CN109456962B - 一种从蛋壳中提取dna的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从蛋壳中提取DNA的方法和试剂盒。该方法包括以下步骤：用DNAaway清洁蛋壳表面；获得蛋壳粉末；将所述蛋壳粉末与水和裂解液混匀，冰浴1.5～2.5h后煮沸8～15min，离心，将上清液置于92～97℃金属浴中，敞口保温0.8～1.2h；提取、纯化DNA。该方法能够大大降低提取成本，并具有更高的可重复型，能够保证从长期储存(至少60天)的每一枚鸡蛋蛋壳样品中提取到能够满足多种研究所需DNA。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种从蛋壳中提取DNA的方法及试剂盒。
背景技术
柴鸡蛋是指在生态放养条件下由特定的地方鸡种生产的一类鸡蛋，这类鸡蛋由于蛋黄比例大、蛋黄颜色深、风味物质、磷脂、必需氨基酸等含量高而广受消费者欢迎，也正因为如此，柴鸡蛋的生产具有更好的利润回报。正因为柴鸡蛋具有更高的利润，而普通商品蛋鸡早期所产鸡蛋的蛋重较小，从外观上很容易与柴鸡蛋混淆，因此有些人用蛋重较小的普通鸡蛋冒充柴鸡蛋高价销售来牟利，极大地侵害了柴鸡养殖者的利益，也扰乱了市场秩序，因此急需建立一个有效的鉴别鸡蛋品种的可行方法。
现有技术中的分子标记技术可用于鉴定鸡品种，但需要产蛋鸡的DNA，而市场上的鸡蛋已经离开了产蛋鸡，无法找到产该蛋的母鸡用于分子标记鉴别。鸡蛋是在输卵管中形成的，在此过程中，输卵管上皮细胞脱落会被包被在蛋壳中，可从这些上皮细胞中提取DNA。目前从蛋壳中提取DNA的方法只有两类：即以蛋白酶K消化细胞裂解物为基础的提取法和基于EDTA溶液浸提结合酚、氯仿抽提的提取法。前者使用的蛋白酶K用量是从其它常规组织中提取DNA的用量的5-10倍，并且该方法需要使用浓缩柱浓缩细胞裂解液，使得DNA提取成本过高，而研究显示该方法不够稳定，不能保证所有样品都能提取获得DNA。后者成本得到了改善，但提取过程需要使用酚、氯仿等有毒有害、腐蚀性强的物质，且需要样品量过大(400mg)，很难在不破坏鸡蛋的前提下获得足够的用于分析DNA的蛋壳样品。
发明内容
针对现有蛋壳DNA提取方法存在需要有毒试剂、样本需求量大、成本高、重复性差等的技术问题，本发明提供了一种从蛋壳中提取DNA的方法。
以及，本发明还提供了一种从蛋壳中提取DNA的试剂盒。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种从蛋壳中提取DNA的方法，包括以下步骤：
步骤a、用DNAaway清洁蛋壳表面；
步骤b、获得蛋壳粉末；
步骤c、将所述蛋壳粉末与水、裂解液混匀，冰浴1.5～2.5h后煮沸8～15min，离心，将上清液置于92～97℃金属浴中，敞口保温0.8～1.2h，得到含蛋壳DNA的浓缩液；其中，所述水的质量为所述蛋壳粉末质量的2～3倍，所述裂解液的体积为所述水的体积的1/3～1/2；
步骤d、从所述浓缩液中提取、纯化DNA。
该方法用DNAaway对蛋壳表面进行清洁，能够清除蛋壳表面的DNA和其他杂质，以保障后续提取得到的DNA不被环境中的微生物以及其他鸡的DNA污染。
由于鸡的细胞被蛋壳的碳酸钙包被，92～97℃金属浴的高温加热能够将蛋壳中的大分子DNA打断为小分子片段，从而提高其通过碳酸钙被膜的效率，因此可显著提高DNA提取效率。金属浴与水浴相比，升温快，水分挥发快，保温0.8～1.2h即可使溶液浓缩为原体积的1/4左右，从而减少后续操作中试剂的使用量，节约试剂，还可避免水浴时产生的水蒸气或操作过程中水浴锅中的水对裂解溶液的污染。该浓缩方法与价格高昂的浓缩柱相比，浓缩成本大大降低。
与现有技术相比，本发明建立的蛋壳DNA提取方法具有更高的可重复性，能够保证从长期储存(至少60天)的每一枚鸡蛋蛋壳样品中提取到能够满足多种研究所需DNA。通过PCR检测发现，利用本发明建立的方法所提取的蛋壳DNA至少可用于400bp长DNA片段的扩增。通过微卫星DNA标记分析可知，本方法所提的蛋壳DNA来自于产该蛋的母鸡，排除了储存环境微生物或其它鸡只DNA的污染，并且，从100mg样品中提取的蛋壳DNA至少能用于10个以上微卫星标记分析，基本可以满足大多数DNA分析的需要，为应用分子标记鉴别真假柴鸡蛋提供了新的研究方法。
优选地，步骤c中所述裂解液为三乙醇胺月桂基硫酸盐缓冲液，所述三乙醇胺月桂基硫酸盐缓冲液含有0.08～0.12M的Tris·Cl、0.08～0.12M的EDTA以及25～35mg/mL的三乙醇胺月桂基硫酸盐，pH＝7.8～8.2。用价格低廉的三乙醇胺月桂基硫酸盐代替价格高昂的蛋白酶K，能够大幅降低降解成本。通过对三乙醇胺月桂基硫酸盐缓冲液中各成分及其用量进行优选，使该缓冲液能够很好地裂解细胞和细胞核，释放DNA。
