移酶p300(100～1200nM，0.1～1.2μL)、多肽(0.5～1.5mM，0.1～1.2μL)和乙酰辅酶A(0.5～1.5mM，0.5～1.5μL)在磷酸缓冲溶液中(PBS，10mM，pH 7.0)充分混合，总体积1～5μL。将反应液置于28～38℃恒温水浴锅中孵育25～55min。滴涂于Electrode l，在28～40℃下放置15～45min，蒸馏水缓缓冲洗电极，记为Electrode 2。

(3)取Exo I溶液(2.5～7.5μL，0.5～75U/mL)滴涂于Electrode 2电极表面，在室温下孵育30～120min，而后蒸馏水缓缓冲洗电极，将总体积为2.5～7.5μL的TdT反应液(1～3μL 3-吗啉丙磺酸缓冲液(MOPS)(10mM MOPS，150mM NaCl，pH7.6)，0.5～1.5μL 5×TdT缓冲液，以及dTTP(0.5～1.5μL，5～15mM)，TdT(0.5～1.5μL，5～15U/mL))，滴于电极表面，在27～42℃下放置0.5～1.5h，蒸馏水缓缓冲洗电极，记为Electrode 3。

(4)向(3)中电极表面滴加Cu²⁺(2.5～7.5μL，0.5～1.5mM)，室温孵育10～30min，蒸馏水缓缓冲洗电极。然后向电极表面滴加抗坏血酸溶液(2.5～7.5μL，1～3mM)，室温反应10～30min，蒸馏水缓缓冲洗电极，记为Electrode 4，于磷酸缓冲溶液(PBS，0.1M，pH 7.0)电解质溶液中检测电化学响应。

本发明用到的DNA序列为(5’-3’)：GGT CTC CAAAAAAAAAAG GTG TCC。

利用上述一种同时检测HAT和TdT的电化学生物传感器，利用方波伏安法，设置电位范围为0～+0.3V，振幅25mV，检测传感器在PBS(0.1M，pH 7.0)中的电化学响应，获得一系列不同浓度p300和TdT对应的溶出伏安峰电流大小，建立电流响应与p300和TdT之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中p300和TdT含量。

发明原理：本发明是一种同时检测HAT和TdT的电化学生物传感器，乙酰化反应生成的CoA，与发卡DNA中的Hg²⁺结合，使得DNA变成单链结构，Exo I可以水解该单链DNA，但是不能水解发卡DNA，如果没有发生乙酰化反应，该发卡DNA可被TdT催化延长形成富T序列，然后在Cu²⁺存在的条件下生成CuNCs，通过检测Cu的溶出伏安信号检测p300和TdT活性。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明构建了一种同时检测HAT和TdT的电化学生物传感器。首先，利用发卡DNA上的巯基与Au通过Au-S键结合，乙酰化反应中生成的产物中的CoA，与发卡DNA中的Hg²⁺结合，使得DNA变成单链结构，Exo I可以水解该单链DNA，如果没有发生乙酰化反应，该发卡DNA可被TdT催化延长形成富T序列，然后在Cu²⁺存在的条件下利用抗坏血酸生成CuNCs。改变p300浓度，可以改变CoA的释放量影响电化学信号，利用方波伏安法通过检测Cu的溶出伏安信号检测不同浓度p300活性。改变TdT浓度，可以改变富T DNA长度影响电化学信号，利用方波伏安法通过检测Cu的溶出伏安信号检测不同浓度TdT活性。显然，在浓度一定范围内，目标物浓度的变化影响电流的响应。实验结果表明，电流的大小与目标物的浓度在一定范围内呈线性关系，实现对目标物的检测。其优点在于：

(1)高灵敏度。本发明实验得出传感器的电流响应对p300浓度的对数值线性相关方程为y＝8.25-3.62lgCp300，R²＝0.9910，检测限为3pM，由此说明传感器对p300可实现高灵敏检测；传感器的电流响应对TdT浓度的对数值线性相关方程为y＝15.72+5.13lgC_TdT，R²＝0.9895，检测限为0.0002U/mL，说明传感器对TdT实现高灵敏检测。

(2)抑制剂检测。该电化学生物传感器可以实现对p300抑制剂漆树酸(AnacardicAcid)及TdT抑制剂焦磷酸钠(PP)的检测，可以得出传感器的电化学响应与酶抑制剂的相关关系。

(3)制备与检测方法试剂用量少、检测速度快、成本低。

综上所述，本发明是基于CuNCs构建双酶检测的电化学生物传感器，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现低浓度p300和TdT的检测，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明传感器的制备过程不同修饰电极的电化学响应图；

