CN109856211B - 一种同时检测Exo I和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测Exo I和TdT的电化学生物传感器的制备方法。巯基DNA通过疏基与金电极表面自发形成Au‑S共价键而被固定于金电极表面。随后,TdT催化巯基DNA的3’‑OH末端与三磷酸脱氧胞嘧啶核苷酸(dCTP)聚合,生成的富C DNA长链可用来形成AgNCs,通过Ag的溶出伏安信号来检测TdT活性。TdT聚合作用前,引入Exo I,可以水解巯基DNA,从而最终影响AgNCs的形成,基于此可以检测ExoI活性。改变ExoI或TdT浓度会影响电化学信号的大小,利用此原理制备了一种高效的用于同时检测Exo I和TdT的电化学生物传感器。
Description
技术领域
本发明涉及一种电化学生物传感器,尤其是涉及一种同时检测Exo I和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用,属于功能生物材料和生物传感技术领域。
背景技术
生物传感器是一门由生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相渗透成长起来的高新技术。电化学生物传感技术是生物传感器的一种,是将生物分子的特异性识别与高灵敏的传感技术相结合而发展起来的具有快速、灵敏、操作简便等特点的一类新型检测技术,已广泛应用在临床各个领域。与传统的检测技术相比,电化学生物传感技术具有以下优点:灵敏度高,精度高,可实现生物靶分子的痕量分析;特异性高,生物分子识别元件能够选择性地与生物靶分子结合;检测时间短;实时检测,能实时动态监测生物分子反应的整个过程。电化学传感技术更适用于浓度低、成份复杂的生物体系的检测。
核酸外切酶I(Exo I)具有从3’-5’方向降解单链DNA的外切酶活性。Exo I多用于PCR扩增后降解消化引物,但该酶对于双链DNA和磷酰或乙酰基团封闭的3’-OH末端DNA链无活性。Exo I直接参与许多重要的生物过程,例如细胞代谢,DNA校正和修复。据报道,缺乏Exo I的生物更容易患癌症。因此,在生物研究和分析化学中精确测定Exo I的活性受到高度重视。目前已经建立的几种测定Exo I方法,包括凝胶电泳和放射性标记。但是,这些方法时间长、步骤繁琐,并且必须使用严格的安全程序来控制射线对人体的伤害。因此,急需发展一种简单、快速、灵敏、免标记的分析方法用于Exo I的检测。
末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)是一种无需模板的DNA聚合酶,可以催化核苷酸随机掺入单链DNA链的3’-OH末端。TdT可以在免疫球蛋白重链基因重组过程中加入基因片段,对抗原受体有很大贡献。目前常用TdT活性的测定方法有凝胶电泳和免疫学测定,但会造成放射性污染且操作步骤繁琐,成本较高。近些年,已经发现了一些新的方法用于TdT测定,包括比色、发光和荧光等方法。然而,这些方法都有一定的缺点,如灵敏度较差,繁琐的材料合成和复杂的化学反应。因此,对于末端转移酶的检测,简便、快速、灵敏的方法的开发仍然是一个巨大的挑战。本发明基于DNA模板化的银纳米簇(简写AgNCs)及Ag的溶出伏安信号输出,发展了一种新型电化学生物传感器,用于TdT和Exo I的活性检测。巯基DNA与金电极表面自发形成Au-S共价键而被固定于金电极表面,随后,TdT催化三磷酸脱氧胞嘧啶核苷酸(dCTP)在DNA的3’-OH末端延伸聚合,形成富C DNA长链,基于此合成的AgNCs作为信号输出,TdT浓度变化影响电化学信号的输出,从而实现TdT活性的检测。同时,在TdT发挥工具酶作用之前,在体系中引入Exo I,可以水解固定在金电极表面的巯基DNA,而不能形成AgNCs,导致信号下降,Exo I浓度变化影响电化学信号的输出。本发明所制备的传感器对核酸酶相关疾病诊断或核酸酶功能评估具有较大的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的同时检测Exo I和TdT的电化学生物传感器的制备方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种同时检测Exo I和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用,具体步骤如下:
(1)传感器的制备
Electrode 1的制备:
首先将金电极(直径为2mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末抛光5~10min,抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗5~10min,然后用N2吹干,标记为Electrode 1。
Electrode 2的制备:
取巯基DNA溶液(2.5~15.0μL,5~10μM),滴涂于Electrode 1表面,在4℃冰箱孵育过夜,蒸馏水缓缓冲洗电极,采用1.0~2.0mM巯基己醇(MCH)处理30~50min,置换电极表面非Au-S键固定的巯基DNA,蒸馏水缓缓冲洗电极,标记为Electrode 2。
Electrode 3的制备:
