CN103361411A - 转基因水稻克螟稻2号核酸定量检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种转基因水稻克螟稻2号核酸定量检测方法和检测试剂盒。本发明筛选出了效果最好的适合检测的内标准基因RBE4；找到了适合定量检测的最佳PCR体系，可以快速、准确地得到转基因水稻克螟稻2号或其制品中转基因成分的精确含量。本发明还建立了一种在转基因生物定量检测中修正检测值与真实值偏差的方法。本发明测算转基因与受体非转基因生物的核酸提取效率的比值，用此比值作为校正系数，可得到转基因成分的真实准确含量。

Description

转基因水稻克螟稻2号核酸定量检测试剂盒

技术领域：

本发明涉及一种转基因水稻克螟稻2号核酸定量检测方法和检测试剂盒。本发明还涉及一种用于修正转基因检测值与真实值间的偏差方法，具体地说，是建立一种计算修正偏差的校正系数的方法。

背景技术：

转基因水稻克螟稻2号是由受体水稻秀水11转入外源基因Cry1Ab后培育的抗虫水稻。

有关克螟稻2号的转基因检测方法有如下报道：岳运锋等发表在《中国油料作物学报》上的文章《转基因植物中标记基因定性PCR检测方法研究》，报道了有关克螟稻定性检测方法。但到目前为止针对转基因水稻克螟稻2号的精确定量检测方法的内容还尚未见到。

随着转基因技术的迅速发展，转基因植物及其产品的生物安全性以及可能对人类健康的影响引起了各国政府和民众的普遍关注。许多国家和地区都加强了对转基因商品的管理，出台了对转基因生物产品实施强制性标签的制度，规定了食品中转基因成分含量的最低标识限量。

目前，克螟稻2号已被农业部农业转基因生物安全委员会定义为最安全的等级，并通过了食用安全性认证。因为克螟稻2号有可能作为食品，因此，建立克螟稻2号水稻中转基因成分的定量检测方法，特别是研究出比较精确的定量检测方法和提供克螟稻2号水稻检测试剂非常必要。

转基因生物检测首先需要提取转基因植物的DNA。理想状态下，转基因植物与其受体植物的DNA提取效率应该相同。但有些生物在插入外源基因形成转基因生物后，会引起生物的某些特性发生变化，因此转基因生物的基因组在提取时会受到影响，提取的外源基因DNA浓度低于其真实浓度，导致转基因成分的检测值(即外源基因拷贝数/内标准基因的拷贝数分数)低于其实际值。

因此，需要研究一种在转基因生物检测中用于修正转基因检测值与真实值间的偏差方法。

发明内容：

本发明的目的是提供一种精确定量检测转基因水稻克螟稻2号(KMD2)及其制品的方法和检测试剂盒，且灵敏度高、特异性强、准确度好，精确度高。

本发明的另一目的是，建立一种用于修正转基因检测值与真实值间的偏差方法，具体地说，是建立一种计算修正偏差的校正系数的方法。

本发明首次建立了一种精确定量检测转基因水稻克螟稻2号及其制品的方法，为了满足转基因水稻克螟稻2号检测的精确定量，要求水稻内标准基因的扩增效果和扩增效率均与外源基因克螟稻2号相同。本发明人进行了如下工作：

①选择适合的内标准基因

分别合成了五种常用的水稻内标准基因水稻基因GOS9、PLD、SPS、RBE4、UBQ5引物后，以提取的转基因水稻克螟稻2号为基础，分别进行五个内标准基因和外源基因克螟稻的PCR扩增，将扩增后的PCR产物，进行电泳分析。结果发现RBE4基因的扩增产物亮度最接近外源基因克螟稻2号，其余四个内标准基因产物亮度都暗。

因此，确定了转基因水稻克螟稻2号检测的内标准基因为RBE4。

②得到适合两个基因扩增的最佳条件

合成内标准基因RBE4和外源基因克螟稻2号的引物和探针，进行PCR体系优化，得到适合两个基因扩增的最佳条件。

我们对现有技术中关于转基因该检测方法的五个元素的配比体系上进行了优化，得出了最佳的检测PCR体系。

③验证检测方法的效果

将提取的转基因水稻克螟稻2号基因组DNA进行系列稀释后作为模板，分别进行内标准基因RBE4和外源基因克螟稻2号的荧光定量PCR扩增，将每个稀释梯度浓度的模板所扩增的RBE4和克螟稻2号基因扩增的Ct值进行比较，结果发现：

