CN104651486A - 一种可视化鉴定美洲大蠊的方法及试剂盒 - Google Patents

一种可视化鉴定美洲大蠊的方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN104651486A
CN104651486A CN201410396082.6A CN201410396082A CN104651486A CN 104651486 A CN104651486 A CN 104651486A CN 201410396082 A CN201410396082 A CN 201410396082A CN 104651486 A CN104651486 A CN 104651486A
Authority
CN
China
Prior art keywords
visual
probe
periplaneta americana
sequence
pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410396082.6A
Other languages
English (en)
Inventor
胡佳
岳巧云
邱德义
陈健
吴可量
刘德星
魏晓雅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201410396082.6A priority Critical patent/CN104651486A/zh
Publication of CN104651486A publication Critical patent/CN104651486A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种可视化鉴定美洲大蠊的方法及试剂盒。本发明设计如SEQ ID NO.1所示的美洲大蠊的可视化探针序列，该探针的前缀序列和部分G-四联结构互补。本发明通过提取待检标本的基因组DNA，然后以LCO1490和HCO2198为引物对进行PCR反应，得到COI序列；再通过LCO1490和探针I为引物对，以COI序列为模板，进行PCR反应；向得到的可视化扩增产物中加入NaCl溶液，变性和复性；接着加入氯铁血红素反应，再加入H2O2和ABTS2-，观察颜色变化，颜色变为绿色，表示待检样品为美洲大蠊，颜色没有发生变化，表示待检样品非美洲大蠊。本发明的试剂盒包含前述可视化探针序列。

Description

一种可视化鉴定美洲大蠊的方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种可视化鉴定美洲大蠊的方法及试剂盒。
背景技术
可视化检测是近几年新兴的一种利用具有酶催化活性的DNA序列进行物种鉴定的技术。该技术在DNA测序、序列分析的技术上改进而来的检测鉴定方法。利用DNA条形码自身物种的保守性和不同物种之间的特异性，寻找物种之间特异的片段，设计特异性探针。该技术免去了测序的步骤，无需进行序列分析比对，更无需昂贵的荧光PCR仪，不需凝胶分析，仅需要普通的PCR仪，用肉眼即可检测。
DNA条形码技术是利用生物本身普遍具有的一段保守性适中、容易获得的基因片段作为标准，建立在现代先进的DNA扩增、测序和比对技术基础之上的一种物种鉴定手段。与传统的形态鉴定相比，利用DNA条形码进行物种鉴定具有以下优势：对物种的鉴定将不再受物种发育状态的限制，克服了卵、幼虫、蛹等无法直接鉴定的缺点；对鉴定者的经验和专业背景知识大大降低，减少主观判断的干扰；物种的鉴定更加准确快速。
美洲大蠊是一种常见的医学媒介生物，携带大量的细菌、病毒、真菌和寄生虫卵，经常出没在厨房等家居环境，严重威胁着人民的生命健康，而其卵和若虫无法根据形态进行直接鉴定，往往需要利用荧光PCR仪(仪器昂贵、耗材昂贵)、普通PCR仪(需凝胶检测，接触对人体有害的核酸染料)进行特异性检测或者利用DNA条形码技术(需凝胶检测和耗时的测序)进行鉴定。急需一种简便、快捷、直观的鉴定方式。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种可视化鉴定美洲大蠊的方法。
本发明的另一目的在于提供实现可视化鉴定美洲大蠊的方法的试剂盒。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种可视化鉴定美洲大蠊的方法，包括如下步骤：
(1)设计美洲大蠊的可视化探针序列，如下：
探针I(5’-3’)：
AACTTTATTACTAGCTAGTAGTATAGTAGAAAGAGGTGCCGGA
其中，方框框住部分为前缀序列；与划横线部分序列反向互补，起到沉默空白的作用；粗体字部分为G-四联结构；
(2)模板DNA的提取：提取待检标本的基因组DNA；
(3)COI序列的制备：以步骤(2)得到的基因组DNA为模板，以LCO1490和HCO2198为引物对进行PCR反应，再将PCR产物纯化，得到COI序列；
LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；
HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’；
(4)可视化扩增：以步骤(3)得到的COI序列为模板，以LCO1490和探针I为引物对进行PCR反应；
