CN110646487B - 用于双氧水和末端转移酶检测的电化学传感器及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于G4堆叠自组装体的电化学方法及其在双氧水和末端转移酶检测中的应用，具体步骤如下：(1)金电极预处理；(2)Electrode 1：滴加DNA1，常温放置；(3)Electrode 2：在Electrode 1上滴加反应混合液，孵育使DNA1延长生成随机排布的富G的DNA长链。在电极上滴加KCl溶液；(4)Electrode 3：在Electrode 2上滴加混合液【MgCl2+G4链】，常温下放置形成G4堆叠自组装体。滴加hemin，常温下放置使G4与hemin充分作用形成具有辣根过氧化物酶活性的G4‑hemin复合物，即为过氧化氢电化学生物传感器。改变过氧化氢浓度或TdT浓度，探究所制备的一系列传感器对电化学信号的影响。优点是特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种信号放大的电化学方法，尤其是涉及一种基于G4堆叠自组装体的电化学方法及其在双氧水和末端转移酶检测中的应用，属于功能生物材料和生物传感技术领域。
背景技术
鸟嘌呤四链体是一种高度折叠的核酸结构，包括了多个连续堆叠的鸟嘌呤平面。这些独特的结构参与了基因的正反馈和负反馈调节，以及保持端粒的稳定性和作为化学治疗中的抗癌靶向分子。除了鸟嘌呤四链体自身在生命中有着重要的意义，其结合hemin 形成复合物具有的过氧化物酶性质也吸引了很多科学工作者的关注。这种具有过氧化物酶活性的DNA酶可以作为信号产生者检测各种目标，比如金属离子、小分子、核酸、蛋白质和活细胞等。由于DNA的合成保存条件简单，使用条件温和，这类DNA酶被广泛应用于各种生物分析中。
过氧化氢(H2O2)在多种领域中具有重要作用，如各种有机化合物、食品和农业、制药、生物、临床、环境和化学工业以及燃料电池的合成。因此，值得努力开发一种快速、简便、准确、可靠的H2O2测定方法。已经使用许多分析方法来测定H2O2，例如滴定法、分光光度法、化学发光法、色谱法和电化学法。其中，由于其价廉、有效、简单和高灵敏度的特性，电化学方法获得广泛的关注。然而，在裸电极上直接氧化或还原H2O2具有诸如缓慢的电子转移动力和氧化还原反应的高过电位的缺点。
一种独特的DNA聚合酶，称为末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。TdT可在不涉及模板的情况下催化聚合。TdT产生的DNA序列是非特异性的并且几乎是随机的，而且它们的序列组成很大程度上取决于底物脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)库的构成。因此，可以预期通过TdT聚合使用G获得随机排列的富G序列。丰富的dNTP池。另一方面， TdT的病理学意义已经通过胚细胞中的TdT活性作为重要的生物标志物这一事实得到证实。此外，TdT被广泛用作标记DNA末端，DNA末端快速扩增(RACE)和凋亡细胞检测的分子生物学工具。传统的TdT检测依赖于生化分析、免疫分析和凝胶电泳。然而，所有这些方法都需要放射性或荧光标记的DNA或核苷酸以及涉及的多步骤检测，这是耗时、耗力、且昂贵的。因此，开发简便的无标记方法以监测TdT的活性仍然是一个挑战。
本发明提出了一种基于G4堆叠自组装体的电化学方法，通过TdT聚合制备随机富含G的DNA序列的简便方法，并证明这种随机富含G的DNA能够形成G-四链体。巯基修饰的DNA探针(DNA1)通过金-硫键组装在金电极上，利用TdT催化dGTP和 dATP随机引入DNA末端，然后用钾离子诱导形成游离的G-四链体单体溶液使之在电极上随机形成N个G-四链体结构。在镁离子的存在下的缓冲溶液中，引入新的特定序列G-四链体(DNA2)快速在延伸链上随机堆叠形成G4堆叠自组装体，G4堆叠自组装体通过与hemin的结合，可以形成具有类辣根过氧化物酶催化性能的DNA酶，通过过氧化氢(H2O2)在3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)存在下发生化学反应产生电化学信号。目前，国内外尚未发现基于G4堆叠自组装体的H2O2和TdT电化学传感策略的相关报导。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的一种基于G4堆叠自组装体的电化学方法及其在双氧水和末端转移酶检测中的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于G4堆叠自组装体的电化学方法及其在双氧水和末端转移酶检测中的应用，具体步骤如下：