克螟稻2号与RBE4的Ct值比值均在0.99到1之间，证明RBE4作为内标基因在实时荧光定量PCR检测中具有很好的效果。

RBE4的检测限和定量限分别为5个拷贝和15个拷贝，克螟稻2号的检测限和定量限分别为5个拷贝和15个拷贝，证明两个基因的检测灵敏度都很高。

④转基因克螟稻2号与非转基因受体水稻核酸提取效率比较

本发明还建立了一种方法，用于修正转基因检测值与真实值间的偏差。

本发明人发现，受体水稻秀水11在插入外源基因Cry1Ab所形成的转基因克螟稻2号的基因组在提取时会受到影响，测得的外源基因DNA浓度低于其真实浓度，导致转基因成分的检测值(即外源基因拷贝数/内标准基因的拷贝数分数)低于其实际值。

因此为了使检测结果接近于真实情况，需要建立一种校正方法。

欧盟IRMM的转基因植物标准物质研制中首先要将转基因植物与其受体植物的种子粉末的分别提取其核酸。

本发明先是发现两种植物种子粉末的核酸浓度的比值可作为校正系数，可以得到与质量配比值接近的校正值。

但考虑到每次称量粉末的质量和提取的核酸体积都有可能不同或差异，单纯用核酸浓度进行比较，可能有失偏颇。

为了使这个值显得更加准确，本发明人经研究后，又发现用提取效率这个概念来替代核酸浓度，所以用核酸浓度乘以其核酸体积再除以称量粉末质量得到了该植物种子粉末的核酸提取效率，然后将转基因植物的核酸提取效率与非转基因植物的核酸提取效率进行比较，来看其核酸提取效率的比较，由于质量分数(质量配比值)是以粉末的质量为特性量值，而PCR反应是以核酸的拷贝数作为特性量值，核酸又与其提取效率有密切相关，所以该值可以作为校正测定值的校正系数。

本发明建立了一种方法，可以测算出转基因检测值与真实值的校正系数，步骤如下：

1)精确称取转基因生物与受体非转基因生物样品各一份；

2)分别提取转基因生物与受体非转基因生物基因组DNA，分别测定其DNA浓度，并分别测定所提取DNA的体积；

3)按照下列公式，分别计算转基因生物与受体非转基因生物的核酸提取效率E

4)按下列公式计算校正系数C：

式中，E(transgene)为转基因生物核酸提取效率，E(receptor)为受体非转基因生物核酸提取效率；

5)按下列公式计算转基因生物样品转基因成分的含量

转基因成分的含量＝转基因成分的检测值÷C

为了计算结果更加准确可靠，最好应重复进行测量，即在步骤1)中分别称取多份样品，并分别进行上述步骤2)～步骤4)，得到每份样品的校正系数C；然后计算所有样品校正系数C的算术平均值。

重复次数越多，所得计算结果越准确，但检测成本和时间越长，通常应重复5～10次。

在本发明的实例中，所得到的转基因水稻克螟稻2号的校正系数C是经过10次重复实验后所获得的。每次实验中，每份样品称取了100mg。测算出了转基因水稻克螟稻2号与受体水稻秀水11的校正系数为22.7％。用此校正系数计算出了待测克螟稻2号样品中的转基因成分精确含量(见实施例)。

根据上述本发明建立的检测方法，本发明还提供了一种转基因水稻克螟稻2号核酸定量检测试剂盒，所述试剂盒中除常规的荧光定量PCR应有的试剂、PCR酶预混液外，还含有以下成分：

内标准基因RBE4的上游引物、下游引物、探针；外源基因克螟稻2号的上游引物、下游引物、探针；具体详见表1。

质控品(为含量1％和5％的转基因水稻克螟稻2号种子粉末标准物质)

标准品：为含有不同浓度的克螟稻2号和RBE4基因片段的质粒分子标准物质，数量为3～8个；

尽管检测精度与标准品数量成正比，但检测成本也与标准品数量成正比。本发明人经实验证明，标准品优选数量是4～6个

在本发明一个实例中，用了5种不同浓度的标准品(分别含有10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²copy/ml的克螟稻2号和RBE4基因片段)。