优选地，所述三乙醇胺月桂基硫酸盐缓冲液含有0.1M的Tris·Cl、0.1M的EDTA以及30mg/mL的三乙醇胺月桂基硫酸盐，pH＝8.0。
优选地，步骤d中提取、纯化DNA的方法为硅胶膜吸附法。使用硅胶膜吸附法替代现有技术中的酚、氯仿抽提，避免了实验人员和有毒有害物质接触。同时，结合92～97℃金属浴的高温加热浓缩裂解溶液，又使得DNA提取效率提高了至少4倍以上，由此可使样品需求量降至酚、氯仿抽提法的四分之一，从而使得本发明所建立的方法能够满足多种不同研究的需要，如化石、不破坏鸡蛋提取DNA等难以获得大量样本的实验研究。
优选地，用所述硅胶膜吸附法提取、纯化DNA的具体操作为：取出步骤c所得浓缩液的上清液，加入相当于所述上清液4.5～5.5倍体积的结合液，混匀并转移至硅胶膜离心柱中，25～30℃静置1～1.5min，10000～12000rpm离心1～1.5分钟，弃去所述离心柱套管中的液体，用漂洗液漂洗两次后，将所述离心柱10000～12000rpm离心3～4min，转移离心柱至敞口离心管中，向所述离心柱的硅胶膜表面加入无菌双蒸水，室温保温5～6分钟，10000～12000rpm离心
1～1.5min，收集DNA；所述结合液含有5.5～6.0M异硫氰酸胍和0.08～0.12M pH为7.2±0.05的Tris·HCl，所述漂洗液为78～82％v/v乙醇。无菌双蒸水的用量以刚好浸透硅胶膜为宜。
优选地，上述从蛋壳中提取DNA的方法还包括对步骤d所得DNA进行PCR扩增，所述PCR扩增的扩增引物为：
引物1：5‘-TTTGACCAGCGTAGATAA-3’，
引物2：5‘-ATGTTAGCAGTGTAGTTG-3’，
引物3：5‘-TAGGTTCCGAACGCGATGT-3’。
上述引物可用于鉴定多种类柴鸡蛋蛋壳颜色基因型。以上述引物进行PCR扩增后，绿壳基因型纯合个体的扩增产物为一条的400bp的DNA带，杂合个体的扩增产物为300bp和400bp两条DNA带，非绿壳蛋个体的扩增产物为一条300bp的DNA带。
优选地，所述PCR扩增的反应体系为：
优选地，所述反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，40循环，72℃保温7min，取产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。
以及，本发明实施例还提供了一种从蛋壳中提取DNA的试剂盒，所述试剂盒中包括裂解液、硅胶膜离心柱、结合液和漂洗液；所述裂解液为三乙醇胺月桂基硫酸盐缓冲液，所述三乙醇胺月桂基硫酸盐缓冲液含有0.1M的Tris·Cl、0.1M的EDTA以及30mg/mL的三乙醇胺月桂基硫酸盐，pH＝8.0；所述结合液含有6M异硫氰酸胍和0.1M pH为7.2的Tris·HCl，所述漂洗液为80％v/v乙醇。
该试剂盒可用于蛋壳DNA的提取。其中裂解液用价格低廉的三乙醇胺月桂基硫酸盐代替价格高昂的蛋白酶K，能够大幅降低降解成本。
优选地，该试剂盒还包括DNA提取质量鉴定PCR扩增引物，所述DNA提取质量鉴定PCR扩增引物为：
引物1：5‘-TTTGACCAGCGTAGATAA-3’，
引物2：5‘-ATGTTAGCAGTGTAGTTG-3’，
引物3：5‘-TAGGTTCCGAACGCGATGT-3’。
上述引物可用于对提取所得DNA进行扩增，以便进行电泳实验鉴定DNA提取的质量。
附图说明
图1为本发明实施例2中室温存放60天的鸡蛋提取的蛋壳DNA用提取质量鉴定PCR引物扩增后所得PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果；
图2A为本发明实施例3中10对微卫星标记PCR引物中MCW0330引物扩增产物聚丙烯凝胶电泳结果；
图2B为本发明实施例3中10对微卫星标记PCR引物中ADL025引物扩增产物聚丙烯凝胶电泳结果；
图2C为本发明实施例3中10对微卫星标记PCR引物中MCW0097引物扩增产物聚丙烯凝胶电泳结果；
图2D为本发明实施例3中10对微卫星标记PCR引物中MCW32引物扩增产物聚丙烯凝胶电泳结果；
图2E为本发明实施例3中10对微卫星标记PCR引物中ADL183引物扩增产物聚丙烯凝胶电泳结果；
图2F为本发明实施例3中10对微卫星标记PCR引物中ADL328引物扩增产物聚丙烯凝胶电泳结果；
图2G为本发明实施例3中10对微卫星标记PCR引物中MCEW0122引物扩增产物聚丙烯凝胶电泳结果；
