CN108893528B

CN108893528B - 一种质粒dna分子标准物质的量值修正方法

Info

Publication number: CN108893528B
Application number: CN201810641569.4A
Authority: CN
Inventors: 李亮; 金芜军; 宛煜嵩; 郑子繁; 刘卫晓; 胡晓颖; 柳方方; 董美
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2018-06-21
Filing date: 2018-06-21
Publication date: 2021-09-17
Anticipated expiration: 2038-06-21
Also published as: CN108893528A

Abstract

本发明公开了一种质粒DNA分子标准物质量值修正的方法。该方法通过质粒分子DNA标准物质中加入非靶标DNA作为填充物，采用微滴数字PCR技术确定最佳填充物的种类，以此消除质粒DNA分子标准物质的理论值与实际测量值的偏倚问题。质粒DNA分子标准物质是核酸量值传递的重要载体，采用本发明的修正方法，可以为医疗诊断、司法鉴定、物种鉴定、基础生物学研究及转基因检测等核酸分析领域提供量值准确、稳定性良好、测量结果具有可靠性、可比性和溯源性的质粒DNA分子标准物质。

Description

一种质粒DNA分子标准物质的量值修正方法

技术领域

本发明属于生物基因技术领域，具体涉及一种质粒DNA分子标准物质的量值修正方法。

背景技术

质粒DNA标准物质由一种含有外源基因片段和内标准基因片段的质粒DNA制备而成。相比其他种类标准物质，质粒DNA具有易于富集，非农产品来源，高效、制备快捷等优点，同时也解决了材料获取困难的问题，已广泛应用于医疗诊断、环境微生物监测、转基因成分检测及分子生物学基础研究中。

而目前仅有四种质粒DNA标准物质研制与生产，分别用于检测：转基因玉米98140(ERM-AD427)、转基因大豆356043(ERM-AD425)、转基因玉米NK603(ERM-AD415)、MON810(ERM-AD413)质粒DNA标准物质。重要的是这四种质粒DNA采用测序比值作为定值结果，未真正的实现量值确定与量值溯源。因此，转基因质粒DNA标准物质的研制和应用成为国内外农业转基因生物安全管理体系建设的当务之急，也将成为转基因检测、监测的重要技术支撑之一。

质粒DNA分子标准物质研制的瓶颈之一就是理论值与测量值之间的偏倚问题。理论值即为通过基因克隆操作，定向插入质粒载体中已知数目的片段，并通过测序技术，验证了插入片段的位置、大小及数量。而测量值，是指通过核酸定量技术，确定质粒DNA分子中插入的数量及数量间的比值。举例如下：某质粒中，插入了玉米内源基因1个，转基因玉米特异性检测基因1个，通过测序，证明了上述操作，在应用时，转基因玉米特异性基因与内源基因的比值为1:1，可表示为1.0或100％，即可用作转基因玉米的含量测试。而通过实时荧光定量PCR或数字PCR平台测量时，往往得到的结果不是1:1的。

发明内容

本专利发明了一种质粒DNA分子标准物质的量值修正方法，解决了质粒DNA分子量值偏倚问题。

一种质粒DNA分子标准物质的量值修正方法，通过微滴数字PCR技术选择校准质粒DNA分子量值偏倚的填充物来修正质粒DNA量值。

本发明所涉及的量值修正是通过微滴数字PCR技术选择最佳的质粒DNA分子标准物质填充物，保证测试结果能与理论值吻合，具体依赖如下的步骤：

(1)为避免填充物DNA对目标物种量值的干扰，需选取与质粒DNA分子标准物质量值不相关的物种作为填充物，至少选择5种；

(2)采用经济、高效、稳定和试用性强的核酸提取与纯化方法，分离纯化填充物DNA；

(3)将填充物加入质粒DNA分子中，充分混匀，置于4℃条件下保存。

(4)采用微滴数字PCR方法，对样品进行测试：质粒DNA分子，质粒DNA分子+不同填充物；

(5)结果的收集与统计：在结果中筛选出符合质粒DNA分子标准物质理论值的组合，以此填充物确定为标准物质量值修正的最佳填充物。

本发明的有益效果：本发明填充物加入质粒DNA分子标准物质以后，矫正了质粒DNA量值的偏倚。本发明的修正方法，可以为质粒DNA标准物质研制，包括医疗诊断、司法鉴定、物种鉴定、基础生物学研究及转基因检测提供量值准确、稳定性良好、测量结果具有可靠性、可比性和溯源性的质粒DNA分子标准物质。

附图说明

图1是质粒GA21各填充DNA的均值标准偏差图；COTTON是棉花、RICE是水稻、RAPE是油菜、SOYBEAN是大豆、H₂O是水、HUMAN是血细胞。

图2是质粒GTS各填充DNA的均值标准偏差图；COTTON是棉花、RICE是水稻、RAPE是油菜、MAIZE是玉米、H₂O是水、HUMAN是血细胞。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

下述实验采用如下所述的实验材料

1、填充物材料

专利中涉及的大豆、玉米、水稻、棉花与油菜均为常规育种材料，血红细胞由天津市西青医院馈赠。

2、实验仪器

分光光度计：Thermo ND-1000；

离心机：Thermo Bioguge Primo R，中佳科仪SC-3610；

定性PCR仪：AB Veriti梯度PCR仪；

数字PCR仪：BioRad QX200；

其他仪器包括水浴锅，精密天平，通风柜，生物安全柜等。

实施例1

基因组DNA的提取与检测

1.植物基因组DNA提取:

采用试剂盒DP305(天根生化科技有限公司)进行水稻、大豆、玉米、棉花、油菜基因组DNA提取和纯化，提取方法如下：

1)取200mg样品粉末样品；

2)加入800μL 65℃预热的GP1缓冲液，迅速颠倒混匀，将离心管放在65℃水浴1h，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。

3)加入等体积酚：氯仿(1:1)，充分混匀，12000rpm离心10min。

4)转移上清至一新离心管，加入等体积氯仿，充分混匀，12000rpm离心10min。

5)取上清，加入等体积GP2，充分混匀。

6)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液(吸附柱容积700μL，可分次加入离心)。

7)向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8)向吸附柱CB3中加入800μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

9)重复步骤8。

10)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3至于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加入60μL 0.1×TE缓冲液，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

采用紫外分光光度计检测DNA浓度与纯度时，DNA应在OD₂₆₀处有显著吸收峰，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7-1.9。

2.人类基因组提取：

采用试剂盒DP304(天根生化科技有限公司)进行血红细胞DNA提取和纯化，提取方法如下：

1)处理材料：贴壁培养的细胞因先处理为悬液，然后1000rpm(～11200×g)离心1min，倒尽上清，加200μL缓冲液GA，震荡至彻底悬浮。

2)加入20μL Proteinase K溶液，混匀。

3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

4)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(～13400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm(～13400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

7)向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW，12000rpm(～13400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

8)重复操作步骤7)

9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(～13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE,室温放置2～5min，12000rpm(～13400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

实施例2

数字PCR

将各物种叶片提取的DNA进行稀释至1ng/μL作为备用的背景DNA溶液，再用稀释后的背景DNA溶液将质粒拷贝数5.84×10⁹copies/ul的GA21及拷贝数6.34×10⁹copies/μL的GTS分别逐级稀释，最终拷贝数为5.84×10⁴copies/μL及6.34×10⁴copies/μL。采用相同的数字PCR定值方法对质粒GA21、GTS进行定值，在数字PCR体系中，取1μL作为模板。根据GA21、GTS的插入基因载体和其5’端旁侧序列的连接区序列为靶序列设计转化体特异性定量引物及探针，采用adh1与lectin作为内源参照基因。定量引物及探针见表1。

表1数字PCR检测引物及探针

设置GA21、GTS数字PCR反应体系见表2-5。

表2 GA21转化体特异性方法数字PCR反应体系

表3 GA21内源检测方法数字PCR反应体系

试剂	终浓度	体积
			无菌水		6.5μL
2×TaqMan反应缓冲液	1×	10μL
			10μmol/L adh1-F	0.4μmol/L	1μL
10μmol/L adh1-R	0.4μmol/L	1μL
			10μmol/Ladh1-P	0.2μmol/L	0.5μL
DNA模板		1.0μL
			总体积		20.0μL

表4 质粒GTS转化体特异性数字PCR反应体系

试剂	终浓度	体积
			无菌水		6.5μL
2×TaqMan反应缓冲液	1×	10μL
			10μmol/L GTS-F	0.4μmol/L	1μL
10μmol/L GTS-R	0.4μmol/L	1μL
			10μmol/LGTS-P	0.2μmol/L	0.5μL
DNA模板		1.0μL
			总体积		20.0μL

表5质粒GTS内源基因数字PCR反应体系

将质粒按上述体系配置后再微滴生成仪上生成微滴。在微滴生成卡(8孔)的样品孔加入20μL的样品溶液，在油孔加入70μL的生成油，放入仪器中形成40μL的微滴，吸取微滴移至96孔PCR板，直接放入PCR仪中，运行数字PCR反应，反应程序如表6。

表6微滴扩增反应程序

实施例3

结果的收集与统计

质粒GA21和GTS理论值：

GA21与GTS质粒中，外源检测片段与内源基因均为1：1，也就是说，每个质粒均将1个外源检测片段和1一个内源基因构建到了质粒载体上。据此，微滴数字PCR对质粒扩增后，理论为应该1：1，也可表示成外源/内源＝1.00。

实验结果：

在GA21质粒DNA分子标准物质中，分别加入了棉花、水稻、油菜、大豆、血红细胞和去离子水，结果见表7及图1。由数据可知，GA21质粒DNA分子标准物质中加入棉花基因组DNA作为背景填充物，量值结果为0.99，最接近理论是1.00。

表7质粒GA21填充物测试原始数据与统计

在GTS质粒DNA分子标准物质中，分别加入了棉花、水稻、油菜、玉米、血红细胞和去离子水，结果见表8及图2。由数据可知，GTS质粒DNA分子标准物质中加入血液细胞DNA或者去离子水量值分别为0.99和0.97，最接近理论值1.00。但是依据标准物质研制要求，标准物质的浓度越高越稳定，加入血细胞DNA作为填充DNA后，提高了标准物质溶液中DNA总浓度，有效阻止了目标DNA(质粒DNA)的降解速度，故此，GTS质粒选择血液细胞DNA作为填充物能修正量值结果。

表8质粒GTS填充物测试原始数据与统计

Claims

1.一种质粒DNA分子填充物的选择方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

（1）选取与质粒DNA分子标准物质量值不相关的物种作为填充物；所述物种为棉花、水稻、油菜、大豆和血红细胞；

（2）分离纯化填充物DNA；

（3）将填充物加入质粒DNA分子中，充分混匀，置于4℃条件下保存；

（4）采用微滴数字PCR方法，分别对质粒DNA分子、质粒DNA分子和不同填充物的组合进行测试；

（5）结果的收集与统计：在结果中筛选出符合质粒DNA分子标准物质理论值的组合，确定棉花为标准物质量值修正的最佳填充物；

所述质粒DNA分子为质粒GA21。