表1转基因水稻克螟稻2号(KMD2)定量检测用内标准基因和外源基因探针序列

注：表中FAM为探针的发光基团，BHQ1和MGBNFQ为探针的淬灭基团。

用本发明的试剂盒进行转基因水稻克螟稻2号核酸定量检测的操作方法，其特征为：

1、精确称取质控品和待测样品；

为保证称量精确，应使用经过校准的天平；通常，称取质控品和待测样品各100mg。

2、分别提取质控品和待测样品的基因组DNA，所得DNA纯度应为A₂₆₀1.8～2.0，且浓度大于20ng/μL。

其中，提取DNA可按现有技术方法，比如，可采用植物基因组提取试剂盒

Genomic DNA Purification Kit(美国普罗麦格公司)，提取步骤按照该产品的说明书进行操作。

测定DNA纯度可采用现有技术方法或产品，如用PicoGreen试剂盒进行测定；

3、将表1所述RBE4内标引物对和探针及克螟稻2号外源引物对和探针用去离子水溶解配制成浓度为10μM的工作液；

4、将每个标准品、质控品DNA和待测样品DNA分别进行荧光定量PCR扩增，所述标准品如权利要求1所述；

5、按照表3所示PCR程序设置进行荧光定量PCR检测，根据每个标准品的所示浓度和测得的Ct值可以得出内标准基因和外源基因的标准曲线，以及待测样品DNA和质控品DNA的内标准基因和外源基因的Ct值，根据标准曲线计算得出待测样品和质控品的内标准基因和外源基因的拷贝数及其比值，从而得出待测样品和质控品中转基因水稻克螟稻2号的精确含量，通过使用质控品监控整个实验流程和确保实验数据的准确和可靠。

步骤4中，按照表2中所示，配制内标准基因和外源基因的PCR体系，DNA模板分别是5个标准品、待测样品DNA和质控品DNA；荧光定量PCR反应程序按表3进行；

步骤4中，每个样品做三个重复试验；

步骤5中，根据外源基因和内标准基因的标准曲线的方程分别计算外源基因和内标准基因的拷贝数，最后计算外源基因拷贝数/内标准基因拷贝数的比值，得出定量检测结果。

表2内标准基因和外源基因PCR体系

表中所述PCR酶预混液可以选用市售品，如Taqman gene expression PCR mastermix(Life Technology公司)等。

表3荧光定量PCR反应程序

本发明的检测方法用植物基因组提取试剂盒提取转基因水稻克螟稻2号或其制品的基因组DNA为基础，水稻内标准基因RBE4上下游引物和探针用来定量检测内标准基因的Ct值、外源基因克螟稻2号上下游引物和探针用来定量检测外源基因Ct值，并通过转基因水稻克螟稻2号基因组DNA进行系列稀释建立的标准曲线分别计算得出外源基因和内标准基因拷贝数，可以快速、准确地得到转基因水稻克螟稻2号或其制品中转基因成分的精确含量。

经实验证实本方法不仅可定性检测待测样品中转基因水稻克螟稻2号成分的是否存在，还可以定量检测出转基因成分的精确含量(见实施例1)。

本发明具有以下创新和优点：

1、通过对现有常用的水稻内标准基因进行筛选，从中找到了效果最好的适合转基因水稻克螟稻2号检测的内标准基因RBE4；

2、通过对实时荧光定量PCR体系的优化，找到了适合转基因水稻克螟稻2号或其制品定量检测最佳的PCR体系。

3、检测试剂盒中附带有制作标准曲线和质控品的标准物质，可以消除样本间的差异干扰数据分析，最大程度保证定量检测精确度和准确度。突破了以往转基因植物定量检测的精确度低和不确定度大的缺点，可以确保检测结果的准确性和可溯源性。

4、灵敏度高

最低可以定检测到5拷贝的内标准基因和外源基因，并能定量检测到15拷贝的内标准基因和10拷贝的外源基因。

5、特异性强

选取了国内和国外具有代表性的其他抗虫性水稻引物和抗除草性的转基因水稻引物(克螟稻1号、克螟稻2号、科丰6号、LLRICE601、LLRICE62)。以克螟稻2号的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，结果发现只有克螟稻2号引物可以扩增出特异性条带。

