CN102876796B - 鉴别产绿壳蛋鸡及鸡绿壳蛋基因型的方法及专用片段与引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别产绿壳蛋鸡及鸡绿壳蛋基因型的方法及专用片段与引物。本发明提供了鉴定或辅助鉴定待测鸡是否为绿壳蛋鸡的方法，为检测待测鸡的基因组DNA，若基因组DNA中含有目的DNA分子（序列4），则所述待测鸡为或候选为绿壳蛋鸡；若基因组DNA中不含有目的DNA分子，则所述待测鸡不为或候选不为绿壳蛋鸡。本发明的实验证明，本发明一段425bp的短片段，根据该短片段设计合成3条引物，用于多重PCR扩增，可以通过检测扩增产物是否含有该短片段用来鉴定待测鸡是否产绿壳蛋，同时可以鉴定鸡绿壳蛋基因型。

Description

鉴别产绿壳蛋鸡及鸡绿壳蛋基因型的方法及专用片段与引物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鉴别产绿壳蛋鸡及鸡绿壳蛋基因型的方法及专用片段与引物。

背景技术

蛋壳颜色是影响鸡蛋品质的因素之一。在禽蛋市场上，表面光滑，色泽美观、均一的鸡蛋往往更受消费者的青睐。绿壳蛋以其独特的蛋壳颜色在禽蛋市场中受到欢迎，且常以“养生蛋”、“保健蛋”的身份出现在高端禽蛋市场中。传统绿壳蛋鸡的选育存在选而不纯、蛋壳颜色变异大的问题。

鸡的绿壳蛋性状是由显性单基因（O)控制的质量性状，显性纯合子（O/O)和杂合子（O/o）个体都下绿壳蛋。这种遗传特点决定了依据表型选择很难区分纯合子（O/O)和杂合子（O/o），致使隐性非绿壳基因（o）难以剔除干净。常规育种手段只能通过测交鉴别杂合子，但这种方法费时、费力，延长了育种进程。用与绿壳蛋基因紧密连锁的分子标记进行标记辅助选择（MAS）可以缩短育种进程，但由于重组，一般标记的选择准确性依然无法达到100%。最准确、最有效的选择方法是直接对O基因进行选择。目前已证明鸡绿壳蛋性状是由SLC01B3基因上游5'端一段4.2kb的插入序列引起，已经提出包含4.2kb的长片段PCR扩增来鉴别产绿壳蛋鸡及鸡绿壳蛋基因型（图1A）。这种方法可以准确区分产绿壳蛋鸡与非产绿壳蛋鸡，并可判断产绿壳蛋鸡的基因型是显性纯合子（O/O)或是杂合子（O/o），但该方法存在三个缺点：（1）基因型检测时间长，因为算上插入片段两侧的序列，PCR扩增片段长度近6kb，1次PCR反应时间至少需要4.5h；（2）扩增失败机率高，长片段PCR对模板质量、扩增条件要求较高，稍不注意即可导致反应失败；（3）费用高，长片段PCR需要专用的长片段Taq酶，这种酶价格比普通Taq酶高4-5倍。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测鸡是否为绿壳蛋鸡的方法。

本发明提供的方法，为检测待测鸡的基因组DNA，若基因组DNA中含有目的DNA分子，则所述待测鸡为或候选为绿壳蛋鸡；若基因组DNA中不含有目的DNA分子，则所述待测鸡不为或候选不为绿壳蛋鸡；

所述目的DNA分子为如下1）-3）中的任意一种：

1）序列表中的序列4所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；

3）与1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。

本发明的另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测鸡基因型的方法。

本发明提供的方法，为检测待测鸡的基因组DNA，若所述基因组DNA中含有目的DNA分子，则所述待测鸡的基因型为或候选为O/O纯合型或O/o杂合型；若基因组DNA中不含有目的DNA分子，则所述待测鸡不为或候选不为O/O纯合型或O/o杂合型；

所述目的DNA分子为如下1）-3）中的任意一种：

1）序列表中的序列4所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；

3）与1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。

上述两种方法中，所述检测待测鸡的基因组DNA的方法为测序、PCR扩增或分子杂交；所述待测鸡的基因组DNA来源于离体的鸡组织器官或血液。

上述鉴定或辅助鉴定待测鸡的基因型方法在鉴定待测鸡是否为产绿壳蛋鸡中的应用也是本发明保护的范围；其中，所述应用为若所述待测鸡的基因型为O/O纯合型或O/o杂合型任意一种，则所述待测鸡为或候选为产绿壳蛋鸡；若所述待测鸡的基因型不为O/O纯合型或O/o杂合型中的任意一种，则所述待测鸡不为或不候选为产绿壳蛋鸡。