于Electrode2电极表面,滴加2~10μL TdT反应液(组成为:1~5μL 5×TdT缓冲液,dCTP(1~3μL,5~10mM),TdT(0.1~3μL,0.01~100U/mL),加H2O至总体积为2~10μL),在32~40℃下放置1~3h,蒸馏水缓缓冲洗电极,标记为Electrode 3。
Electrode 4的制备:
向Electrode 3电极表面滴加Ag+(2.5~5.0μL,1~2μM),室温孵育15~20min,蒸馏水缓缓冲洗电极。再向电极表面滴加硼氢化钠溶液(NaBH4,2.5~5.0μL,1~2μM),室温下避光反应15~20min,蒸馏水缓缓冲洗电极,标记为Electrode 4。
(2)一种同时检测Exo I和TdT的电化学生物传感器的应用
在Electrode 3制备过程中,使用TdT延长前,引入Exo I溶液(终浓度为0~1000U/mL),37℃下孵育30~60min,用于传感器制备,然后如(1)步骤,制备一系列传感器,用来检测不同浓度Exo I的电化学响应。
在Electrode 3制备过程中,改变TdT浓度(终浓度为0~10U/mL),用于传感器制备,然后如(1)步骤,制备一系列传感器,用来检测不同浓度TdT的电化学响应。
本发明构建了一种同时检测Exo I和TdT的电化学生物传感器。利用方波伏安法,设置电位范围为0~0.3V,振幅为25mV,检测传感器在磷酸缓冲溶液(PBS,0.1M,pH 7.0)中的电化学响应,获得一系列不同浓度的Exo I和TdT对应的溶出伏安电流大小,建立电流响应与Exo I和TdT浓度对数之间的定量关系,根据两者之间的定量关系,确定待测样品中ExoI和TdT的含量。
发明原理:巯基DNA与金电极表面自发形成Au-S共价键而被固定于金电极表面。随后,TdT催化巯基DNA的3’-OH末端与dCTP聚合,生成的富C DNA长链可用来形成AgNCs,通过Ag的溶出伏安信号来检测TdT活性。TdT聚合作用前,引入Exo I,可以水解巯基DNA,从而最终影响AgNCs的形成,基于此可以检测Exo I活性。改变Exo I或TdT浓度会影响电化学信号的大小,利用此原理制备了一种高效的同时检测Exo I和TdT的电化学生物传感器。
相对于现有技术,本发明所述的一种同时检测Exo I和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用具有以下优势:
(1)高灵敏度。实验得出传感器的电流响应对Exo I浓度对数值的线性相关方程为y=-7.12lgCExo I+20.4,R2=0.9951,线性范围为0.1~500U/mL,检测限为0.05U/mL;传感器的电流响应对TdT浓度对数值的线性相关方程为y=7.51lgCTdT+22.9,R2=0.9982,线性范围为0.001~5.0U/mL,检测限为0.0003U/mL。由此说明传感器对Exo I和TdT及其小分子抑制剂可实现高灵敏检测。
(2)高特异性。人体中其他常见的酶如碱性磷酸酶(ALP)、胆固醇氧化酶(ChOx)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、溶菌酶(LZM)、木瓜蛋白酶(Papain)、蛋白激酶(PKA)对Exo I和TdT活性检测均无干扰。
(3)结果准确。在细胞裂解液中,回收率均在90%~110%之间。
(4)制备与检测方法试剂用量少、检测速度快、成本低。
(5)传感器可用于Exo I和TdT的抑制剂筛选,传感器的电流响应对Exo I抑制剂聚乙二醇的半抑制浓度(IC50)为0.60mM,传感器的电流响应对TdT抑制剂焦磷酸钠的半抑制浓度(IC50)为1.26mM,对于临床诊断意义重大。
综上所述,本发明是一种同时检测Exo I和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用,具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点,可以同时实现低浓度Exo I和TdT检测,具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明传感器的制备过程不同修饰电极的电化学响应图;
图2为本发明传感器对Exo I的可行性实验图;
图3为本发明传感器对Exo I的电流响应对浓度的校准曲线图;
图4为本发明传感器对Exo I的选择性实验图;
图5为本发明传感器对Exo I的抑制剂聚乙二醇的校准曲线图;
图6为本发明传感器对TdT的可行性实验图;
图7为本发明传感器对TdT的电流响应对浓度的校准曲线图;
图8为本发明传感器对TdT的选择性实验图;
图9为本发明传感器对TdT的抑制剂焦磷酸钠的校准曲线图;
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1 传感器的制备
(1)电化学生物传感器的具体制备步骤如下:
Electrode 1的制备:
首先将金电极(直径为2mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末抛光5min,抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗5min,然后用N2吹干,标记为Electrode 1。