图2为本发明传感器对有无p300的电化学响应图；

图3为本发明传感器对不同浓度p300的电化学响应对p300浓度的对数校准曲线图；

图4为本发明传感器对p300检测的选择性实验图；

图5本发明传感器对p300的抑制剂检测的电化学响应图；

图6为本发明传感器对有无TdT的电化学响应图；

图7为本发明传感器对不同浓度TdT的电化学响应对TdT浓度的对数校准曲线图；

图8为本发明传感器对TdT检测的选择性实验图；

图9为本发明传感器对TdT的抑制剂检测的电化学响应图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1 传感器的制备

(1)将DNA(5μL，0.5μM)和Hg²⁺(5μL，1μM)，混合均匀，在37℃下放置60min，滴于干净的裸金电极(Au)表面。蒸馏水缓缓冲洗电极，然后滴加巯基己醇(MCH)(5μL，1mM)室温静置30min，蒸馏水缓缓冲洗电极，记为Electrode 1。

(2)分别取乙酰转移酶p300(1000nM，0.1μL)、多肽(1mM，0.4μL)和乙酰辅酶A(1mM，1μL)在磷酸缓冲溶液中(PBS，10mM，pH 7.0)充分混合，总体积2μL。将反应液置于30℃恒温水浴锅中孵育30min。滴涂于Electrode 1，在30℃下放置30min，蒸馏水缓缓冲洗电极，记为Electrode 2。

(3)取Exo I溶液(5μL，50U/mL)滴涂于Electrode 2电极表面，在室温下孵育60min，而后蒸馏水缓缓冲洗电极，将总体积为5μL的TdT反应液(2μL 3-吗啉丙磺酸缓冲液(MOPS)(10mM MOPS，150mM NaCl，pH7.6)，1μL 5×TdT缓冲液，以及dTTP(1μL，10mM)，TdT(1μL，10U/mL))，滴于电极表面，在37℃下放置1h，蒸馏水缓缓冲洗电极，记为Electrode 3。

(4)向(3)中电极表面滴加Cu²⁺(5μL，1mM)，室温孵育15min，蒸馏水缓缓冲洗电极。然后向电极表面滴加抗坏血酸溶液(5μL，2mM)，室温反应15min，蒸馏水缓缓冲洗电极，记为Electrode 4，于磷酸缓冲溶液(PBS，0.1M，pH 7.0)电解质溶液中检测电化学响应。

见图1，证明传感器制备成功且有良好的电化学响应。

实施例2 p300检测的可行性实验

为了证明本发明传感器可以实现对p300的检测，基于实施例1制备我们的生物传感器，在步骤(2)中乙酰化反应过程中，对比有p300和无p300条件下，反应液用于修电极制备生物传感器。见图2，有p300时，传感器在PBS(0.1M，pH 7.0)中基本无电化学响应，而无p300存在时，存在明显的电化学响应，证明该传感器可用于p300活性检测。

实施例3 p300酶活检测

基于实施例1制备我们的生物传感器，用于p300活性检测，p300浓度依次为：0，0.01，0.04，0.12，0.4，1.2，4，10，40，100，200，500nM，检测不同浓度p300制备所得传感器对PBS(0.1M，pH 7.0)电解质溶液的电化学响应，实验结果见图3，说明随着p300浓度增大，传感器的电化学响应越弱，峰电流对p300浓度的对数呈良好的线性关系，线性相关方程为y＝8.25-3.62lgCp300，R²＝0.9910，线性范围为0.01～500nM，检测限为3pM，说明传感器对p300活性可实现高灵敏度检测。

实施例4 传感器对p300的特异性检测

选择性实验中p300及其他酶的浓度均为100nM，所用到的其他酶的缩写如下：脲酶(Urease)，乙酰胆碱酯酶(AChE)，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)，焦磷酸酶(PPase)，蛋白激酶(PKA)，碱性磷酸酶(ALP)。按上述实施例1的传感器制备步骤，用其他相同浓度的酶代替p300。结果如图4所示，与p300对比，传感器对其他酶的电化学响应非常小，基本接近空白信号，说明传感器对p300的检测显示较好的选择性。

实施例5 p300抑制剂漆树酸的抑制效果检测

按上述实施例1的传感器制备步骤，在p300反应液中用加入不同浓度的漆树酸，浓度依次为：0，1，2，5，8，10，20，50，80，100，200，500，800μM。结果如图5所示，得传感器的电流与漆树酸浓度对数的关系，计算得漆树酸对p300的半抑制浓度IC₅₀为31μM，基本接近空白信号，说明漆树酸对p300活性具有良好的抑制效果。

实施例6 TdT检测的可行性实验

为了证明本发明传感器可以实现对TdT的检测，基于实施例1制备我们的生物传感器，见图6，有TdT时，传感器在PBS(0.1M，pH7.0)中电化学响应明显，而无TdT存在时，基本无电化学响应，证明该传感器可用于TdT活性检测。