图2H为本发明实施例3中10对微卫星标记PCR引物中ADL176引物扩增产物聚丙烯凝胶电泳结果；
图2I为本发明实施例3中10对微卫星标记PCR引物中ADL298引物扩增产物聚丙烯凝胶电泳结果；
图2J为本发明实施例3中10对微卫星标记PCR引物中LEI0094引物扩增产物聚丙烯凝胶电泳结果；
附图说明：
1为以水作为模板的空白对照；2-12为取蛋壳经研钵研磨成粉末后提取DNA的PCR扩增产物电泳结果；13-23为用砂纸打磨蛋壳取蛋壳粉末提取DNA的PCR扩增产物电泳结果；24为鸡血提取DNA的PCR扩增产物电泳结果；M为上海生工生物工程公司生产的DNA分子量标准Marker B。
其中A1～J1、A3～J3、A5～J5、A7～J7、A9～J9、A11～J11、A13～J13、A15～J15、A17～J17、A19～J19为10个不同母鸡所产蛋的蛋壳提取DNA微卫星标记PCR产物电泳结果；A2～J2、A4～J4、A6～J6、A8～J8、A10～J10、A12～J12、A14～J14、A16～J16、A18～J18、A20～J20为对应鸡蛋产该蛋母鸡血液基因组DNA微卫星标记PCR产物电泳结果；A0～J0为上海生工生物工程公司生产的DNA分子量标准Marker B。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供了一种从蛋壳中提取DNA的方法。
1、材料与仪器
1.1DNA提取材料
随机选取储存60天的绿壳太行鸡蛋20枚和粉壳太行鸡蛋2枚，分别分为两组，每组含绿壳太行鸡蛋10枚，粉壳太行鸡蛋1枚。分别用两种蛋壳处理方法获取蛋壳粉末作为后续提取DNA的材料。同时采集产对应鸡蛋的母鸡血液样本，用常规方法提取其DNA。
1.2其他试剂
DNAaway购自碧云天生物技术研究所；硅胶膜离心柱购自江苏南通春诚生物实验器材厂；三乙醇胺月桂基硫酸盐购自广东翁江化学试剂有限公司；三乙醇胺购自天津市进丰化工有限公司；DNA分子量标准Marker B，购自上海生工生物工程公司；6×LoadingBuffer、Taq DNA聚合酶、dNTP(2.5mM each)，购自全式金生物科技有限公司；琼脂糖、Tris·Cl、EDTA-Na2、溴化乙锭、硼酸、过硫酸胺、丙烯酰胺、N,N’-二甲双丙烯酰胺、Na2S2O3、硝酸银、硝酸、甲醛等购自上海生工生物工程有限公司。PCR引物由华大基因科技有限公司合成。
1.3仪器
主要仪器：PCR仪(ABI Veriti)、微量移液器(Eppendorf Research plus)、离心机(湘仪)、凝胶成像仪(BIORED Gel Doc1000)、电子天平(JA1203型)、高压灭菌锅(日本SANYO公司)、水平电泳仪(DYY-31BN)、垂直电泳仪(DYY-24A)、磁力加热搅拌器(SK-1)、酸度计、恒温金属浴加热器(YIU-10A，上海逸尤仪器有限公司)。
2、蛋壳DNA提取
2.1样品前处理
取鸡蛋用蒸馏水将鸡蛋洗净晾干，然后用吸附了DNAaway的棉球擦拭蛋壳表面，晾干至无漂白粉味为止；
2.2取材
将1.1中的两组鸡蛋分别按如下方法处理：
(1)破坏鸡蛋：剥离蛋壳，用研钵将剥离的蛋壳研磨成粉末；
(2)不破坏鸡蛋：用边长2cm细砂纸打磨蛋壳表面收集蛋壳粉末；
2.3DNA提取
取100mg蛋壳粉末加入1个灭菌的1.5ml离心管中，然后加入300μL灭菌双蒸水和100μL裂解液(含有0.1M的Tris·Cl、0.1M的EDTA以及30mg/mL的三乙醇胺月桂基硫酸盐，pH＝8.0)混匀，冰浴2小时，然后沸水煮10分钟，室温12000rpm离心1分钟，取上清至一个新的1.5ml离心管中，打开离心管盖，并将该离心管置于95℃金属浴中保温1小时，使离心管中的上清液浓缩至100μL，加入500μL结合液，混匀，加入装有硅胶膜的离心柱中，室温静置1分钟，然后室温12000rpm离心1分钟，倒掉离心柱套管中液体，加入650μL漂洗液，室温12000rpm，离心1min，倒掉离心柱套管中液体，重复一次漂洗液洗涤，然后将离心柱室温12000rpm离心3min，将离心柱转移到去掉离心管盖的1.5ml离心管中，向离心柱的硅胶模表面加入35μL无菌双蒸水，室温保温5分钟，然后室温12000rpm离心1min，收集DNA(约30μL)。结合液含有6M异硫氰酸胍和0.1M pH为7.2的Tris·HCl，漂洗液为80％v/v乙醇。
实施例2
本实施例提供了实施例1所得DNA的PCR扩增。
由于蛋壳中DNA含量非常低，因此实施例1提取得到的DNA不能直接通过琼脂糖电泳检测，但可直接作为PCR扩增的模板。