本发明的第三个目的是提供一种DNA分子。

本发明提供的DNA分子，为如下1）-3）中任一所述的DNA分子：

1）序列表中的序列4所示的DNA分子；

2）在严格条件下可与1）或2）限定的DNA序列杂交的DNA分子；

3）与1）限定的DNA序列具有70%以上的同源性的DNA分子。

上述严格条件具体可以为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

扩增上述DNA分子的引物也是本发明保护的范围，具体为由序列表中序列1所示的DNA分子和由序列表中序列2所示的DNA分子组成的引物对。

本发明的第四个目的是提供鉴别产绿壳蛋鸡和/或鸡绿壳蛋基因型的多重PCR的引物组、多重PCR试剂或多重PCR试剂盒。

本发明提供的鉴别产绿壳蛋鸡和/或鸡绿壳蛋基因型的多重PCR的引物组由引物1、引物2和引物3组成；所述引物1、所述引物2和所述引物3的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2和序列3；所述引物1、所述引物2和所述引物3的摩尔比具体为1:1:1；

本发明提供的鉴别产绿壳蛋鸡和/或鸡绿壳蛋基因型的多重PCR试剂由所述引物组、dNTP、PCR扩增缓冲液、DNA聚合酶和水组成；所述引物组中的各条引物在所述试剂中的终浓度均为0.4-0.5pmol/μL；

本发明提供的鉴别产绿壳蛋鸡和/或鸡绿壳蛋基因型的多重PCR试剂盒，包括所述引物组或所述多重PCR试剂。

上述多重PCR的引物组、多重PCR试剂或多重PCR试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测鸡是否为产绿壳蛋鸡中的应用也是本发明保护的范围；

或上述多重PCR的引物组、多重PCR试剂或多重PCR试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测鸡的基因型中的应用也是本发明保护的范围；所述待测鸡基因型具体为O/O纯合型、O/o杂合型或o/o纯合型。

本发明第五个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测鸡是否为产绿壳蛋鸡的方法。

本发明提供的方法，为用上述多重PCR的引物组、多重PCR试剂或多重PCR试剂盒中的引物组对待测鸡进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，检测PCR扩增产物，

若PCR扩增产物具有400-450bp大小的扩增产物，则待测鸡为或候选为产绿壳蛋鸡；若PCR扩增产物不具有400-450bp大小的扩增产物，则待测鸡不为或候选不为产绿壳蛋鸡。

本发明的第六个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测鸡基因型的方法。

本发明提供的方法，为用上述多重PCR的引物组、多重PCR试剂或多重PCR试剂盒对待测鸡进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，检测PCR扩增产物。

若PCR扩增产物具有400-450bp大小的PCR扩增产物且不具有300-350bp大小的PCR扩增产物，则待测鸡基因型为或候选为O/O纯合型；若PCR扩增产物具有400-450bp大小的PCR扩增产物和300-350bp大小的PCR扩增产物，则待测鸡基因型为或候选为O/o杂合型；若PCR扩增产物具有300-350bp大小的PCR扩增产物且不具有400-450bp大小的PCR扩增产物，则待测鸡基因型为或候选为o/o纯合型。

上述第五个和第六个目的的方法中，所述400-450bp大小的PCR扩增产物为425bp大小的扩增产物；所述425bp大小的扩增产物的核苷酸序列具体为序列表中的序列4；所述300-350bp大小的PCR扩增产物为340bp大小的PCR扩增产物；所述340bp大小的PCR扩增产物的核苷酸序列为序列表中的序列5；

所述PCR扩增采用的模板具体为待测鸡的基因组DNA；

所述PCR扩增的退火温度具体为58℃；

所述检测PCR扩增产物的方法具体为测序或电泳；

所述待测鸡的基因组DNA具体来源于离体的鸡组织器官或血液。

本发明的实验证明，本发明一段425bp的短片段，根据该短片段设计合成3条引物，用于多重PCR扩增，可以通过检测扩增产物是否含有该短片段用来鉴定待测鸡是否产绿壳蛋，同时可以鉴定鸡绿壳蛋基因型。本发明的方法与之前的方法相比，发现了一个较短的片段，可以用此短片段鉴别，不需要较长的延伸时间、且不需要价格较贵的DNA聚合酶和严格的模板质量，具有鉴定时间短、成本低、操作简单的优点，可以通过执行一次多重PCR快速、准确地检测出个体基因型，成为更简单实用的绿壳蛋基因检测方法。