(1)金电极预处理：将金电极(Au)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.05μm)抛光 0.5～4min，抛光后将电极用二次蒸馏水于超声清洗器中超声清洗2～10min。然后用氮气吹去金电极表面水珠，用滤纸擦干电极外部，备用。
(2)Electrode 1：从冰箱中取出修饰好的电极，用移液枪准确滴加DNA1(0.01～1μM，2～10μL)，常温放置0.3～1.6h。
(3)Electrode 2：在Electrode 1上滴加反应混合液【0.5～5μL二次蒸馏水+dATP(0.1～1μL，1～30mM)+dGTP(0.15～1.5μL，1～30mM)+TdT(0.1～5μL，1～500U/L) +0.1～2μL 5×TdT buffer】，在28～40℃下孵育0.5～1.7h使DNA1延长生成随机排布的富 G的DNA长链。然后在电极上滴加KCl溶液(1～7μL，0.05～2mM)，常温下孵育20～90 min。
(4)Electrode 3：在Electrode 2上滴加混合液【MgCl2(0.06～0.3M，0.5～3μL) +DNA2(0.1～3μM，0.5～5μL)】，常温下放置0.5～1.2h形成G4堆叠自组装体。然后滴加hemin(0.05～2mM，1～10μL)，常温下放置20～90min，使G4与hemin充分作用形成具有辣根过氧化物酶活性的G4-hemin复合物，得所需传感器。
在上述每个步骤之后，这些修饰电极均用二次蒸馏水缓缓冲洗。
DNA探针(DNA1)：5’-NH2-AGGACT-3’。
DNA G链(DNA2)：5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’。
发明原理：利用上述一种基于G4堆叠自组装体的电化学方法，采用巯基修饰的DNA1探针通过金-硫键组装在金电极上，利用TdT催化dGTP和dATP随机引入DNA1 末端，然后用钾离子诱导形成N个G4结构。在镁离子的存在下，引入新的特定序列G- 四链体(DNA2)快速堆叠到延长链上的G4上，形成G4堆叠自组装体，该自组装体通过与hemin的结合，具有类辣根过氧化物酶活性。通过过氧化氢(H2O2)在3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)存在下发生化学反应产生电化学信号。显然，在浓度一定范围内，目标物浓度越大，电流响应越明显。实验结果表明，电流的大小与目标物的浓度在一定范围内呈线性关系，可实现对目标物的检测。其优点在于：
(1)高灵敏度。实验得出传感器的电流响应对过氧化氢浓度的线性相关方程为y＝- -8.74x-2.43，R2＝0.9973，检测限为0.21μM，由此说明传感器对过氧化氢可实现高灵敏度检测；传感器的电流响应对TdT浓度的对数线性相关方程为y＝-14.64x-31.73， R2＝0.9979，检测限为0.003U/L，说明传感器对TdT活性实现高灵敏度检测。
(2)高特异性。其他常见的物质如尿酸、柠檬酸、多巴胺、葡萄糖和氯化钙对本检测体系均无干扰。其他常见的酶如乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶和碱性磷酸酶对本检测体系均无干扰。
(3)结果准确。回收率均在90％～110％之间。
(4)制备与检测方法试剂用量少、检测速度快、成本低。本发明只需消耗少量材料和试剂就可实现对过氧化氢和脱氧核苷酸末端转移酶的高灵敏检测。