实施例7 末端转移酶TdT的检测

按上述实施例1的传感器制备步骤，用于检测不同浓度TdT，浓度依次为0，0.001，0.002，0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2U/mL。结果如图7所示，说明随着TdT浓度增大，传感器的电化学响应越来越强，峰电流对TdT的浓度呈良好的线性关系，传感器的电流响应对TdT浓度线性相关方程为y＝15.72+5.13lgC_TdT，R²＝0.9895，线性范围为0.001～0.5U/mL，检测限为0.0002U/mL，说明传感器对TdT实现高灵敏度检测。

实施例8 传感器对TdT的特异性检测

选择性实验中TdT及其他酶的浓度均为0.5U/mL，所用到的其他酶的缩写如下：脲酶(Urease)，乙酰胆碱酯酶(AChE)，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)，焦磷酸酶(PPase)，蛋白激酶(PKA)，碱性磷酸酶(ALP)。按上述实施例1的传感器制备步骤，用其他相同浓度的酶代替TdT。结果如图8所示，与TdT对比，传感器对其他酶的电化学响应非常小，基本接近空白信号，说明传感器对TdT的检测显示较好的选择性。

实施例9 TdT抑制剂焦磷酸钠(PP)的抑制效果检测

按上述实施例1的传感器制备步骤，在TdT反应液中用加入不同浓度的焦磷酸钠(PP)，浓度依次为：0，1，2，5，8，10，20，50，80，100，200，500，800μM。结果如图9所示，得传感器的电流与PP浓度对数的关系，计算得PP对TdT的半抑制浓度IC₅₀为21μM，基本接近空白信号，说明PP对TdT活性具有良好的抑制效果。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。

Claims (4)

1.一种用于检测HAT和TdT的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)将DNA和Hg²⁺混合均匀，在37℃下放置30～90min，滴于干净的裸金电极表面，蒸馏水缓缓冲洗电极，然后滴加巯基己醇MCH室温静置30～90min，蒸馏水缓缓冲洗电极，记为Electrode 1；

其中，DNA序列为5’-3’：GGTCTCCAAAAAAAAAAGGTGTCC，用量为2.5～7.5μL，浓度为0.25～0.75μM；

Hg²⁺用量为2.5～7.5μL，浓度为0.5～1.5μM；

巯基己醇MCH用量为2.5～7.5μL，浓度为0.1～1.5mM；

(2)分别取乙酰转移酶p300、多肽和乙酰辅酶A在磷酸缓冲溶液PBS中充分混合，总体积1～5μL；将反应液置于28～38℃恒温水浴锅中孵育25～55min；滴涂于Electrode 1，在28～40℃下放置15～45min，蒸馏水缓缓冲洗电极，记为Electrode 2；

其中，乙酰转移酶p300用量为0.1～1.2μL，浓度为100～1200nM；

多肽用量为0.1～1.2μL，浓度为0.5～1.5mM；

乙酰辅酶A用量为0.5～1.5μL，浓度为0.5～1.5mM；

磷酸缓冲溶液PBS浓度为10mM，pH＝7.0；

(3)取Exo I溶液滴涂于Electrode 2电极表面，在室温下孵育30～120min，而后蒸馏水缓缓冲洗电极，将总体积为2.5～7.5μL的TdT反应液，滴于电极表面，在27～42℃下放置0.5～1.5h，蒸馏水缓缓冲洗电极，记为Electrode 3；

其中Exo I溶液用量为2.5～7.5μL，浓度为0.5～75U/mL；

TdT反应液组成如下：1～3μL 3-吗啉丙磺酸缓冲液MOPS，0.5～1.5μL 5×TdT缓冲液，dTTP和TdT；

其中3-吗啉丙磺酸缓冲液MOPS组成如下：10mM MOPS，150mM NaCl，pH 7.6；

dTTP用量为0.5～1.5μL，浓度为5～15mM；

TdT用量为0.5～1.5μL，浓度为5～15U/mL；

(4)向(3)中电极表面滴加Cu²⁺，室温孵育10～30min，蒸馏水缓缓冲洗电极；然后向电极表面滴加抗坏血酸溶液，室温反应10～30min，蒸馏水缓缓冲洗电极，Electrode 4，于磷酸缓冲溶液PBS电解质溶液中检测电化学响应；

Cu²⁺用量为2.5～7.5μL，浓度为0.5～1.5mM；

抗坏血酸溶液用量为2.5～7.5μL，浓度为1～3mM；

磷酸缓冲溶液PBS浓度为0.1M，pH＝7.0。

2.一种用于检测HAT和TdT的电化学生物传感器，其根据权利要求1的制备方法制备获得。

3.一种用于检测HAT和TdT的电化学生物传感器的应用，其特征在于，所述用于检测HAT和TdT的电化学生物传感器是根据权利要求1的制备方法制备获得的，应用于非疾病的诊断与治疗目的的乙酰转移酶p300和TdT活性检测。

4.根据权利要求3所述的应用，其中乙酰转移酶p300检测限为3pM，TdT检测限为0.0002U/mL。

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