(5)显色和结果判断：向步骤(4)得到的可视化扩增产物中加入NaCl溶液，变性和复性；接着加入氯铁血红素(hemin)反应，再加入H2O2和ABTS2-，观察颜色变化；颜色变为绿色，表示待检样品为美洲大蠊；颜色没有发生变化，表示待检样品非美洲大蠊；
步骤(2)中所述的待检标本的基因组DNA的提取可通过常规方法或试剂盒提取；
步骤(3)中所述PCR反应的体系优选为：10×PCR buffer5μl，dNTP(2.5mMeach)2μl，EX Taq酶(5U/μl)0.5μl，LCO1490(20μM)和HCO2198(20μM)各1μl，基因组DNA3μl，ddH2O补足至50μl；
步骤(3)中所述PCR反应的条件优选为：94℃3min；94℃30s、50℃30s、72℃30s，20个循环；72℃10min；
步骤(3)中所述的将PCR产物纯化可通过如下步骤实现：将PCR产物进行凝胶电泳，切下含目的基因条带的凝胶，提取目的基因；
所述的凝胶为琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶；
所述的提取可通过常规方法提取或通过试剂盒提取；如琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒；
步骤(4)中所述可视化扩增的体系优选为10×PCR buffer5μl，dNTP(2.5mMeach)2μl，DNA Polymerase I酶(5U/μl)0.5μl，LCO1490(20μM)1μl，探针I(20μM)4μl，COI序列1μl，ddH2O补足至50μl；
步骤(4)中所述可视化扩增的条件优选为94℃3min；94℃30s、50℃30s、72℃45s，30个循环；
步骤(5)中所述的空白沉默液优选为浓度为1.714M的NaCl溶液；
步骤(5)中所述的变性的条件优选为：95℃保温5min；
步骤(5)中所述的复性的条件优选为：变性后以1℃/min的速度降温至25℃保温30min；
步骤(5)中所述的反应的条件为25℃保温60min；
步骤(5)中所述的观察颜色变化的观察时间优选为2min；
步骤(5)中各成分的用量如下：每50μl可视化扩增产物加入0.012mol NaCl、0.108μmol hemin、0.126mmol H2O2和0.126mmol ABTS2-；
一种实现上述可视化鉴定美洲大蠊的方法的试剂盒，包含探针I；探针I的序列如下：
5’-AACTTTATTACTAGCTAGTAGTATAGTAGAAAGAGGTGCCGGA-3’；
其中，方框框住部分为前缀序列；与划横线部分序列反向互补，起到沉默空白的作用；粗体字部分为G-四联结构；
所述的试剂盒还包含如下引物对：
LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；
HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’；
所述的试剂盒还包含阳性对照，阳性对照为美洲大蠊的COI序列；
所述的试剂盒还包含酶、dNTP、反应缓冲液。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明通过美洲大蠊探针的设计和筛选，得到美洲大蠊特异性的探针，所建立的体系重复性高，经多次试验稳定性好。其扩增结果与直接扩DNA条形码全长相比，免去测序、序列分析比对的步骤，更快捷，免去购买昂贵的荧光PCR仪，节省成本。从而为美洲大蠊可视化鉴定提供了一种可靠、便捷的方法。
(2)本发明提供的方法和试剂盒能直接鉴定待检测的卵、若虫、成虫等是否为美洲大蠊，方便，快捷，可靠。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)设计探针：
探针I：
5’-CCCTACCCAAACTTTATTACTAGCTAGTAGTATAGTAGAAAGAGGTGCCGGATGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’；
探针II：
5’-AACTTTATTACTAGCTAGTAGTATAGTAGAAAGAGGTGCCGGATGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’。
探针I和探针II的差别是探针I比探针II多前面9个碱基，探针I第10～70位的核苷酸序列即为探针II。
(2)基因组DNA的提取：在广东中山新鲜采集的美洲大蠊按中国“陆宝麟吴厚永.中国重要医学昆虫分类与鉴别[M].河南科学技术出版社,2003，632”进行鉴定，经形态学方法准确鉴定后，交于中山大学生命科学学院复核鉴定。在鉴定无误后，从新鲜标本右侧后腿从股节处取下，用基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)，按试剂盒说明书纯化得到其基因组DNA。