PCR扩增引物为鉴定绿壳蛋鸡绿壳基因型的引物：
引物1：5‘-TTTGACCAGCGTAGATAA-3’，
引物2：5‘-ATGTTAGCAGTGTAGTTG-3’，
引物3：5‘-TAGGTTCCGAACGCGATGT-3’。
绿壳基因型纯合个体的扩增产物为一条400bp的DNA带，杂合个体的扩增产物为300bp和400bp两条DNA带，非绿壳蛋个体的扩增产物为一条300bp的DNA带。PCR反应所用DNA为实施例1中所提取的DNA及一个用常规方法从鸡血液中提取的DNA。
PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，40循环，72℃，保温7min，取产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。取8.5μL扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。结果如图1所示。
图1的结果表明应用上述PCR条件对22个蛋壳中提取的DNA进行PCR扩增，应用上述方法获得的DNA至少能用于长度400bp的DNA片段的扩增，而且每一个样品都得到了理想的扩增产物，说明本发明建立的方法具有良好的可重复性。
实施例3
本实施例提供了微卫星DNA标记分析实施例1提取所得DNA与产该蛋母鸡DNA的一致性；
1、试剂配制：
(1)5×TBE缓冲液：Tris碱27g，硼酸13.75g，EDTA1.86g，加超纯水定容至500mL。
(2)10％过硫酸胺：称取0.5g过硫酸胺，溶解于5mL灭菌超纯水中，在4℃保存(现用现配)。
(3)30％丙烯酰胺：称取116g丙烯酞胺和4g N,N’-亚甲双丙烯酞胺置于烧杯中，用240mL的纯水溶解，溶解后用量筒定容至终体积为400mL。避光保存。
(4)8％聚丙烯酰胺凝胶配制：取30％的聚丙烯酰胺13.3mL，5×TBE 10mL，纯水26.4mL，10％过硫酸铵500μL，用移液枪吸取TEMED 30μL，混匀后迅速灌胶(边加试剂边搅拌)，室温放置1小时左右凝固。
(5)10％Na2S2O3：称取Na2S2O3 0.5g，加5mL纯水中溶解，混匀备用。
(6)染色液：称取2g硝酸银溶于1L纯水中，避光保存，用时加入2.8mL37％甲醛。
(7)显色液：称取Na2CO3 30g，溶于1000mL蒸馏水中，用时加入0.7mL37％甲醛，0.1mL10％Na2S2O3。
(8)1％硝酸：量取65％的浓硝酸2.7mL，加水至500mL。
2、试验方法
(1)PCR反应
PCR反应所用引物序列、扩增片段长度及退火温度见表1，在前期研究中已经证明所选的这10个微卫星标记位点在太行鸡(本实验用的鸡的品种)群体中具有较理想的多态性信息含量以及等位基因数和等位基因频率，综合应用能够有效区分不同个体。所用DNA为从实施例1中提取的22个鸡蛋蛋壳的DNA中随机选取10个DNA样品，同时采集产这10枚蛋的对应母鸡的血液，用常规方法提取的DNA，后者作为对照。
表1提取DNA分析用微卫星DNA标记引物
PCR反应体系：
PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火30s(退火温度如表1所示)，72℃延伸45s，40循环，然后72℃保温7min。
(2)聚丙烯凝胶电泳及银染
试验中为保证电泳结果条带整齐、准确，在低温中进行。先用量筒量取5×TBE200mL，纯水800mL，混匀后加入电泳槽中，将灌制好的凝胶板用夹子固定于电泳槽的两边，若点样孔内有气泡，用注射器吸取电泳槽中的缓冲液反复吹打即可。取25μL实施例2所得PCR扩增产物加5μL上样缓冲液混匀，取5μL上样，上样顺序为1-10号蛋的蛋壳DNA PCR扩增产物、产该蛋母鸡DNAPCR扩增产物交替上样，使用购自上海生工生物工程公司的DNA分子量标准Marker B为DNA分子量标准。80V电泳过夜。溴酚蓝条带迁移到凝胶中底部时结束电泳，对聚丙烯酰胺凝胶进行银染。
银染步骤如下：
1)固定：从玻璃板中取下电泳好的凝胶，置于10％的乙醇溶液中固定，直至溴酚蓝颜色褪去为止。
2)氧化：将固定好的凝胶放到1％的硝酸溶液中氧化3min，氧化时间不宜过长，倒掉硝酸溶液。用蒸馏水洗两次，每次10s。
3)染色：加入适量的染色液(2％硝酸银，预加甲醛)放置托盘中，在摇床上染色20min。
4)洗涤：用蒸馏水漂洗凝胶15s。
5)显色：在200ml质量百分浓度为3％的Na2CO3中加入质量百分浓度为10％的硫代硫酸钠0.1mL，0.7mL 37％的甲醛。直至清晰得条带出现，显色时间不宜过长，以免背景颜色变深，不易辨别条带。