Electrode 2的制备:
取巯基DNA溶液(2.5μL,10μM),滴涂于Electrode 1表面,在4℃冰箱孵育过夜,蒸馏水缓缓冲洗电极,采用1.0mM巯基己醇(MCH)处理30min,置换电极表面非Au-S键固定的巯基DNA,蒸馏水缓缓冲洗电极,标记为Electrode 2。
Electrode 3的制备:
于Electrode 2电极表面,滴加5.0μL TdT反应液(组成为:1μL 5×TdT缓冲液,dCTP(1μL,10mM),TdT(0.5μL,50U/mL),加H2O至总体积为5μL),在37℃下放置1h,蒸馏水缓缓冲洗电极,标记为Electrode 3。
Electrode 4的制备:
向Electrode 3电极表面滴加Ag+(2.5μL,1μM),室温孵育20min,蒸馏水缓缓冲洗电极。再向电极表面滴加硼氢化钠溶液(NaBH4,2.5μL,1μM),室温下避光反应15min,蒸馏水缓缓冲洗电极,标记为Electrode 4。
如实施例1制备Electrode 1~Electrode 4,并检测其在PBS(0.1M,pH 7.0)溶液的电化学响应。利用方波伏安法,设置电位范围为0~0.3V,振幅为25mV。从图1可以看出:Electrode 4在PBS(0.1M,pH7.0)中有明显的电化学响应信号,其它电极的电化学响应信号几乎可以忽略,证明传感器制备成功且有良好的电化学响应。
实施例2 可行性实验
在实施例1的Electrode 3制备过程中,使用TdT延长前,引入Exo I溶液(终浓度为500U/mL),37℃下孵育30min,用于传感器制备,然后如(1)步骤,制备传感器,用来检测ExoI的电化学响应。同时利用如实施例1制备的传感器,检测TdT的电化学响应。
利用方波伏安法,设置电位范围为0~0.3V,振幅为25mV。结果如图2、3所示:当无Exo I时,电化学生物传感器有明显的响应信号,而存在Exo I时,电化学生物传感器在PBS(0.1M,pH 7.0)中几乎没有响应信号(如图2)。证明了该传感器可以用于Exo I活性检测。相反,当存在TdT时,电化学生物传感器在PBS(0.1M,pH 7.0)中有明显的电化学响应信号,而无TdT时,电化学生物传感器的响应信号几乎可以忽略(如图3)。证明了该传感器可以用于TdT活性检测。
实施例3 不同浓度Exo I活性的检测
在制备Exo I电化学传感器的过程中,改变Exo I浓度(控制终浓度分别为:0、0.1、0.2、0.5、0.8、1、2、5、10、20、50、100、200、500、800、1000U/mL)。实验结果如图4所示,传感器的电流响应对Exo I浓度对数值的线性范围在0.1~500U/mL,线性相关方程为y=-7.12lgCExo I+20.4,R2=0.9951,检测限为0.05U/mL,说明传感器对Exo I活性可实现高灵敏检测。
实施例4 选择性实验
在制备Exo I电化学传感器的过程中,将Exo I替换为其它酶(如碱性磷酸酶(ALP)、胆固醇氧化酶(ChOx)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、溶菌酶(LZM)、木瓜蛋白酶(Papain)、蛋白激酶(PKA)),浓度均为500U/mL,blank为缺少Exo I时的电化学信号值。结果如图5所示,与Exo I对比,传感器对其他酶的电化学响应与空白一致,而且都与Exo I存在显著差异,说明传感器对Exo I的检测具有优秀的选择性。
实施例5 Exo I抑制剂聚乙二醇的检测
在制备Exo I电化学传感器的过程中,将不同浓度的聚乙二醇(控制终浓度分别为:0、0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2、2.5、5、8mM)添加到Exo I反应液中。根据实验结果得知(如图6),随着抑制剂聚乙二醇浓度的增大,相对应的电流响应越强,说明聚乙二醇对Exo I活性的抑制作用越强,IC50为0.60mM。
实施例6 不同浓度TdT活性的检测
在实施例1 Electrode 3的制备过程中,改变TdT浓度(控制终浓度分别为0、0.001、0.002、0.004、0.005、0.008、0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.2、0.5、1、2、5、8、10U/mL),如实施例1制备一系列电化学生物传感器。实验结果如图7所示,传感器的电流响应对TdT浓度的对数值线性范围在0.001~5U/mL,线性相关方程为y=7.51lgCTdT+22.9,R2=0.9982,检测限为0.0003U/mL,说明传感器对TdT活性可实现高灵敏检测。
实施例7 选择性实验
在实施例1 Electrode 3的制备过程中,将TdT替换为其它酶(如碱性磷酸酶(ALP)、胆固醇氧化酶(ChOx)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、溶菌酶(LZM)、木瓜蛋白酶(Papain)、蛋白激酶(PKA)),浓度均为5U/mL,blank为缺少TdT时的电化学信号值。结果如图8所示,与TdT对比,传感器对其他酶的电化学响应非常小,基本接近空白信号,说明传感器对TdT检测具有很好的选择性。
