CN105936933A - 运用dna模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种运用DNA模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法，包括以下步骤：（1）三叶青真伪差异序列的获得以及待测物PCR产物的获取；（2）对待测物PCR产物采用链置换循环信号放大技术比色可视化来鉴定三叶青真伪，具体是通过酶切链置换循环反应使得体系中产生大量能形成G‑四链体的富G序列，在K+和Hemin存在下形成G‑四链体‑hemin DNA模拟酶，此酶具有类似辣根过氧化物酶的活性能催化ABTS2‑‑H2O2体系显色。从而实现可视化鉴别三叶青真伪。本发明成本低，DNA培育方法简单，重现性好；稳定性好，且避免了凝胶电泳分析节省了大量时间能够直接用于快速可视化鉴别三叶青真伪，有望在药材市场及食品安全领域得到广泛应用。

Description

运用DNA模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法
技术领域
本发明涉及一种分子标记领域，特别是运用DNA模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法。
背景技术
三叶青学名三叶崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)为葡萄科崖爬藤属多年生草本植物，别名金线吊葫芦、三叶对等，是我国南方少数省份的珍稀中药资源，以块根或全草入药。是抗肿瘤常用药物，其主要活性成份对肝癌、肺癌、血癌等细胞株具有“促凋亡作用”，也可用于治疗小儿高热惊厥、百日咳、疔疮痈疽、淋巴结结核、痢疾、支气管炎、肺炎、咽喉炎、肝炎及病毒性脑膜炎，外用治毒蛇咬伤，扁桃体炎，蜂窝织炎，跌打损伤。由于市场上三叶青的需求量逐渐增大，过度的开采和环境的恶化等原因，其野生资源濒临灭绝，已被列入“浙江省首批种质资源保护名录”。近年来三叶青药材价格飙升，在经济利益的驱使下，药材市场上出现了乌头子根、土圜儿、大青藤等多种伪品，近年来杭州等地先后出现多起患者服用混入乌头子根的含三叶青饮片中药中毒事件。
目前传统的中草药材的鉴定方法有成分分析法、外部形态分析法和显微结构分析。但由于植物的根部大多形态相似且加工过后破坏原有的形态和显微结构，造成鉴定困难。另外，受生长周期、贮存条件、炮制方法和生长环境等多方面的影响，同一药材的化学成分含量会有明显变化，所以仅靠形态特征和化学特征的分析已经不足以对某些植物药材进行准确的鉴定。中药材DNA鉴定技术不受生长发育阶段、供试部位、环境条件的影响，直接利用DNA序列进行物种的鉴定，具有独一无二的准确性和可重复性。
中国专利申请201310373809.4公开了一种鉴定药用植物三叶青的方法，但该方法对于一些近缘物种具有假阳性信号，且对常见伪品大青藤没有进行验证，具有一定的局限性。随着研究的深入，中国专利申请201510016355.4公开了一种快速鉴别三叶青及其多种伪混品的PCR-RFLP方法。该方法采用通用引物特异PCR扩增植物核rDNA的内转录间隔区间(internal transcribed spacer，ITS)的ITS2序列，通过DNA测序获得真伪品的ITS2序列信息。再经限制性内切酶NCO I消化PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳分析药材三叶青具有限制性内切酶NCO I的特异识别序列，消化后产生2条DNA片段，大小分别为335bp和200bp左右。而各种伪品均不被NCO I识别，成功的鉴定了三叶青及其多种混伪品。但唯一的不足在于耗时且每次鉴定都需要借助凝胶电泳分析来完成。
因此为了保障临床用药安全，发明一种能够快速准确辨别三叶青真伪的方法势在必行。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术的不足而提供一种能够快速准确鉴定真伪的运用DNA模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法。
为了实现上述目的，本发明所设计的运用DNA模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法，包括以下步骤：
步骤A、三叶青真伪品DNA的提取：分别采用植物DNA提取CTAB法来提取三叶青真品和三叶青伪品的DNA；
步骤B、三叶青真伪品ITS2DNA序列的获得：通过对提取的三叶青真伪品DNA进行PCR特异性扩增以获得三叶青真伪品的ITS2DNA序列，其中扩增所用到的引物为已经报道的被子植物的ITS2序列的通用引物，其正向引物为：5’—ATGCGATACTTGGTGTGAAT—3’；反向引物为：5’—GACGCTTCTCCAGACTACAAT—3’；
步骤C、三叶青真伪品差异序列的获得：分别对上述三叶青真伪品ITS2DNA序列进行测序，测序结果用DNAstar软件进行序列比对获得了三叶青真伪品差异序列，其中三叶青真品差异序列为5’—TTTTAACCAACCACGGATGCGATGTTCCAT—3’，三叶青伪品差异序列为
5’—ACCCTACGCAACGCTACCGTGAGACATTTG—3’；
步骤D、待测物PCR产物的获得：提取待测物的DNA，然后对该待测物的DNA序列进行PCR特异性扩增以获得待测物PCR产物，其中所用到的上游引物的核苷酸序列为：5’—AAGGGAATCCTTGTAAGTTTCTTTT—3’，下游引物的核苷酸序列为：5’—AACATCGCATCCGTGGTTGGTTAAA—3’，所述上游引物的核苷酸序列和下游引物的核苷酸序列均是通过三叶青真伪品差异序列而设计的；