综上所述，本发明制备一种基于G4堆叠自组装体的电化学方法及其在双氧水和末端转移酶检测中的应用，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现低浓度过氧化氢和TdT活性的检测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明传感器的不同修饰电极对比的电化学响应；
图2为本发明传感器的可行性实验图；
图3为本发明传感器的电化学响应对过氧化氢浓度的校准曲线图；
图4为本发明传感器对过氧化氢的选择性实验图；
图5为本发明传感器的为本发明传感器的电化学响应对TdT浓度对数的校准曲线图；
图6为本发明传感器对TdT的选择性实验图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1传感器的制备
(1)金电极预处理：将金电极(Au)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.05μm)抛光2min，抛光后将电极用二次蒸馏水于超声清洗器中超声清洗2min。然后用氮气吹去金电极表面水珠，用滤纸擦干电极外部，备用。
(2)Electrode 1：从冰箱中取出修饰好的电极，用移液枪准确滴加DNA1(0.1μM， 2μL)，常温放置1h。
(3)Electrode 2：在Electrode 1上滴加反应混合液【2μL二次蒸馏水+dATP(0.4 μL，10mM)+dGTP(0.6μL，10mM)+TdT(1μL，10U/L)+1μL 5×TdT buffer】，在 37℃下孵育1h使DNA1延长生成随机排布的富G的DNA长链。然后在电极上滴加 KCl溶液(2μL，1mM)，常温下孵育30min。
(4)Electrode 3：在Electrode 2上滴加混合液【MgCl2(0.12M，2μL)+G4(1μM， 2μL)】，常温下放置1h形成G4堆叠自组装体。然后滴加hemin(0.2mM，2μL)，常温下放置30min，使G4与hemin充分作用形成具有辣根过氧化物酶活性的G4-hemin 复合物，得所需传感器。
利用循环伏安法，设置电位范围为-1.0～0V，扫速为50mV/s，检测上述制备的电极在浓度为100.0mM、pH＝7.0的PBS缓冲液中对7mM H2O2的电化学响应。结果如图1 所示，裸金电极、Electrode 1和Electrode 2基本无电化学响应，而Electrode 3的电化学响应明显，证明传感器制备成功。
实施例2可行性实验
制备传感器的过程中，同具体实施例1，探究传感器制备过程中，有无hemin制得的传感器对过氧化氢的电化学响应对比，结果如图2，证明hemin与G4的结合有类辣根过氧化物酶催化性能，也证明传感器可用于对下一步的应用研究。
实施例3过氧化氢检测
利用循环伏安法，设置电位范围为-1.0～0V，扫速为50mV/s，检测传感器在浓度为100.0mM、pH＝7.0的PBS缓冲液中对H2O2的电化学响应，H2O2浓度的范围为0～8mM。试验结果说明，如图3所示，说明随着过氧化氢浓度的增大，传感器对过氧化氢的电化学响应越明显；传感器对过氧化氢的电流响应对浓度的线性相关方程为y＝-8.74x-2.39， R2＝0.9973，线性范围为0.001～7mM，根据S/N计算得知，检测限为0.21μM。说明传感器对过氧化氢可实现高灵敏度检测。
实施例4特异性检测
采用循环伏安法，扫描速度为50mV/s，检测电位-1.0～0V，上述具体实施例1制备的传感器分别对含浓度为5mM的H2O2、尿酸(UA)、柠檬酸(CA)、葡萄糖(GLC)、多巴胺(DA)、氯化钙(CaCl2)的PBS溶液的检测。结果如图4所示，与过氧化氢对比，传感器对其他还原性物质的电化学响应非常小，基本接近空白信号，说明传感器对于过氧化氢的检测有很好的选择性。
实施例5 TdT活性检测
利用循环伏安法，设置电位范围为-1.0～0V，扫速为50mV/s，检测传感器在浓度为100.0mM、pH＝7.0的PBS缓冲液中对TdT的电化学响应，TdT浓度的范围为0～20U/L。实验结果说明，如图5所示，说明随着过TdT浓度的增大，传感器对TdT的电化学响应越明显；传感器对TdT的电流响应对浓度的线性相关方程为y＝-14.64x-31.73， R2＝0.9979，线性范围为0.01～20U/L，根据S/N计算得知，检测限为0.003U/L。说明传感器对TdT可实现高灵敏度检测。
