CN108103220A - 一种高通量的转基因元件筛选检测的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于KASP(竞争性等位基因PCR)技术的高通量转基因元件筛选检测的方法，所述检测方法包括如下步骤：(1)设计转基因元件的引物及内源基因的引物；(2)提取样品的DNA；(3)利用上述转基因元件的引物、内源基因的引物、KASP反应液以及样品DNA，进行PCR反应，判断样品是否含有转基因元件。利用本方法对植物样品进行转基因元件筛选检测具有效率高、成本低、准确率高以及易于操作等优点。

Description

一种高通量的转基因元件筛选检测的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体的，涉及一种基于KASP(竞争性等位基因PCR)技术的高通量转基因元件筛选检测的方法。
背景技术：
对转基因作物及其产品的分子检测是转基因生物安全管理的基础。目前我们国家只批准一部分转基因棉花、杨树、木瓜的种植。对农作物进行常态化的转基因元件筛选检测，有利于我们国家相关部门对转基因作物的种植进行有效的监管。
转基因元件的筛选检测主要是针对包括启动子、终止子、筛选标记基因等转基因元件的检测。目前常用的转基因作物的检测方法有基于样品DNA的检测方法以及基于样品蛋白质的检测方法，但这些方法均存在不足与缺陷。基于样品DNA有普通PCR和荧光定量PCR，前者需要电泳以及紫外观察的过程，操作繁琐，耗时长，难以实现高通量检测；后者的检测费用昂贵，特别是检测过程中需要使用基因特异性探针，成本很高。而且这两种方法的自动化程度不高，单位时间内能检测的样本数量有限，而且手工操作容易导致实验误差和实验污染。基于样品蛋白质的检测方法包括酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linkedimmuNOSorbent assay,ELISA)和基于双抗体夹心免疫层析原理的转基因快速检测试纸条，这两种方法的缺陷在于他们无法区分表达相似蛋白的转基因品系,无法检测蛋白已经变性的样品，也无法检测不编码蛋白的转基因元件比如启动子或终止子，另外抗体的研发以及实验体系的建立比较复杂，造成前期的成本高。总之，依靠上述常规的方法，很难实现对作物进行高通量的转基因元件筛选检测。
因此，亟需开发一种高通量、低成本、简单快捷以及低错误率的转基因元件筛选检测方法。KASP(竞争性等位基因PCR)是一种基于荧光检测的基因分型技术。进行检测的时候，每个反应孔采用双色荧光(一般是FAM荧光和HEX荧光)检测一个样本的某一位点可能的两种基因型。该技术现阶段主要被应用于SNP基因分型研究中，成为分子辅助育种、性状基因的精细定位、以及种子资源鉴定的主要技术手段。
然而，目前尚未见利用KASP技术对作物进行高通量转基因元件筛选检测的报道。
发明内容：
有鉴于此，提出本发明。
本申请要求2016年12月30日提交的中国专利申请CN201611260141.2的优先权，其全部内容通过引用方式并入本文。
KASP技术被研究者广泛应用于SNP基因分型等的研究中，通过对一段含有SNP位点的基因序列设计不同引物来进行SNP分型，而并未见将KASP技术应用于转基因元件筛选检测的报道。本发明的发明人通过将两组引物分别设计为内源基因引物和转基因元件引物，来检测样品是否含有转基因成分，进而提高了转基因筛选检测的效率。
与KASP技术应用于SNP分型不同，将KASP应用于转基因元件检测时需要针对两个不同的基因进行引物的设计，如何保证两个基因的引物之间没有互相干扰成为本应用的一个难点。另外在进行大批量样品检测的时候，如何准确地转基因元件阳性样品和阴性样品也是本应用的一个难点。
本发明中，发明人经大量尝试，确定了主要农作物的内源基因和常用转基因元件引物的优良组合。通过该发明的方法,不仅可以检测样品是否含有转基因元件，同时可以验证该反应是否正确进行(如果没有内源基因的检测信号，则证明此次反应没有正确进行)，显著提高了对转基因元件的检测效率。
具体的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了KASP技术在检测转基因产品上的应用。具体的，通过检测待测产品基因中是否含有转基因元件来判断其是否为转基因产品。
另一方面，本发明提供了一种高通量的转基因元件筛选检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：(1)设计转基因元件的引物及设计内源基因的引物；(2)提取样品的DNA；(3)利用上述转基因元件的引物、内源基因的引物、KASP反应液以及样品DNA，进行PCR反应，判断样品是否含有转基因元件。
具体的，步骤(1)中的转基因元件引物为表1中引物组1-5中的一组或多组。
表1：转基因元件的引物