其中所述PCR特异性扩增的程序为95℃预变性5min；然后进入循环，95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸40sec，60个循环，最后72℃延伸10min。
步骤E、三叶青真伪鉴定：对待测物PCR产物采用链置换循环信号放大技术比色可视化来鉴定三叶青真伪，其具体包括以下步骤：
1)、待测物PCR产物与DNA探针杂交：先将DNA探针用HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸；N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸)缓冲液配成100μM溶液，其中DNA探针为5’—CCCAACCCGCCCTACCCAACCTCAGCATGGAACATCG—3’，后将待测物PCR产物和DNA探针分别在90℃加热5min以去除其自身二级结构，冷却至室温后，取2个预装有2μL DNA探针的离心管，其中一个是空白对照并加入2μL的二次水，另一个则加入2μL待测物PCR产物，在37℃下杂交培育40min；所述HEPES缓冲液的pH为7.4，其中包含200mM氯化钠和20mM氯化钾。
2)、酶切链置换产生富G序列：杂交完后，随后分别加入4μL dNTPS、0.2μL KlenowFragment exo-聚合酶、0.2μL Nb.BbvCI内切酶、2μL10×反应缓冲液1、2μL10×反应缓冲液2，最终加入二次水使得体系达到20μL并于37℃反应40min；所述反应缓冲液1为10×reaction buffer(随Klenow Fragment exo-聚合酶提供)，具体PH为8.0的500mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲液，其中包含50mM氯化镁和10mM二硫苏糖醇。所述反应缓冲液2为10×NEBuffer(随Nb.BbvCI内切酶提供)。
3)、酶终止反应：反应结束后立即将温度上升至80℃恒温20min使得酶失活；
4)、G-四链体-hemin DNA酶的培育：冷却至室温，加入0.8μL hemin于37℃培育1h以形成G-四链体-hemin DNA酶；
5)、比色可视化鉴定：培育结束后加入6μL ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)、1μL H2O2加入HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸；N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸)缓冲液至体系为200μL，观察颜色变化，其中只有三叶青真品的DNA序列才能使体系显绿色。
上述利用比色可视化来鉴定三叶青真伪的工作原理是常见的DNA是由两条链通过Watson-Crick碱基配对形成的双螺旋结构。然而，富含鸟嘌呤G的重复DNA序列可形成四链螺旋结构，被称为G-四链体(G-quadruplex)。G-四链体-hemin DNA酶是由一段能形成G-四链体的DNA序列与hemin(氯化血红素)结合的具有类辣根过氧化物酶(HRP)活性的复合物，也被称为DNA过氧化物酶。G-四链体-hemin DNA酶的DNA片段首先可形成G-四链体，K+位于两个G-四分体平面中间，与8个鸟嘌呤G的6位氧原子形成八配位稳定G-四链体；然后hemin作为平面型分子，中心的铁与卟啉环的4个氮原子发生配位作用，G-四分体平面的大共轭体系与Fe离子发生配位作用，形成了hemin-DNA复合物。形成的G-四链体-hemin DNA酶能催化ABTS2--H2O2体系发生显色反应，体系由无色变为绿色。
本发明得到的运用DNA模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法，其成本低，方法简单，重现性好；稳定性好，且避免了凝胶电泳分析节省了大量时间能够直接用于快速可视化鉴别三叶青真伪，有望在药材市场及食品安全领域得到广泛应用。
附图说明
图1是实施例的运用DNA模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法的流程图；
图2是实施例的运用DNA模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法中三叶青真伪品ITS2DNA序列比对的结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例1：
如图1所示，本实施例提供的运用DNA模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法，包括以下步骤：
步骤A、三叶青真伪品DNA的提取：分别采用植物DNA提取CTAB法来提取三叶青真品和三叶青伪品的DNA；其中三叶青真品来自于浙江、广西、湖南和江西等地区，三叶青伪品选用土圜儿。具体步骤如下：
(1)将10mL CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)分离缓冲液(CTAB分离缓冲液为：2％十六烷基三甲基溴化铵、20mM乙二胺四乙酸二钠盐、100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(PH＝8.0)、1.4M氯化钠、0.2％巯基乙醇)加入50mL离心管中，置于60水浴中预热。