附图说明

图1为长片段PCR和多重PCR的检测原理

图2为多重PCR产物1.5%琼脂糖胶检测结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、鉴别产绿壳蛋鸡及鸡绿壳蛋基因型短片段及多重PCR引物获得

鸡绿壳蛋性状是由1号染色体上SLC01B3基因上游5'端一段4.2kb的插入序列引起（插入序列只在产绿壳蛋鸡中出现），所以只需检测个体是否携带这段插入序列即可推定个体表型。

经过研究发现一段短的DNA分子（425bp，部分为4.2kb的插入序列），该DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列4；根据此DNA分子设计相关多重PCR引物；具体设计原理如图1所示，两对平行线代表两条同源染色体，实线代表正常基因组序列，虚线代表4.2kb插入序列，箭头代表上下游引物。图形下方标出了个体的表型、基因型，括号中的内容是PCR产物大小；A为长片段PCR检测原理；B为多重PCR检测原理；本发明的创新点在虚线箭头标示2#引物的设计上，它是依据插入序列设计而来，与染色体上正常序列无法配对。在显性纯合子（O/O)和杂合子个体（O/o）个体中，由于个体携带4.2kb的插入序列，2#引物可与1#引物组合扩增出425bp的产物；在隐性纯合子（o/o）中，由于个体不携带插入片段，2#引物无法与基因组配对，1#与2#引物组合无法获得扩增片段，只有1#与3#引物组合能扩增出340bp片段。

本发明设计并合成出3条引物，1#和3#引物根据正常基因组序列设计，2#引物根据插入序列设计（图1B）；其中，1#引物的核苷酸序列为序列表中的序列1；2#引物的核苷酸序列为序列表中的序列2；3#引物的核苷酸序列为序列表中的序列3。

实施例2、多重PCR鉴别产绿壳蛋鸡及鸡绿壳蛋基因型

一、用已知基因型个体验证多重PCR鉴别产绿壳蛋鸡基因型的准确性

1、试验动物

F₀代个体为5只东乡公鸡（已知基因型为O/O)，20只东乡母鸡（已知基因型为o/o），F₁代个体为由上述个体杂交而来的46只母鸡（已知基因型为O/o）。东乡鸡均购自江西东乡华绿种禽有限公司。

2、DNA的提取

分别在F₀和F₁代个体翅下静脉采血1mL，ACD抗凝（ACD：血=3:1），基因组DNA按标准酚-仿法提取：

（1）30μL抗凝血+300μL PBS（1×，pH:7.2）+300μL禽血裂解液（120g尿素、10g SDS、100mL1M Tris.Cl（pH=8.0）、200mL0.5M EDTA(pH=8.0)，蒸馏水定容至1L）+20μL20mg/mL蛋白酶K，55℃消化过夜。

（2）加入600μL Tris饱和酚，漩涡混匀30s，12000rpm/min离心10min。

（3）取上清液（约500μL），加500μL Tris饱和酚和氯仿混合液（1:1），漩涡混匀30s，12000rpm/min离心10min。取上清时枪头去尖。

（4）取上清液（约450μL），加450μL氯仿，漩涡混匀30s，12000rpm/min离心10min。

（5）取上清液（约400μL），加低温的无水乙醇600μL沉淀DNA。

（6）用清洁白枪头将DNA挑入到一个新的1.5mL离心管，70%乙醇500μL洗涤DNA，7500rpm/min离心5min。

（7）小心倒掉70%乙醇，室温放置20min，待乙醇挥发干净后用适量TE缓冲液溶解，得到基因组DNA。

3、多重PCR扩增

总体积25μLPCR反应体系如下：

PCR反应条件：

95℃3min，（95℃30s，58℃30s，72℃20s）×36循环，72℃5min。

检测待测样本是否为产绿壳蛋鸡：

若PCR扩增产物具有大小为425bp产物（核苷酸序列为序列表中的序列4），则待测样本为产绿壳蛋鸡；

若PCR扩增产物不具有425bp产物，则待测样本不为产绿壳蛋鸡。

检测待测样本的基因型：

若PCR扩增产物具有425bp大小的PCR扩增产物且不具有340bp（核苷酸序列为序列表中的序列5）大小的PCR扩增产物，则待测样本为O/O纯合型（绿壳蛋基因显性纯合子），同时待测样本为产绿壳蛋鸡；