6、重复性好

从实施例给出的实验结果可证实，以5个梯度稀释的基体DNA为样本，每个样本分别进行6次重复实验，组内组间差异无显著性(p＜0.05)。

附图说明：

图1是五种不同候选内标准基因产物和外源基因克螟稻2号产物的电泳图；

其中，泳道M为最大分子量为2000bp的DNA标记物，泳道1为外源引物克螟稻2号产物，泳道2-6为五种候选内标引物产物，依次分别为GOS、PLD、RBE4、SPS、UBQ5；

图2和图3分别是外源基因克螟稻2号和内标准基因RBE4的标准曲线(其中图中的横坐标是模板起始拷贝数(浓度)的对数，纵坐标是Ct值)；

图4是标准品的内标准基因RBE4标准曲线；

图5是标准品的外源基因克螟稻2号标准曲线。

具体实施方式

实施例1转基因水稻克螟稻2号检测用内标准基因的筛选和荧光定量PCR反应体系的优化

一、材料与方法

1.100％转基因水稻克螟稻2号水稻种子粉(来自中国计量科学研究院)

2.合成GOS9、PLD、SPS、RBE4和UBQ5共5种水稻内标基因的引物(序列信息来源于Jeong S-C等发表在Food Control杂志18卷：1434-1442页的文章《Molecular analysisand quantitative detection of a transgenic rice line expressing a bifunctional fusion TPSP》及外源基因克螟稻2号的引物(由中国计量学院提供)见表4。

3.以提取的克螟稻2号DNA为模板，分别使用5个水稻内标准基因引物和外源基因克螟稻2号引物进行PCR反应，设定体系为：TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5ul，上游引物(400nM)1ul，下游引物(400nM)1ul，克螟稻2号基因组DNA 5ul，去离子水补足25ul体系。PCR反应程序：第一步95℃5分钟；第二步40个循环95℃15秒，55℃30秒，72℃60秒；第三步72℃10分钟。PCR产物进行电泳分析(图1)。

4.合成选择的内标准基因和外源基因的探针(表1)，并进行PCR体系优化，按照定量PCR扩增体系：第一步95℃5分钟；第二步45个循环95℃15秒，60℃60秒；第三步50℃10分钟。得到适合内标准基因和外源基因扩增的最佳条件。

5.PCR酶预混液(Taqman gene expression PCR mastermix)购自Life Technology公司。

表4转基因水稻检测用内标准基因和外源基因引物序列信息

5.将提取的转基因水稻克螟稻2号基因组DNA进行系列稀释后作为模板，分别进行内标准基因RBE4和外源基因克螟稻2号的荧光定量PCR扩增，将每个稀释梯度浓度的模板所扩增的RBE4和克螟稻2号基因扩增的Ct值进行比较。以下表5～7是选择内标准基因和验证实验流程稳定性的数据。

表5转基因水稻克螟稻2号不同浓度模板时外源基因Ct值

表6转基因水稻克螟稻2号不同浓度模板时内标准基因Ct值

根据表5、表6的外源基因和内标准基因Ct值的平均值，可分别计算出转基因水稻克螟稻2号各种不同浓度模板时内外源Ct值比值关系，见表7：

表7转基因水稻克螟稻2号不同浓度模板时内外源Ct值比值

模板(拷贝数/ul)	内外源Ct值比值
		112636	0.99
11272	1.00
		2255	0.99
452	0.99

90	0.99
		23	0.99
4	1

二、实验结果

1.水稻内标准基因的筛选

以纯阳水稻克螟稻2号基因组为模板，用五种候选内标准基因引物和外源基因克螟稻2号引物进行定性PCR扩增，其扩增结果分别与各自的外源引物扩增结果进行比较。

从电泳图中可以看出五个内标基因产物与外源基因克螟稻2号产物条带清晰单一，说明它们的扩增都具有很好的特异性。

从图1中可以看出，RBE4内标引物扩增产物的条带亮度和克螟稻2号外源引物扩增产物的条带亮度最接近。表明在转基因水稻克螟稻2号的检测中内标基因的RBE4扩增效果最佳。

2.荧光定量PCR反应体系的优化

调整PCR扩增体系中的引物、探针和DNA模板使用量，得到最优化的反应体系。

RBE4的反应体系：PCR酶预混液12.5ul，上游引物(400nM)1ul，下游引物(400nM)1ul，探针(200nM)0.5ul，克螟稻2号基因组DNA 5ul，去离子水补足25ul体系。克螟稻2号的反应体系：PCR酶预混液12.5ul，上游引物(400nM)1ul，下游引物(400nM)1ul，探针(200nM)0.5ul，克螟稻2号基因组DNA 5ul，去离子水补足25ul体系。