实施例6特异性检测
采用循环伏安法，扫描速度为50mV/s，检测电位-1.0～0V，上述具体实施例1制备的传感器分别对含浓度为10U/L的乙酰胆碱酯酶(AChE)、胆碱氧化酶(ChOx)、溶菌酶(LZM)、木瓜蛋白酶(Papain)和碱性磷酸酶(ALP)的PBS溶液的检测。结果如图 6所示，与TdT对比，传感器对其他酶的电化学响应非常小，基本接近空白信号，说明传感器对TdT的检测有很好的选择性。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。
Claims (5)
1.一种用于双氧水和末端转移酶TdT检测的基于G4堆叠自组装体的电化学传感器的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：
(1)金电极预处理：将金电极Au在麂皮上用三氧化二铝粉末抛光0.5～4min，抛光后将电极用二次蒸馏水于超声清洗器中超声清洗2～10min，然后用氮气吹去金电极表面水珠，用滤纸擦干电极外部，备用；
(2)Electrode 1：从冰箱中取出修饰好的电极，用移液枪准确滴加DNA1，常温放置0.3～1.6h；
其中所述DNA1为DNA探针：5’-NH2-AGGACT-3’；其浓度为0.01～1μM，用量为2～10μL；
(3)Electrode 2：在Electrode 1上滴加反应混合液，在28～40℃下孵育0.5～1.7h使DNA1延长生成随机排布的富G的DNA长链，然后在电极上滴加KCl溶液，常温下孵育20～90min；
其中所述反应混合液组成如下：0.5～5μL二次蒸馏水、0.1～1μL浓度为1～30mM的dATP、0.15～1.5μL浓度为1～30mM的dGTP、0.1～5μL浓度为1～500U/L的TdT、0.1～2μL 5×TdTbuffer；
所述KCl溶液用量为1～7μL、0.05～2mM；
(4)Electrode 3：在Electrode 2上滴加混合液，常温下放置0.5～1.2h形成G4堆叠自组装体；然后滴加hemin，常温下放置20～90min，使G4与hemin充分作用形成具有辣根过氧化物酶活性的G4-hemin复合物，得所需传感器；
其中所述混合液组成如下：0.5～3μL浓度为0.06～0.3M的MgCl2、0.5～5μL浓度为0.1～3μM的DNA2；所述DNA2为DNA G链：5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’；
所述hemin用量为1～10μL、浓度为0.05～2mM。
2.根据权利要求1所述的制备方法制备的基于G4堆叠自组装体的电化学传感器。
3.根据权利要求2所述的基于G4堆叠自组装体的电化学传感器在双氧水和末端转移酶TdT检测中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，检测双氧水的方法如下：利用循环伏安法，设置电位范围为-1.0～0V，扫速为50mV/s，检测传感器在浓度为100.0mM、pH＝7.0的PBS缓冲液中对双氧水的电化学响应；传感器对过氧化氢的电流响应对浓度的线性相关方程为y＝-8.74x-2.39，R2＝0.9973，线性范围为0.001～7mM，检测限为0.21μM。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，检测末端转移酶TdT的方法如下：利用循环伏安法，设置电位范围为-1.0～0V，扫速为50mV/s，检测传感器在浓度为100.0mM、pH＝7.0的PBS缓冲液中对TdT的电化学响应；传感器对TdT的电流响应对浓度的线性相关方程为y＝-14.64x-31.73，R2＝0.9979，线性范围为0.01～20U/L，检测限为0.003U/L。
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