实施例8 TdT抑制剂焦磷酸钠的检测
在实施例1 Electrode 3的制备过程中,在TdT反应液中添加不同浓度的焦磷酸钠(PP)(控制终浓度分别为:0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、1.5、1.8、2、2.5、3、4、5、6、8、10mM),如实施例1制备一系列电化学生物传感器。根据实验结果得知(如图9),随着抑制剂PP浓度的增大,相对应的电流响应越强,说明PP对TdT活性的抑制作用越强,IC50为1.26mM。
当然,上述说明并非对本发明的限制,本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换,也应属于本发明保护范围。
Claims (4)
1.一种同时检测Exo I和TdT的电化学生物传感器,其特征在于,具体机理如下:巯基DNA与金电极表面自发形成Au-S共价键而被固定于金电极表面,随后,TdT催化巯基DNA的3’-OH末端与三磷酸脱氧胞嘧啶核苷酸dCTP聚合,生成的富C DNA长链可用来形成AgNCs,通过Ag的溶出伏安信号来检测TdT活性;在TdT聚合作用前,引入Exo I,可以水解巯基DNA,从而最终影响AgNCs的形成,基于此可以检测Exo I活性,改变Exo I或TdT浓度会影响电化学信号的大小。
2.根据权利要求1所述的电化学生物传感器的应用,其特征在于,用于不同浓度Exo I和TdT的检测,Exo I检测限为0.05U/mL;TdT检测限为0.0003U/mL。
3.权利要求2所述的应用,其特征在于,应用方法具体包括如下步骤:
(1)传感器的制备
Electrode 1的制备:
首先将直径为2mm金电极在麂皮上用三氧化二铝粉末抛光5~10min,抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗5~10min,然后用N2吹干,标记为Electrode 1;
Electrode 2的制备:
取巯基DNA溶液,滴涂于Electrode 1表面,在4℃冰箱孵育过夜,蒸馏水缓缓冲洗电极,采用1.0~2.0mM巯基己醇MCH理30~50min,置换电极表面非Au-S键固定的巯基DNA,蒸馏水缓缓冲洗电极,标记为Electrode 2;
Electrode 3的制备:
于Electrode 2电极表面,滴加2~10μL TdT反应液,在32~40℃下放置1~3h,蒸馏水缓缓冲洗电极,标记为Electrode 3;
Electrode 4的制备:
向Electrode 3电极表面滴加Ag+,室温孵育15~20min,蒸馏水缓缓冲洗电极;再向电极表面滴加硼氢化钠溶液,室温下避光反应15~20min,蒸馏水缓缓冲洗电极,标记为Electrode 4;
其中,巯基DNA溶液用量为2.5~15.0μL,浓度为5~10μM;
所述TdT反应液组成为:1~5μL 5×TdT缓冲液;dCTP用量1~3μL,浓度5~10mM;TdT用量0.1~3μL,浓度0.01~100U/mL,加H2O至总体积为2~10μL;
所述Ag+用量为2.5~5.0μL,浓度为1~2μM;
所述硼氢化钠溶液用量为2.5~5.0μL,浓度为1~2μM;
(2)同时检测Exo I和TdT
(2.1)在Electrode 3制备过程中,使用TdT延长前,引入Exo I溶液,37℃下孵育30~60min,用于传感器制备,然后如(1)步骤,制备一系列传感器,用来检测不同浓度Exo I的电化学响应;
其中,Exo I溶液终浓度为0~1000U/mL;
(2.2)在Electrode 3制备过程中,改变TdT浓度,用于传感器制备,然后如(1)步骤,制备一系列传感器,用来检测不同浓度TdT的电化学响应;
其中,改变TdT浓度的终浓度为0.01~10U/mL。
4.根据权利要求1所述的电化学生物传感器的应用,其特征在于,用于Exo I和TdT的小分子抑制剂的筛选,Exo I抑制剂聚乙二醇的IC50为0.60mM;TdT抑制剂焦磷酸钠的IC50为1.26mM。
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Application publication date: 20190607 Assignee: Ningbo Science and Technology Innovation Association Assignor: Ningbo University Contract record no.: X2023980033633 Denomination of invention: Preparation method and application of an electrochemical biosensor for simultaneous detection of Exo I and TdT Granted publication date: 20210209 License type: Common License Record date: 20230317 |
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