6)停显：放到4％的乙酸中进行停显，凝胶放置清澈的蒸馏水中用数码相机进行照相，保存图片和凝胶。结果如图2A～2J所示。
从图2A～2J结果可以看出这10对微卫星标记引物扩增产物中蛋壳DNA和产该蛋母鸡的带型无一例外的完全相同，而不同鸡蛋蛋壳DNA和母鸡DNA扩增产物至少有一对引物存在差异，该结果表明，所选微卫星DNA能够满足区分不同个体的需要，同时，也说明从蛋壳中提取的DNA与产该蛋母鸡完全同质，即，应用本发明建立的从蛋壳中提取DNA的方法能够有效去除环境中微生物以及其它母鸡DNA的污染，提取得到的DNA和产该蛋的母鸡是完全同质，并且从100mg蛋壳中提取获得的DNA能够至少满足10个分子标记分析的需要。
以上结果证明，本发明提供的从蛋壳中提取DNA的方法不需要有毒试剂，样品需求量小，成本低，重复性好，基本能够满足多种不同研究的需要，如化石、不破坏鸡蛋的有关分析等难以获得大量样本的实验研究，为应用分子标记鉴别真假柴鸡蛋提供了新的研究方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北农业大学
<120> 一种从蛋壳中提取DNA的方法和试剂盒
<130> 2018.12.17
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物1
<400> 1
tttgaccagc gtagataa 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物2
<400> 2
atgttagcag tgtagttg 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物3
<400> 3
taggttccga acgcgatgt 18
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> MCW0330-F
<400> 4
tggacctcat cagtctgaca g 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> MCW0330-R
<400> 5
aatgttctca tagagttcct gc 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> MCW32-F
<400> 6
aagttccttg tacaattgtt a 21
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> MCW32-R
<400> 7
tcattactag tacaagcaag atgg 24
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> LEI0094-F
<400> 8
caggatggct gttatgcttc ca 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> LEI0094-R
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cacagtgcag agtggtgcga 20
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<211> 20
<212> DNA
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caaggctggg attgatgaaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> ADL298-R
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tggcgtgtgg gtttacaaaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> ADL176-F
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ttgtggattc tggtggtagc 20
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ttctcccgta acactcgtca 20
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<213> ADL328-F
