CN103276085A

CN103276085A - 一种利用issr标记鉴别四川白鹅的方法

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Publication number: CN103276085A
Application number: CN2013102091208A
Authority: CN
Inventors: 李亮; 何桦; 刘贺贺; 韩春春; 王继文; 孙文强; 汤静思
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2013-05-31
Filing date: 2013-05-31
Publication date: 2013-09-04

Abstract

本发明属于畜禽遗传资源鉴定领域，具体涉及一种利用ISSR分子标记技术鉴别四川白鹅真伪的方法。其中共用到3个ISSR标记，形成了11个鹅品种(系)DNA用三个遗传标记分别PCR扩增后的标准电泳图谱，用于鉴别被鉴定的鹅群是否是真正的四川白鹅。本发明填补了应用分子标记鉴定我国优良地方鹅种四川白鹅的技术空白，为鉴别四川白鹅提供了一种可靠、快速且准确的分子生物学方法，摆脱了利用传统形态学鉴定方法鉴别四川白鹅的不可靠因素，能够为真正的高繁殖力四川白鹅在生产中的广泛应用提供技术保障。

Description

一种利用ISSR标记鉴别四川白鹅的方法

技术领域

本专利属于畜禽遗传资源鉴定技术领域，具体涉及一种利用分子标记鉴别四川白鹅与其他鹅品种的方法。

背景技术

鹅作为一种食草家禽，其产品深受市场喜爱，养鹅业在我国得以迅速发展，近年来，我国鹅年饲养量和出栏量均占世界总量的90%以上。四川白鹅是我国肉鹅品种中的优秀遗传资源之一，具有耐粗饲、抗病力强、性成熟早、产蛋多、生长快、肉质鲜美等优良特性。由于其繁殖率高（年产蛋量达80枚左右，远高于国内外其他肉鹅品种的30-50枚）、基本无就巢性、且与其他品种间的杂交配合力好，该品种在我国肉鹅生产中被广泛作为杂交利用和新品种培育中的母本，引入至全国各养鹅省份。目前，四川白鹅及其杂交后代的饲养量约占全国鹅饲养总量的三分之一以上，为我国鹅业发展做出了突出贡献。

然而，由于四川白鹅良种在种鹅市场上的供不应求，而其体型外貌方面与其它一些低繁殖率鹅品种间差别不大，市场上常有以其它白鹅品种冒充四川白鹅作为种鹅出售的现象。由于这些冒牌四川白鹅繁殖性能与四川白鹅差距太大，被用作种用后，给种鹅生产者带来巨大的经济损失，同时还对四川白鹅品牌产生了不利的影响。因此，如何准确鉴别四川白鹅，成为了育种者和种鹅生产者们迫切需要解决的问题。

简单重复序列区间（Inter simple sequence repeat , ISSR）标记是一种基于PCR的分子标记技术，它对两个序列相同但方向相反的简单重复序列（SSR）之间的区域进行扩增。ISSR标记结合了AFLP、SSR多态性高、精确度好以及RAPD通用性的特点，是快速、可靠、可以提供基因组丰富信息的一种DNA指纹技术。自该技术产生以来，已被广泛应用与植物科学研究中鉴别不同种属的遗传资源，但在动物科学的研究中应用较少。在鹅的研究中，有关于吉林白鹅肉用品系主要产肉性能的ISSR分子标记研究以及应用ISSR分子标记对雁鹅遗传多样性的研究，但均未用于不同鹅品种的鉴别。由于四川白鹅与国内众多鹅品种相比，在雏鹅期以及成年后外貌特征方面并没有太大区别，因此，利用ISSR标记建立一种从DNA水平鉴别四川白鹅的方法，一方面可以弥补传统鉴定方法的不足，另一方面可以促进四川白鹅良种的保护和引种的标准化。

发明内容

为了解决鉴别四川白鹅与其他品种，本发明的目的在于提出一种利用ISSR标记快速准确鉴别四川白鹅的方法。该方法能够将四川白鹅与皖西白鹅、豁眼鹅、太湖鹅、浙东白鹅、朗德鹅、溆浦鹅、阳江鹅、钢鹅、天府肉鹅等品种区分开。

为了实现本发明的目的，通过大量试验，本发明从20个ISSR标记中筛选出了3个ISSR标记用于鉴别四川白鹅与其他鹅品种，所用的3个ISSR标记的编号分别为812、847和850,三个标记的引物核苷酸序列见“核苷酸序列表”。

实现本发明的具体实施步骤包括。

（1）不同鹅品种的血样采集。

（2）DNA提取与品种DNA池构建。

（3）利用3个ISSR标记分别PCR扩增各品种DNA。

（4）构建各品种3个ISSR标记上的标准电泳图谱。

（5）利用所构建的电泳图谱，对待检测品种进行鉴定。

步骤（1）所述的各鹅品种的血样均来自于各品种的资源场或遗传资源库，其中所用的四川白鹅来自四川南溪四川白鹅国家资源场；天府肉鹅父系及母系来自培育单位；钢鹅及其他品种的血液样品均来自各品种的资源场，由江苏家禽研究所建立的资源库长期保存。