(3)COI片段的获得：以得到的基因组DNA为模板，以LCO1490和HCO2198为引物，经COI序列PCR扩增，反应体系为：10×PCR buffer5μl，dNTP(2.5mMeach)2μl，EX Taq酶(5U/μl)0.5μl，LCO1490(20μM)和HCO2198(20μM)各1μl，基因组DNA3μl，ddH2O37.5μl。反应条件为94℃3min；94℃30s、50℃30s、72℃30s，20个循环；72℃10min。使用1％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳分离，接着用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN，编号：DP210)纯化回收，得到含COI片段的溶液。
(4)可视化反应体系和反应条件的确定：将ddH2O作为模板进行可视化PCR扩增。反应体系为：10×PCR buffer5μl，dNTP(2.5mM each)2μl，DNA PolymeraseI酶(5U/μl)0.5μl，LCO1490(20μM)1μl，探针I(20μM)或探针II(20μM)4μl，ddH2O补足至50μl。反应条件为：94℃3min；94℃30s、50℃30s、72℃45s，30个循环。在可视化PCR扩增结束后进行下列操作：①不加空白沉默液，95℃保温5min；②不加空白沉默液，常温3h；③加入空白沉默液7μl，95℃保温5min；④加入空白沉默液7μl，常温3h。空白沉默液为1.714M NaCl溶液。然后加入hemin(108μM)1μl，25℃保温60min，加入H2O2(126mM)和ABTS2-(126mM)按体积比1：1得到的混合物2μl，2min后结果如下所示。
反应结果如下：
①使用探针I的结果如下：
不加空白沉默液(NaCl溶液)，所有的显色反应中都变为绿色了；加热空白沉默液，显色反应均为无色。这说明高浓度NaCl在反应中起到沉默空白的作用，即在非美洲大蠊样本中高浓度的NaCl可以促进G-四联结构和前缀序列配对，形成发夹结构；常温3h与95℃保温5min效果几乎一样，在后续的实验中就将空白沉默液条件设定为NaCl(1.714M)，95℃保温5min。
②使用探针II的结果如下：
不管加不加入空白沉默液，保温5分钟还是3小时，四个反应均呈绿色，说明探针I的前面9个碱基在设计的时候是必要的，前9个碱基与NaCl同时存在才能起到沉默空白的作用。
(5)可视化扩增：反应体系为：10×PCR buffer5μl，dNTP(2.5mM each)2μl，DNA Polymerase I酶(5U/μl)0.5μl，LCO1490(20μM)1μl，步骤(3)得到的含COI片段的溶液1μl，探针I(20μM)或探针II(20μM)4μl，ddH2O补足至50μl。反应条件为：94℃3min；94℃30s、50℃30s、72℃45s，30个循环。空白以ddH2O代替含COI片段的溶液。同时以水代替含COI片段的溶液，作为模板，相当于空白对照。
(6)显色：向可视化PCR扩增产物中加入空白沉默液(1.714M的NaCl溶液)7μl，95℃保温5min，以1℃/min的速度降温至25℃保温30min。加入hemin(108μM)1μl，25℃保温60min。加入H2O2(126mM)和ABTS2-(126mM)按体积比1：1混合得到的混合物物2μl。
反应结果如下：
加入探针II的空白对照和试验管都显色了，这是由于探针II中的G-四联结构稳定存在反应体系中，且具有DNAzyme功能。加入探针I的空白对照为无色，试验管呈现绿色。这是由于探针I的前9个碱基能与G-四联结构中的一段互补，让样本为非美洲大蠊(包括空白和其他种的蜚蠊)的时候，在95℃升温打破DNA二级结构，降温的时候前9个碱基与G-四联结构的一段优先形成9个碱基的互补双链而防止G-四联二级结构的重生，从而破坏G-四联结构，使其不具DNAzyme功能，不能催化显色。阳性样品由于模板特异片段的存在，美洲大蠊probe的特异片段在可视化PCR扩增过程中退火与美洲大蠊特异片段形成双链，在DNAPolymerase I5’→3’外切酶活性下将前9个碱基切割而使得美洲大蠊probe的G-四联结构在降温过程中得以形成而具有DNAzyme功能，能催化显色。可视化引物探针设定为探针I。
实施例2
(1)样本如下：以下采集到的昆虫均分别按“陆宝麟吴厚永.中国重要医学昆虫分类与鉴别[M].河南科学技术出版社,2003，634”进行鉴定，且都委托中山大学生命科学学院进行鉴定复核。
①以广东中山新鲜采集的美洲大蠊成虫(在广东中山采集)、取同一批的若虫及其卵各一只，其余的饲养成成虫后鉴定为美洲大蠊；
②与美洲大蠊同属的澳洲大蠊成虫(在广东中山采集)取同一批的若虫及其卵各一只，其余的饲养成成虫后鉴定为澳洲大蠊；
③与美洲大蠊同科的丽郝氏蠊成虫(在广东中山采集)取同一批的若虫及其卵各一只，其余的饲养成成虫后鉴定为丽郝氏蠊；
④与美洲大蠊不同科但同目的德国小蠊成虫(在广东中山采集)取同一批的若虫及其卵各一只，其余的饲养成成虫后鉴定为为德国小蠊；
(2)提取基因组DNA：使用基因组DNA提取试剂盒(TIANamp GenomicDNA Kit)分别提取不同样本的成虫、若虫或卵的基因组DNA。
(3)COI片段的获得：同实施例1步骤(3)，得到成虫、若虫、卵的COI片段。同时，为了避免假阳性结果，设置阴性对照(以水为模板)。
(4)可视化扩增：同实施例1步骤(5)。
(5)显色：同实施例1步骤(6)。
结果如下：
①以美洲大蠊的成虫、若虫和卵分别提取得到的COI片段为模板：