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cacccatagc tgtgactttg 20
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aaaaccggaa tgtgtaactg 20
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<212> DNA
<213> MCW0097-R
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tggtcttcca gtctatggta g 21
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<211> 20
<212> DNA
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tttggcttag ggtgatgctg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> ADL0251-R
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cgtgctccac acaggaatgt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> ADL183-F
<400> 22
ttgtgaagtg gataagatga 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> ADL183-R
<400> 23
acagaaatgg aaagcgagac 20
Claims (4)
1.一种从蛋壳中提取DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤a、用DNAaway清洁蛋壳表面；
步骤b、获得蛋壳粉末；
步骤c、将所述蛋壳粉末与水、裂解液混匀，冰浴1.5~2.5h后煮沸8~15min，离心，将上清液置于92~97℃金属浴中，敞口保温0.8~1.2h，得到含蛋壳DNA的浓缩液；其中，所述水的质量为所述蛋壳粉末质量的2~3倍，所述裂解液的体积为所述水的体积的1/3~1/2；所述裂解液为三乙醇胺月桂基硫酸盐缓冲液，所述三乙醇胺月桂基硫酸盐缓冲液含有0.1M的Tris·Cl、0.1M的EDTA以及30mg/mL的三乙醇胺月桂基硫酸盐，pH=8.0；
步骤d、用硅胶膜吸附法从所述浓缩液中提取、纯化DNA，具体操作为：取出步骤c所得浓缩液的上清液，加入相当于所述上清液4.5~5.5倍体积的结合液，混匀并转移至硅胶膜离心柱中，25~30℃静置1~1.5min，10000~12000rpm离心1~1.5分钟，弃去所述离心柱套管中的液体，用漂洗液漂洗两次后，将所述离心柱10000~12000rpm离心3~4min，转移离心柱至敞口离心管中，向所述离心柱的硅胶膜表面加入无菌双蒸水，室温保温5~6分钟，10000~12000rpm离心1~1.5min，收集DNA；所述结合液含有6M异硫氰酸胍和0.1M pH为7.2的Tris·HCl，所述漂洗液为80%v/v乙醇。
2.根据权利要求1所述的从蛋壳中提取DNA的方法，其特征在于：还包括对步骤d所得DNA进行PCR扩增，所述PCR扩增的扩增引物为：
引物1：5‘-TTTGACCAGCGTAGATAA-3’，
引物2：5‘-ATGTTAGCAGTGTAGTTG-3’，
引物3：5‘-TAGGTTCCGAACGCGATGT-3’。
3.根据权利要求2所述的从蛋壳中提取DNA的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：
10×Taq DNA聚合酶Buffer 2.5μL；
dNTP，每种2.5mM 2μL；
引物1、2和3 各 1μL；
Taq DNA聚合酶，5U/μL 0.5μL；
DNA 2μL；
H2O 15μL。
4.根据权利要求3所述的从蛋壳中提取DNA的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，40循环，72℃保温7min，取产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。
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