步骤（2）所述的DNA提取，参照《分子克隆实验指南》中介绍的方法并稍做更改，具体步骤为：血液解冻后取20μl于1.5mLEppendorf管中，加入500μl裂解液，10μl 10％SDS，5μl RnaseA(20μg/μl)，10μl蛋白酶K(20mg/mL)，混匀，55℃水浴过夜；加入等体积Tris饱和酚，摇20min后，12000rpm离心10min；移出上清液，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，摇15min，12000rpm离心10min后，重复本步骤1次；抽提出上清液，并加入等体积氯仿：异戊醇(24：l)摇15min，12000rpm离心10min；取上清液，并加入2倍体积的冰无水乙醇，轻摇、沉淀DNA；7500rpm离心5min，小心倒掉乙醇；70％乙醇洗涤2次，自然干燥后加300μl TE缓冲液（10mM Tris-HCl 1mM EDTA PH=8.0）溶解。步骤（2）所述的DNA池，分别由每个品种3个以上个体的DNA溶液等量混合形成。DNA浓度约为10 ng/μl。

步骤（3）所述的PCR扩增，其扩增体系为10 μL反应体系，含2×Master mix（包含dNTP，MgCl2，10×buffer，北京天根生物工程有限公司）5μL，灭菌去离子水3.4 μL，DNA模板0.8μL，引物0.8μL。反应程序为：94℃预变性5min，36个循环（94 ℃变性30s，退火30s，72 ℃延伸35s），72 ℃后延伸10min，12℃保存。三个ISSR标记的退火温度分别为56℃（847标记和850标记）和50℃（812标记）。

步骤（4）中所用的电泳介质，为2.0%琼脂糖凝胶，电泳条件为：恒压90V电泳1h，停止电泳后取出凝胶，置Bio-Rad凝胶成像系统中观察电泳条带并照相保存。步骤（4）中构建的标准电泳图谱，是利用Bio-Rad凝胶成像系统的Quantity One软件对电泳条带进行分析并后自动绘制（见附图）。综合运用所绘制的3个ISSR的标准电泳图谱，可将四川白鹅与皖西白鹅、豁眼鹅、太湖鹅、浙东白鹅、朗德鹅、溆浦鹅、阳江鹅、钢鹅、天府肉鹅等品种明显的区分开。

本发明构建的各品种ISSR标记标准电泳图谱，有效解决了四川白鹅在引种、杂交利用等过程中仅依靠体型外貌特征无法进行准确品种鉴定的困难。由于ISSR标记具有操作简单、快速、高效的特点，便于生产推广。同时，ISSR标记无需知道靶标序列的背景信息，且稳定性强，增强了实际生产中该方法的可重复性。本发明大大改善了四川白鹅在推广过程中，以劣充优、以假乱真的问题。建立起的ISSR-PCR产物电泳模式图可以直观的显示各品种之间DNA的差异性，可用于快速有效的鉴定被鉴定的鹅是否是真正的四川白鹅。

本发明还提供了上述方法在四川白鹅品种鉴定中的应用。

附图说明

图1为标记812对各品种的电泳图。

图2为标记812对各品种的扩增结果的标准电泳图谱。

图3为标记847对各品种的电泳图。

图4为标记847对各品种的扩增结果的标准电泳图谱。

图5为标记850对各品种的电泳图。

图6为标记850对各品种的扩增结果的标准电泳图谱。

图1、2、5、6中1至12分别为：Marker（DL2000）；阳江鹅；豁眼鹅；太湖鹅；天府肉鹅父系；钢鹅；朗德鹅；天府肉鹅母系；皖西白鹅；浙东白鹅；溆浦鹅；四川白鹅。

图3、4中的1至12分别为：Marker（DL2000）；四川白鹅；溆浦鹅；浙东白鹅；皖西白鹅；天府肉鹅母系；朗德鹅；钢鹅；天府肉鹅父系；太湖鹅；豁眼鹅；阳江鹅。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明应用的过程，并不用于限制本发明应用的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，利用本发明提供的ISSR引物序列及各鹅品种在各标记上的标准电泳图谱进行不同的品种鉴别，均属于本发明的保护范围。

若未特别指明，则本实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例：鉴别某一鹅群或引种的雏鹅是否是真正的四川白鹅。

（1）血样或组织样品的采集随机取3只待鉴别的鹅，每只鹅翅静脉采血2～3ml，加入0.5％肝素钠抗凝，低温低速离心5min，小心去除上层血浆，并置于-20℃冰箱保存备用；或者从鹅蹼上剪取约0.1g组织样，冷冻保存备用。