A、可视化扩增采用探针I，结果为：成虫、若虫和卵均呈现绿色，空白为无色透明；
B、可视化扩增采用探针II，结果为：成虫、若虫、卵和空白均呈现绿色。
②以澳洲大蠊的成虫和若虫分别提取得到的COI片段为模板：
A、可视化扩增采用探针I，结果为：成虫、若虫、卵和空白均为无色透明；
B、可视化扩增采用探针II，结果为：成虫、若虫、卵和空白均呈现绿色。
②以丽郝氏蠊的成虫、若虫和卵分别提取得到的COI片段为模板：
A、可视化扩增采用探针I，结果为：成虫、若虫、卵和空白均为无色透明；
B、可视化扩增采用探针II，结果为：成虫、若虫、卵和空白均呈现绿色。
②以德国小蠊的成虫、若虫和卵分别提取得到的COI片段为模板：
A、可视化扩增采用探针I，结果为：成虫、若虫、卵和空白均为无色透明；
B、可视化扩增采用探针II，结果为：成虫、若虫、卵和空白均呈现绿色。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可视化鉴定美洲大蠊的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)设计美洲大蠊的可视化探针序列，如下：
探针I，方向为5’-3’：
AACTTTATTACTAGCTAGTAGTATAGTAGAAAGAGGTGCCGGA
其中，方框框住部分为前缀序列；与划横线部分序列反向互补，起到沉默空白的作用；粗体字部分为G-四联结构；
(2)模板DNA的提取：提取待检标本的基因组DNA；
(3)COI序列的制备：以步骤(2)得到的基因组DNA为模板，以LCO1490和HCO2198为引物对进行PCR反应，再将PCR产物纯化，得到COI序列；
LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；
HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’；
(4)可视化扩增：以步骤(3)得到的COI序列为模板，以LCO1490和探针I为引物对进行PCR反应；
(5)显色和结果判断：向步骤(4)得到的可视化扩增产物中加入NaCl溶液，变性和复性；接着加入氯铁血红素反应，再加入H2O2和ABTS2-，观察颜色变化；颜色变为绿色，表示待检样品为美洲大蠊；颜色没有发生变化，表示待检样品非美洲大蠊。
2.根据权利要求1所述的可视化鉴定美洲大蠊的方法，其特征在于：步骤(3)中所述PCR反应的体系为：10×PCR buffer5μl，每种脱氧核苷酸浓度为2.5mM的dNTP2μl，浓度为5U/μl的EX Taq酶0.5μl，20μM的LCO14901μl、20μM的HCO21981μl，基因组DNA3μl，ddH2O补足至50μl；
步骤(3)中所述的PCR反应的条件为：94℃3min；94℃30s、50℃30s、72℃30s，20个循环；72℃10min。
3.根据权利要求1所述的可视化鉴定美洲大蠊的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的将PCR产物纯化通过如下步骤实现：将PCR产物进行凝胶电泳，切下含目的基因条带的凝胶，提取目的基因。
4.根据权利要求1所述的可视化鉴定美洲大蠊的方法，其特征在于：步骤(4)中所述可视化扩增的体系为10×PCR buffer5μl，每种脱氧核苷酸浓度为2.5mM的dNTP2μl，浓度为5U/μl的DNA Polymerase I酶0.5μl，20μM的LCO14901μl，20μM的探针I4μl，COI序列1μl，ddH2O补足至50μl；
步骤(4)中所述可视化扩增的条件为94℃3min；94℃30s、50℃30s、72℃45s，30个循环。
5.根据权利要求1所述的可视化鉴定美洲大蠊的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的空白沉默液为浓度为1.714M的NaCl溶液。
6.根据权利要求1所述的可视化鉴定美洲大蠊的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的变性的条件为：95℃保温5min；
步骤(5)中所述的复性的条件为：变性后以1℃/min的速度降温至25℃保温30min；
步骤(5)中所述的反应的条件为25℃保温60min；
步骤(5)中所述的观察颜色变化的观察时间为2min。
7.根据权利要求1所述的可视化鉴定美洲大蠊的方法，其特征在于：步骤(5)中各成分的用量如下：每50μl可视化扩增产物加入0.012mol NaCl、0.108μmol hemin、0.126mmol H2O2和0.126mmol ABTS2-。
8.一种实现上述可视化鉴定美洲大蠊的方法的试剂盒，其特征在于：包含探针I；探针I的序列如下：
5’-AACTTTATTACTAGCTAGTAGTATAGTAGAAAGAGGTGCCGGA-3’；
其中，方框框住部分为前缀序列；与划横线部分序列反向互补，起到沉默空白的作用；粗体字部分为G-四联结构。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：还包含如下引物对：
LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；
HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包含阳性对照、酶、dNTP和反应缓冲液中的至少一种。
CN201410396082.6A 2014-08-12 2014-08-12 一种可视化鉴定美洲大蠊的方法及试剂盒 Pending CN104651486A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410396082.6A CN104651486A (zh) 2014-08-12 2014-08-12 一种可视化鉴定美洲大蠊的方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410396082.6A CN104651486A (zh) 2014-08-12 2014-08-12 一种可视化鉴定美洲大蠊的方法及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104651486A true CN104651486A (zh) 2015-05-27

Family

ID=53243125

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410396082.6A Pending CN104651486A (zh) 2014-08-12 2014-08-12 一种可视化鉴定美洲大蠊的方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104651486A (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105543368A (zh) * 2016-01-12 2016-05-04 宁波大学 一种食品致病菌pcr扩增产物的快速检测方法
CN105803089A (zh) * 2016-05-05 2016-07-27 安徽师范大学 一种用于鉴定美洲大蠊的多重pcr引物及其鉴定方法
CN105936933A (zh) * 2016-05-11 2016-09-14 浙江医药高等专科学校 运用dna模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法
CN107177680A (zh) * 2017-06-08 2017-09-19 四川好医生攀西药业有限责任公司 美洲大蠊特异性coi引物、含有其的试剂盒及应用
CN108998544A (zh) * 2018-09-03 2018-12-14 大理大学 一种鉴定美洲大蠊用引物对、试剂盒及其应用
CN109022595A (zh) * 2018-09-03 2018-12-18 大理大学 一种鉴别美洲大蠊的dna条形码标准检测片段、试剂盒及其使用方法
CN109022542A (zh) * 2018-07-25 2018-12-18 山西农业大学 一种可视化鉴定大豆a类皂苷类型的方法
CN112458178A (zh) * 2019-09-06 2021-03-09 内蒙古京新药业有限公司 一种美洲大蠊pcr鉴定引物及鉴定方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102071251A (zh) * 2010-10-09 2011-05-25 中国科学院成都生物研究所 一种pcr检测核酸的方法
CN102827836A (zh) * 2012-06-11 2012-12-19 中国科学院成都生物研究所 一种寡核苷酸探针以及用其对靶分子进行检测的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102071251A (zh) * 2010-10-09 2011-05-25 中国科学院成都生物研究所 一种pcr检测核酸的方法
CN102827836A (zh) * 2012-06-11 2012-12-19 中国科学院成都生物研究所 一种寡核苷酸探针以及用其对靶分子进行检测的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OLE FOLMER, ET AL.: "DNA primers for amplification of mitochondrial Cytochrome C oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates", 《 MOLECULAR MARINE BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY》 *
YOLANDA L.JONES, ET AL.: "Potential Use of DNA Barcodes in Regulatory Science：Identification of the U.S. Food and Drug Administration’s "Dirty 22," Contributors to the spread of Foodborne Pathogens", 《JOURNAL OF FOOD PROTECTION》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105543368A (zh) * 2016-01-12 2016-05-04 宁波大学 一种食品致病菌pcr扩增产物的快速检测方法