若PCR扩增产物具有425bp和340bp大小的PCR扩增产物，则待测样本基因型为O/o杂合型（绿壳蛋基因显性杂合子），同时待测样本为产绿壳蛋鸡；

若PCR扩增产物具有340bp大小的PCR扩增产物且不具有425bp大小的PCR扩增产物，则待测样本基因型为o/o纯合型（绿壳蛋基因隐性纯合子），同时待测样本为不产绿壳蛋鸡。

用1.5%琼脂糖电泳检测PCR产物，时间25min，电压100v，上样量2μL，EB染色，拍照，结果如图2所示，可以看出，在上述常规的扩增条件（短的扩增时间、普通DNA聚合酶）下，就可以实现样本的鉴定，且没有大片段的产生，因此本发明的方法扩增时间短、成本低（常规DNA扩增酶）；统计检测结果如表1所示：

表1 利用多重PCR检测已知基因型个体结果^a

^a表中所列数字为特定基因型或多重PCR带型（组合）所对应的个体数

5只东乡公鸡（已知基因型为O/O)与14只白来航（o/o，美国迪卡育种公司）母鸡测交，证明5只东乡公鸡的绿壳蛋基因位点的基因型为O/O；20只东乡母鸡均产褐壳蛋，故其绿壳蛋基因位点的基因型为o/o；46只F₁母鸡是由上述东乡公鸡和上述东乡母鸡个体杂交而来，其基因型为O/o，且均产绿壳蛋。

上述结果表明，仅得到425bp大小的PCR扩增产物的鸡绿壳蛋基因型为O/O纯合型，且为产绿壳蛋鸡；得到425bp和340bp大小的PCR扩增产物的鸡绿壳蛋基因型为O/o杂合型，且为产绿壳蛋鸡；仅得到340bp大小的PCR扩增产物的鸡绿壳蛋基因型为o/o纯合型，且不产绿壳蛋。

上述结果表明，多重PCR结果和资源群体F₀、F₁绿壳蛋基因位点基因型结果完全一致，证明了本方法的准确性。

因此上述3条引物或者除模板以外的上述反应体系可以作为多重PCR鉴别产绿壳蛋鸡及鸡绿壳蛋基因型的检测试剂盒的组分。

二、大群验证多重PCR鉴定产绿壳蛋鸡及鸡绿壳蛋基因型的准确性

1、试验动物

东乡产绿壳蛋鸡和东乡褐壳蛋鸡购自江西东乡华绿种禽有限公司，卢氏产绿壳蛋鸡和卢氏褐壳蛋鸡购自河南省三门峡三特生态牧业有限公司卢氏鸡育种场，其余品种鸡均购自中国农业大学实验牧场。

2、DNA的提取：与上述一的2相同；

3、多重PCR扩增：与上述一的3相同；

共用到2个产绿壳蛋的鸡品种和9个产非绿壳蛋的鸡品种，目的是在更大的样本和更丰富的品种中验证多重PCR方法鉴定产绿壳蛋鸡及鸡绿壳蛋基因型的准确性。

检测待测样本是否为产绿壳蛋鸡：

若PCR扩增产物具有大小为425bp产物（核苷酸序列为序列表中的序列4），则待测样本为产绿壳蛋鸡；

若PCR扩增产物不具有425bp产物，则待测样本不为产绿壳蛋鸡。

检测待测样本的基因型：

若PCR扩增产物具有425bp大小的PCR扩增产物且不具有340bp（核苷酸序列为序列表中的序列5）大小的PCR扩增产物，则待测样本为O/O纯合型（绿壳蛋基因显性纯合子），同时待测样本为产绿壳蛋鸡；

若PCR扩增产物具有425bp和340bp大小的PCR扩增产物，则待测样本基因型为O/o杂合型（绿壳蛋基因显性杂合子），同时待测样本为产绿壳蛋鸡；

若PCR扩增产物具有340bp大小的PCR扩增产物且不具有425bp大小的PCR扩增产物，则待测样本基因型为o/o纯合型（绿壳蛋基因隐性纯合子），同时待测样本不为产绿壳蛋鸡。