(2)取2.0ɡ叶片，置于预冷的陶瓷研钵中，倒入液氮，迅速将叶片研碎。
(3)迅速取1.0ɡ研碎的叶片(勿使叶片回温)直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻微晃动混匀。
(4)样品于65℃水浴30分钟。
(5)加入10mL的氯仿-异戊醇(体积比24:1)，翻转离心管使之充分混匀。
(6)室温下4000rpm离心10分钟。
(7)用移液枪将上清液吸入另一干净的离心管中，加入其2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，使核酸沉淀下来。(有些情况下，这一步可以产生用玻璃棒搅起来的长链DNA，或者是云雾状的DNA，如果看不到DNA，样品则可以在室温下放置数小时甚至过夜)。
(8)如果呈可见的丝状DNA，可用玻璃棒搅起，转移至10-20mL洗涤缓冲液中(洗涤缓冲液为：76％乙醇和10mM乙酸铵混合液)。如果DNA呈云雾状，可在2000rpm离心1-2分钟，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀上加10-20mL洗涤缓冲液，轻轻转动离心管使核酸沉淀悬浮起来。
(9)洗涤20分钟。
(10)按照(8)法重新收集核酸，并按照(9)法二次洗涤。
(11)以2000rmp离心10分钟。小心吸去上清液，在室温下使DNA沉淀干燥。
(12)将DNA沉淀溶解于1.5mL TE缓冲液(TE缓冲液为：10mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸其PH为7.4，含1mM的乙二胺四乙酸二钠盐)中，于-20℃保存备用。
步骤B、三叶青真伪品ITS2DNA序列的获得：通过对提取的三叶青真伪品DNA进行PCR特异性扩增以获得三叶青真伪品的ITS2DNA序列，其中扩增所用到的引物为已经报道的被子植物的ITS2序列的通用引物，其正向引物为：5’—ATGCGATACTTGGTGTGAAT—3’；反向引物为：5’—GACGCTTCTCCAGACTACAAT—3’；
步骤C、三叶青真伪品差异序列的获得：分别对上述三叶青真伪品ITS2DNA序列进行测序，测序结果用DNAstar软件进行序列比对获得了三叶青真伪品差异序列，其中三叶青真品差异序列为5’—TTTTAACCAACCACGGATGCGATGTTCCAT—3’，三叶青伪品差异序列为
5’—ACCCTACGCAACGCTACCGTGAGACATTTG—3’；其比对的方法如下：
(1)将三叶青真伪品的ITS2DNA序列导入文本中，并将文本转换为FAS File格式；
(2)点击打开DNAstar中的Megalign.exe软件，点击工具栏左上角的File→EnterSequences，选择之前保存好的文本，点击打开→Done完成序列的导入；
(3)选中要对比的序列名称，点击工具栏中的Align→One Pair→By Wilbur-Lipman Method；选择默认参数点击OK即完成ITS2DNA序列比对。
(4)比对结果如图2所示，三叶青差异序列位于第290碱基至320碱基之间。
步骤D、待测物PCR产物的获得：提取待测物的DNA，然后对该待测物的DNA序列进行PCR特异性扩增以获得待测物PCR产物，其中所用到的上游引物的核苷酸序列为：5’—AAGGGAATCCTTGTAAGTTTCTTTT—3’，下游引物的核苷酸序列为：5’—AACATCGCATCCGTGGTTGGTTAAA—3’，所述上游引物的核苷酸序列和下游引物的核苷酸序列均是通过三叶青真伪品差异序列而设计的；
另外PCR特异性扩增体系为50μL反应体系，由以下成分组成：
成份 体积(μL)
Premix Taq 25
模板DNA 1
20μM上游引物 1
20μM下游引物 1
H2O(过氧化氢) 22
反应总体积 50
其中所述PCR特异性扩增的程序为95℃预变性5min；然后进入循环，95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸40sec，60个循环，最后72℃延伸10min。
步骤E、三叶青真伪鉴定：对待测物PCR产物采用链置换循环信号放大技术比色可视化来鉴定三叶青真伪，其具体包括以下步骤：
1)、待测物PCR产物与DNA探针杂交：先将DNA探针用HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸；N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸)缓冲液配成100μM溶液，其中DNA探针为5’—CCCAACCCGCCCTACCCAACCTCAGCATGGAACATCG—3’，后将待测物PCR产物和DNA探针分别在90℃加热5min以去除其自身二级结构，冷却至室温后，取2个预装有2μL DNA探针的离心管，其中一个是空白对照并加入2μL的二次水，另一个则加入2μL待测物PCR产物，在37℃下杂交培育40min；所述HEPES缓冲液的pH为7.4，其中包含200mM氯化钠和20mM氯化钾。