3.标准曲线的绘制和体系稳定性

提取好的转基因水稻基因组DNA用Picogreen测定其浓度，然后按照梯度进行系列稀释，通过实时荧光定量PCR做标准曲线，来验证内标准基因和外源基因在模板拷贝数和Ct值间是否具有良好的线性关系，且内标准基因和外源基因在模板浓度相同时Ct值是否一致。其定量体系是否合适于样品的定量检测。根据实时荧光定量PCR得到的Ct值与对应模板浓度的关系，绘制两个基因的标准曲线(图2、图3)。

实验结果显示：转基因水稻克螟稻2号的内标基因RBE4和外源基因克螟稻2号扩增曲线效果很好，其内标基因RBE4标准曲线的R2为0.9931、斜率为-3.3915，其扩增效率为97％；

外源基因扩增曲线效果也很好，标准曲线的R²为0.9941，斜率为-3.3764，其扩增效率为98％。

结果表明：内标准基因和外源基因的扩增效果和稳定性良好，适合于转基因水稻克螟稻2号的定量检测。

实施例2水稻粉末中转基因克螟稻2号成分的定量检测

一、材料与方法

1.待测样品为质量分数2％含量的转基因水稻克螟稻2号水稻种子粉标准物质(中国计量科学研究院研制)

2.用天平精确称量待测样品和质控品(质量分数1％和5％含量的转基因水稻克螟稻2号水稻种子粉标准物质)

3.使用植物基因组提取试剂盒

Genomic DNA Purification Kit(美国普罗麦格公司)提取待测样品和质控品的基因组DNA，并用紫外分光光度计和Picogreen试剂盒分别测定所提DNA的纯度和浓度。

4.将标准品(含有约10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²copy/ml的克螟稻2号和RBE4基因片段的质粒分子标准物质)和待测样品DNA及质控品DNA作为模板，按照表1进行PCR体系的配制，然后分别进行内标准基因RBE4和外源基因克螟稻2号的荧光定量PCR扩增。

二、实验结果

1.标准品和待测样品的内标准基因和外源基因的Ct值见表8和表9。

表8标准品作为标准曲线的内标准基因和外源基因的Ct值

表9待测样品基因组DNA经PCR扩增后的Ct值

2.待测样品的定量检测结果

通过标准品所做标准曲线对待测样品进行定量。结果表明，待测样品的浓度在标准曲线的线性范围内，能够较好地测定目标样品中的外源基因含量比，结果见图4和图5，其中图中的横坐标是模板起始浓度的对数，纵坐标是Ct值。由表7和图4可知，根据公式一：y＝-3.337x+40.77，可以算出待测样品的内标准基因浓度为44759copy/ul。由表7和图5可知，根据公式二：y＝-3.294x+40.434，可以算出待测样品的外源基因浓度为186copy/ul。由公式三：待测样品外源基因含量比＝(外源基因浓度/内标准基因浓度)*100％可知，待测样品外源基因含量比为0.42％±0.04％。

3.校正系数的测定和计算

将转基因水稻克螟稻2号和非转基因水稻秀水11DNA提取效率进行比较。

方法：

1)分别用天平精确称量转基因生物与受体非转基因生物样品各10份，每份100mg。

2)使用植物基因组提取试剂盒

Genomic DNA Purification Kit(美国普罗麦格公司)分别提取每份转基因生物与受体非转基因生物样品的基因组DNA，并用PicoGreen试剂盒测定其DNA浓度；

3)分别按照下列公式计算每份样品基因组DNA提取效率：

4)分别按照下列公式计算每次实验的校正系数C：

上式中，校正系数是转基因/非转基因水稻DNA提取效率比(％)。

结果：

按上述方法，本发明重复进行了10次，得到了10个转基因水稻克螟稻2号与受体水稻秀水11的校正系数，并计算出了这10个校正系数的算术平均值，为22.7％(详见下表)。