结果如表2所示，经鉴定，141只产绿壳蛋的个体检测结果符合预先假设；268只产非绿壳蛋的个体检测结果符合预先假设。本实施例说明多重PCR法对广大鸡品种均适用。

表2 多重PCR大群鉴定结果

Claims (10)

1.一种鉴定或辅助鉴定待测鸡是否为绿壳蛋鸡的方法，为检测待测鸡的基因组DNA，若基因组DNA中含有目的DNA分子，则所述待测鸡为或候选为绿壳蛋鸡；若基因组DNA中不含有目的DNA分子，则所述待测鸡不为或候选不为绿壳蛋鸡；

所述目的DNA分子为序列表中的序列4所示的DNA分子。

2.一种鉴定或辅助鉴定待测鸡的基因型方法，为检测待测鸡的基因组DNA，若所述基因组DNA中含有目的DNA分子，则所述待测鸡的基因型为或候选为O/O纯合型或O/o杂合型；若基因组DNA中不含有目的DNA分子，则所述待测鸡不为或候选不为O/O纯合型或O/o杂合型；

所述目的DNA分子为序列表中的序列4所示的DNA分子。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述检测待测鸡的基因组DNA的方法为测序、PCR或分子杂交；

所述待测鸡的基因组DNA来源于离体的鸡组织器官或血液。

4.权利要求2所述的方法在鉴定待测鸡是否为产绿壳蛋鸡中的应用；所述应用为若所述待测鸡的基因型为O/O纯合型或O/o杂合型任意一种，则所述待测鸡为产绿壳蛋鸡；若所述待测鸡的基因型不为O/O纯合型或O/o杂合型中的任意一种，则所述待测鸡不为产绿壳蛋鸡。

5.一种DNA分子，为序列表中的序列4所示的DNA分子。

6.鉴别产绿壳蛋鸡和/或鸡绿壳蛋基因型的多重PCR试剂盒：包括引物组、dNTP、PCR扩增缓冲液、DNA聚合酶和水；

所述引物组由引物1、引物2和引物3组成；所述引物1、所述引物2和所述引物3的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2和序列3；所述引物1、所述引物2和所述引物3的摩尔比具体为1:1:1；

所述引物组中的各条引物在所述试剂盒中的终浓度均为0.4-0.5pmol/μL。

7.权利要求6所述多重PCR试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测鸡是否为产绿壳蛋鸡中的应用；

或权利要求6所述多重PCR试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测鸡的基因型中的应用；所述待测鸡基因型具体为O/O纯合型、O/o杂合型或o/o纯合型。

8.一种鉴定或辅助鉴定待测鸡是否为产绿壳蛋鸡的方法，为用权利要求6所述多重PCR试剂盒中的引物组对待测鸡进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，检测PCR扩增产物；

若PCR扩增产物具有400-450bp大小的扩增产物，则待测鸡为或候选为产绿壳蛋鸡；若PCR扩增产物不具有400-450bp大小的扩增产物，则待测鸡不为或候选不为产绿壳蛋鸡。

9.一种鉴定或辅助鉴定待测鸡基因型的方法，为用权利要求6所述多重PCR试剂盒对待测鸡进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，检测PCR扩增产物；

若PCR扩增产物具有400-450bp大小的PCR扩增产物且不具有300-350bp大小的PCR扩增产物，则待测鸡基因型为或候选为O/O纯合型；若PCR扩增产物具有400-450bp大小的PCR扩增产物和300-350bp大小的PCR扩增产物，则待测鸡基因型为或候选为O/o杂合型；若PCR扩增产物具有300-350bp大小的PCR扩增产物且不具有400-450bp大小的PCR扩增产物，则待测鸡基因型为或候选为o/o纯合型。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：

所述400-450bp大小的PCR扩增产物为425bp大小的扩增产物；所述425bp大小的扩增产物的核苷酸序列具体为序列表中的序列4；

所述300-350bp大小的PCR扩增产物为340bp大小的PCR扩增产物；所述340bp大小的PCR扩增产物的核苷酸序列为序列表中的序列5；

所述PCR扩增采用的模板具体为待测鸡的基因组DNA；

所述PCR扩增的退火温度具体为58℃；

所述检测PCR扩增产物的方法具体为测序或电泳；

所述待测鸡的基因组DNA具体来源于离体的鸡组织器官或血液。

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