2)、酶切链置换产生富G序列：杂交完后，随后分别加入4μL dNTPS、0.2μL KlenowFragment exo-聚合酶、0.2μL Nb.BbvCI内切酶、2μL10×反应缓冲液1、2μL10×反应缓冲液2，最终加入二次水使得体系达到20μL并于37℃反应40min；所述反应缓冲液1为10×reaction buffer(随Klenow Fragment exo-聚合酶提供)，具体pH为8.0的500mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲液，其中包含50mM氯化镁和10mM二硫苏糖醇。所述反应缓冲液2为10×NEBuffer(随Nb.BbvCI内切酶提供)。
3)、酶终止反应：反应结束后立即将温度上升至80℃恒温20min使得酶失活；
4)、G-四链体-hemin DNA酶的培育：冷却至室温，加入0.8μL hemin于37℃培育1h以形成G-四链体-hemin DNA酶；
5)、比色可视化鉴定：培育结束后加入6μL ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)、1μL H2O2加入HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸；N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸)缓冲液至体系为200μL，观察颜色变化，其中只有三叶青真品的DNA序列才能使体系显绿色。

Claims (4)

1.一种运用DNA模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A、三叶青真伪品DNA的提取：分别采用植物DNA提取CTAB法来提取三叶青真品和三叶青伪品的DNA；
步骤B、三叶青真伪品ITS2 DNA序列的获得：通过对提取的三叶青真伪品DNA进行PCR特异性扩增以获得三叶青真伪品的ITS2 DNA序列，其中扩增所用到的引物为已经报道的被子植物的ITS2序列的通用引物，其正向引物为5’—ATGCGATACTTGGTGTGAAT—3’；反向引物为5’—GACGCTTCTCCAGACTACAAT—3’；
步骤C、三叶青真伪品差异序列的获得：分别对上述三叶青真伪品ITS2 DNA序列进行测序，测序结果用DNAstar软件进行序列比对获得了三叶青真伪品差异序列，其中三叶青真品差异序列为5’—TTTTAACCAACCACGGATGCGATGTTCCAT —3’，三叶青伪品差异序列为
5’—ACCCTACGCAACGCTACCGTGAGACATTTG—3’；
步骤D、待测物PCR产物的获得：提取三叶青待测物的DNA，然后对该待测物的DNA序列进行PCR特异性扩增以获得待测物PCR产物，其中所用到的上游引物的核苷酸序列为：5’—AAGGGAATCCTTGTAAGTTTCTTTT— 3’，下游引物的核苷酸序列为：5’—AACATCGCATCCGTGGTTGGTTAAA —3’，所述上游引物的核苷酸序列和下游引物的核苷酸序列均是通过三叶青真伪品差异序列而设计的；
步骤E、三叶青真伪鉴定：对待测物PCR产物采用链置换循环信号放大技术比色可视化来鉴定三叶青真伪，其具体包括以下步骤：
1）、待测物PCR产物与DNA探针杂交：先将DNA探针用HEPES缓冲液配成100μM溶液，其中DNA探针为5’—CCCAACCCGCCCTACCCAACCTCAGCATGGAACATCG —3’，后将待测物PCR产物和DNA探针分别在90℃加热5min以去除其自身二级结构，冷却至室温后在预装有DNA探针的2个离心管中分别加入二次水和待测物PCR产物，在37℃下杂交培育40min；
2）、酶切链置换产生富G序列：杂交完后，随后分别加入4μL dNTPS、0.2μL KlenowFragment exo-聚合酶、0.2μL Nb.BbvCI内切酶、2μL10×反应缓冲液1、2μL10×反应缓冲液2，最终加入二次水使得体系达到20μL并于37℃反应40min；
3）、酶终止反应：反应结束后立即将温度上升至80℃恒温20min使得酶失活；
4）、G-四链体-hemin DNA酶的培育：冷却至室温，加入0.8μL hemin于37℃培育1h以形成G-四链体-hemin DNA酶；
5）、比色可视化鉴定：培育结束后加入6μL ABTS、1μL H2O2加入HEPES缓冲液至体系为200μL，观察颜色变化，其中只有三叶青真品的DNA序列才能使体系显绿色。
2.根据权利要求1所述的运用DNA模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法，其特征在于：所述PCR特异性扩增的程序为95℃预变性5min；然后进入循环，95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸40sec，60个循环，最后72℃延伸10min。
3.根据权利要求1或2所述的运用DNA模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法，其特征在于：所述HEPES缓冲液的pH为7.4，其中包含200mM 氯化钠和20mM氯化钾。
4.根据权利要求1或2所述的运用DNA模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法，其特征在于：所述反应缓冲液1为10×reaction buffer ，具体pH为8.0的500mM Tris-HCl缓冲液，其中包含50mM 氯化镁和10mM二硫苏糖醇；所述反应缓冲液2为10×NEBuffer。
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