表10校正系数的测定

4.待测转基因克螟稻2号样品基因含量测定值计算

将步骤2中经标准曲线所得的样品定量的检测值除以步骤3所得的校正系数，得到样品的基因含量为

(0.42％±0.04％)÷22.7％＝1.85％±0.19％。

即，使用转基因克螟稻2号水稻和非转基因受体水稻秀水11种子粉末的核酸提取效率比值进行校正后，多次重复的待测样品基因含量为1.85％±0.19％，即范围为1.66％～2.04％。

该方法的相对标准偏差是10％，证明精确度较好。

Claims (10)

1.一种转基因水稻克螟稻2号核酸定量检测试剂盒，试剂盒中包括荧光定量PCR试剂、PCR酶预混液，其特征是还含有以下成分：

内标准基因RBE4的上游引物、下游引物、探针，序列分别是SEQ ID NO：1～SEQ IDNO：3

外源基因克螟稻2号的上游引物、下游引物、探针，序列分别是SEQ ID NO：4～SEQID NO：6；

标准品，为含有不同浓度的克螟稻2号和RBE4基因片段的质粒分子标准物质，数量为3～8个。

2.权利要求1所述的试剂盒，还含有质控品，为含量1％和5％的转基因水稻克螟稻2号种子粉末标准物质；且所述标准品的数量为4～6个。

3.权利要求2所述的试剂盒，所述标准品的数量为5个，克螟稻2号和RBE4基因片段的浓度分别为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²copy/ml。

4.一种转基因水稻克螟稻2号核酸定量检测方法，其特征为：

1)精确称取质控品和待测样品，所述质控品如权利要求1所述；

2)分别提取质控品和待测样品的基因组DNA，所得DNA纯度应为A₂₆₀1.8～2.0，且浓度大于20ng/μL；

3)分别将内标准基因RBE4的上游引物、下游引物、探针、外源基因克螟稻2号的上游引物、下游引物、探针用去离子水溶解配制成浓度为10μM的工作液；

4)将每个标准品、质控品DNA和待测样品DNA分别进行荧光定量PCR扩增，所述标准品如权利要求1所述；

5)进行荧光定量PCR检测，根据标准品的不同所示浓度和测得的Ct值绘制内标准基因和外源基因的标准曲线，通过该标准曲线对待测样品进行定量。

5.权利要求4所述的检测方法，所述荧光定量PCR扩增中所用的PCR反应体系如下：

RBE4的反应体系：PCR酶预混液12.5μl，上游引物(400nM)0.5μl，下游引物(400nM)0.5μl，探针(200nM)0.25μl，克螟稻2号基因组DNA 5μl，去离子水补足25μl体系；

克螟稻2号的反应体系：PCR酶预混液12.5μl，上游引物(400nM)1μl，下游引物(400nM)1μl，探针(200nM)0.5μl，克螟稻2号基因组DNA 5ul，去离子水补足25μl体系。

6.权利要求4所述的检测方法，所述荧光定量PCR扩增中反应程序为：第一步94℃5分钟；第二步45个循环94℃15秒，60℃60秒。

7.权利要求4所述的检测方法，所述通过该标准曲线对待测样品进行定量，是根据外源基因和内标准基因的标准曲线的方程分别计算外源基因和内标准基因的拷贝数，然后计算外源基因拷贝数/内标准基因拷贝数，再除以校正系数C得出定量检测结果；所述校正系数C是22.7％。

8.RBE4在转基因水稻克螟稻2号定量检测中作为内标准基因的应用。

9.一种在转基因生物定量检测中修正检测值与真实值偏差的方法，其步骤如下：

1)精确称取转基因生物与受体非转基因生物样品各一份；

2)分别提取转基因生物与受体非转基因生物基因组DNA，分别测定DNA浓度，

并分别测定所提取DNA的体积；

3)按照下列公式，分别计算转基因生物与受体非转基因生物的核酸提取效率E

4)按下列公式计算校正系数C：

$C=\frac{E\left(\mathrm{transgene}\right)}{E\left(\mathrm{receptor}\right)}$

式中，E(transgene)为转基因生物核酸提取效率，E(receptor)为受体非转基因生物核酸提取效率；

5)用转基因成分的检测值除以校正系数C，得到转基因成分的含量。

10.权利要求9所述的方法，步骤1～步骤4重复进行多次，每次得到一个校正系数C；然后求出所有校正系数C的算术平均值；重复次数为5～10次。

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