CN105803089A (zh) * 2016-05-05 2016-07-27 安徽师范大学 一种用于鉴定美洲大蠊的多重pcr引物及其鉴定方法
CN105936933A (zh) * 2016-05-11 2016-09-14 浙江医药高等专科学校 运用dna模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法
CN105936933B (zh) * 2016-05-11 2019-11-12 浙江医药高等专科学校 运用dna模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法
CN107177680A (zh) * 2017-06-08 2017-09-19 四川好医生攀西药业有限责任公司 美洲大蠊特异性coi引物、含有其的试剂盒及应用
CN107177680B (zh) * 2017-06-08 2019-02-05 四川好医生攀西药业有限责任公司 美洲大蠊特异性coi引物、含有其的试剂盒及应用
CN109022542A (zh) * 2018-07-25 2018-12-18 山西农业大学 一种可视化鉴定大豆a类皂苷类型的方法
CN108998544A (zh) * 2018-09-03 2018-12-14 大理大学 一种鉴定美洲大蠊用引物对、试剂盒及其应用
CN109022595A (zh) * 2018-09-03 2018-12-18 大理大学 一种鉴别美洲大蠊的dna条形码标准检测片段、试剂盒及其使用方法
CN112458178A (zh) * 2019-09-06 2021-03-09 内蒙古京新药业有限公司 一种美洲大蠊pcr鉴定引物及鉴定方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104651486A (zh) 一种可视化鉴定美洲大蠊的方法及试剂盒
CN105316412B (zh) 一种鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄的方法及其专用试剂盒
CN103387978A (zh) 三疣梭子蟹c-型凝集素基因多态性标记及snp分子标记基因分型的方法
CN104046700A (zh) 一种快速鉴定驴皮、马皮和骡子皮的检测试剂盒
CN103540681B (zh) 一种同步检测5种植物病毒的方法
CN104789658B (zh) 一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增引物及其应用
Turan et al. New rapid DNA extraction method with Chelex from Venturia inaequalis spores
CN102605093A (zh) 一种二点委夜蛾的分子鉴定方法
CN104561332A (zh) 一种鉴定山杨性别的ssr分子标记及其应用
CN105525012A (zh) 一种花生杂交种的分子鉴定方法
CN104099428B (zh) 一种鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光pcr引物、探针和试剂盒
CN103320425A (zh) 一种用于大规模、高通量基因分型的贝类dna快速提取方法
CN103911441A (zh) 用于水稻的基于毛细管电泳和ssr荧光标记的遗传分析方法
CN103255222A (zh) 利用线粒体scar标记鉴别温室白粉虱和烟粉虱的引物及方法
CN101864476B (zh) 一种用pcr鉴定刀鲚和凤鲚的方法
CN103088136A (zh) 一种鉴别日光蜂不同遗传支系的引物及鉴别方法
CN103146834A (zh) 基于Allglo探针的中华按蚊击倒抗性基因突变位点的检测方法
CN103436612A (zh) 一种常见鲟鱼类的pcr-rflp快速检测方法
CN104004748A (zh) 一种用于植物寄生线虫基因组dna微量提取的裂解液及其应用
CN103276085A (zh) 一种利用issr标记鉴别四川白鹅的方法
CN103898225A (zh) 一种鉴别烟粉虱隐种和白粉虱的引物及鉴别方法
CN103911457B (zh) 鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物及其检测方法
CN103255224B (zh) 一种鉴别迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊幼虫的pcr鉴定引物及其鉴定方法
CN102965367B (zh) 一种获得棉花候选抗黄萎病基因序列的方法
CN104087665B (zh) 一种检测黄曲霉及烟曲霉的通用引物及实时荧光tHDA试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150527