（2）鹅基因组总DNA提取血液解冻后取20μl，或取组织样0.05g左右，于1.5mLEppendorf管中，加入500μl裂解液，10μl 10％SDS，5μl RnaseA(20μg/μl)，10μl蛋白酶K(20mg/mL)，混匀，55℃水浴过夜；加入等体积Tris饱和酚，摇20min后，12000rpm离心10min；移出上清液，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，摇15min，12000rpm离心10min后，重复本步骤1次；抽提出上清液，并加入等体积氯仿：异戊醇(24：l)摇15min，12000rpm离心10min；取上清液，并加入2倍体积的冰无水乙醇，轻摇、沉淀DNA；7500rpm离心5min，小心倒掉乙醇；70％乙醇洗涤2次，自然干燥后加300μl TE缓冲液（10mM Tris-HCl 1mM EDTA PH=8.0）溶解。

（3）ISSR-PCR扩增 PCR体系为10 μL反应体系，含2×Master mix（包含dNTP，MgCl2，10×buffer，北京天根生物工程有限公司）5μL，灭菌去离子水3.4 μL，DNA模板0.8μL，引物0.8μL。反应程序为：94℃预变性5min，36个循环（94 ℃变性30s，退火30s，72 ℃延伸35s），72 ℃后延伸10min，12℃保存。三个ISSR标记的退火温度分别为56℃（847标记和850标记）和50℃（812标记）。

（4）PCR产物的检测 PCR反应完成后用，2.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在恒压90V下电泳1h，停止电泳后取出凝胶，置Bio-Rad凝胶成像系统中观察电泳条带并照相保存。

（5）电泳结果的分析与判断采用Bio-Rad凝胶成像系统的Quantity One软件对电泳条带进行分析并与本发明制备的各品种电泳图谱比较（见附图）。如果3只鹅均是四川白鹅，则3个ISSR标记PCR产物的电泳结果应该与四川白鹅标准图谱一致，可判断被鉴定的鹅群为四川白鹅。如果被鉴定的鹅在三个标记上的电泳结果均与四川白鹅不一致，而与其他品种一致，则可判断被鉴定的鹅群不是真正的四川白鹅，或不全是四川白鹅。

812引物序列（5’-3’）

GAG AGA GAG AGA GAG AA

847引物（5’-3’）

CAC ACA CAC ACA CAC ARC

850引物（5’-3’）

GTG TGT GTG TGT GTG TYC

说明：以上引物中，R 代表A或G；Y代表C或T。

Claims

1.一种利用ISSR标记快速准确鉴别四川白鹅的方法，其特征在于，ISSR-PCR所用的引物为812、847和850三条引物，其核苷酸序列见核苷酸序列表。

2.应用3个ISSR标记构建了11个鹅品种(系)的标准电泳图谱，其特征在于，在电泳图的基础上，利用Quantity One软件绘制了电泳模式图。

3.如权利要求1和2所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：（1）不同鹅群的血样或组织样采集；（2）DNA提取及品种DNA池构建；（3）利用3个ISSR标记分别PCR扩增各品种DNA；（4）构建各品种3个ISSR标记上的标准电泳图谱；（5）利用所构建的电泳图谱，对待检测群体进行鉴定。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）对大鹅可采集血样或蹼组织样，对雏鹅可采集蹼组织样。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）构建品种的DNA池需要至少用3只鹅的DNA等量混合稀释而成，DNA最终浓度约为10ng/μL。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）所用的3各ISSR标记分别为812,847和850；PCR扩增的退火温度分别为56℃（847标记和850标记）和50℃（812标记）。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）的PCR扩增体系为10 μL反应体系，含2×Master mix（包含dNTP，MgCl2，10×buffer，北京天根生物工程有限公司）5μL，灭菌去离子水3.4 μL，DNA模板0.8μL，引物0.8μL。

8.反应程序为：94℃预变性5min，36个循环（94 ℃变性30s，退火30s，72 ℃延伸35s），72 ℃后延伸10min，12℃保存。

9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（4）所用的电泳方法为2.0%琼脂糖凝胶电泳，在恒压90V下电泳1h，停止电泳后取出凝胶，置Bio-Rad凝胶成像系统中观察电泳条带并照相。

10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（4）所构建的标准电泳图谱包括11个鹅品种(系)，分别为四川白鹅、皖西白鹅、豁眼鹅、太湖鹅、浙东白鹅、朗德鹅、溆浦鹅、阳江鹅、钢鹅、天府肉鹅父系、天府肉鹅母系。

11.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（4）构建的标准电泳图谱，包括利用Quantity One软件绘制的电泳模式图。

12.如权利要求1至11各项所述方法，应用于四川白鹅与其他鹅种的鉴别。