具体的，步骤(1)中的内源基因引物为表2中引物组6-10中的一组或多组。内源基因的选择很重要，本发明中，选择了物种特异性的内源基因序列进行引物设计。
表2：内源基因的引物
具体的，步骤(2)采用TPS或者CTAB的方法提取待测样品的DNA。
具体的，步骤(3)中，所述转基因元件的引物、内源基因的引物分别添加不同的标签序列。优选的，转基因元件的引物的5'端添加FAM标签序列(GAAGGTGACCAAGTTCATGCT)，内源基因正向引物的5'端添加HEX标签序列(GAAGGTCGGAGTCAACGGATT)。
步骤(3)中所述的KASP反应液为KASP Master Mix，所述KASP Master Mix可以通过商业途径购买到，其主要成分是FAM、HEX荧光染料、淬灭基团、高保真的Taq酶、dNTP以及缓冲液。
步骤(3)中，进行PCR反应的具体步骤为：将添加了标签序列转基因元件的引物和内源基因引物、DNA模板以及KASP Master Mix按照一定比例混合构建KASP反应体系(表3)，然后在Hydrocycler中进行反应。
优选的，采用转基因作物DNA、非转基因作物的DNA、以及含转基因元件的大肠杆菌质粒作为对照样品使用。
表3：PCR反应体系的构建
判断样品中是否含有转基因元件的方法如下所述：反应完毕之后对产物进行荧光的扫描，获得每一个样品产物的FAM和HEX荧光值，仪器的系统会对这些荧光值自动进行处理并且生成散点图。其中横坐标是代表是这个样品PCR反应产物的FAM荧光值，纵坐标代表的它的HEX荧光值。根据产物所释放的荧光种类对样品是否含有转基因元件进行判定。反应体系中同时加入了转基因元件和植物内源基因各一对引物，转基因元件引物连接FAM标签序列,植物内源基因引物连接HEX标签,因此如果该转基因元件扩增出来，产物会释放FAM荧光；如果植物内源基因扩增出来，产物会释放HEX荧光；如果该转基因元件和内源基因扩增出来，产物会释放FAM和HEX两种荧光。根据上述原理,如果从某样品产物中同时检测到显著的FAM荧光和HEX荧光，则判定样品为含有该转基因元件的植物；如果从某样品产物中仅能检测到显著的HEX荧光，则判定样品为不含有该转基因元件的植物；如果从样品中检测不到显著的FAM荧光和HEX荧光，表明样品在DNA提取或者KASP反应体系构建过程中出现了问题，需要重新检测其基因型。
另一方面，本发明提供了如下所示的引物序列组合，所述序列组合包含至少一种转基因元件引物及至少一种内源基因引物。我们设计并且优化了CaMV35S启动子、NOS终止子、Bar、HPT(潮霉素)等4个转基因元件和玉米zSSIIb、玉米Zein、水稻SPS、油菜CruA、大豆lectin等5个内源基因的引物，可以高效和准确地检测上述作物的样品是否含有常见的转基因成分。
另一方面，本发明还提供一种转基因产品检测试剂盒，包括引物组1-5的一组或多组引物，及引物组6-10的一组或多组引物。
本发明中，对五种常见转基因作物中，常见的四种转基因元件进行检测，以判断待测样品中是否含有转基因成分，其检测方法稳定，准确率高。可以预见，对于不同的物种或转基因元件，只需要重新设计引物而不需要对整套检测方法进行更改，即可准确高效的检测待测样品中的转基因元件，达到相似的技术效果。
通过上述KASP技术进行转基因元件的检测，每天可以检测上千个样品，检测效率和成本远低于荧光定量PCR。该方法由于效率高、成本低、自动化程度高、准确性高，非常适合农业主管部分进行转基因抽查，同时也很适合育种公司在进行转基因回交育种时候检测目的基因是否成功导入受体材料。
本发明的有益效果为：
(1)高通量：荧光定量PCR技术要求对PCR反应每个循环的荧光进行实时检测，因此它的检测通量受到限制，一般只能达到96或者384个反应。本发明方法采取对产物的荧光进行终点法的检测，因此利用本发明方法结合配套的仪器进行转基因元件筛选检测时，检测通量高达5376个反应，所以本发明的方法的检测通量是荧光定量PCR的14～56倍。
(2)高效率：利用本发明的方法配套的设备进行PCR反应体系构建时实现半自动化操作，这样不仅能大幅度的节省人力和时间，而且能有效降低了出错的概率。
(3)低成本：利用本发明方法进行转基因筛选检测不需要合成特异性的探针，而荧光定量PCR需要针对待检测的基因合成特异性的探针，因此能大大地节省成本。
(4)准确度高：本发明的引物配对经过严格筛选，挑选出来合适的引物配对，引物之间互相影响的程度低，扩增效率高。利用本发明方法对已知基因型的样品进行检测，测试结果表明该方法的准确度很高；通过对含有不同比例转基因成分的样品测试，表明本发明方法的灵敏度能够充分满足检测的需求。
附图说明：
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1检测101份玉米样品否含有NOS终止子。阳性表示样品被检测出含有NOS终止子，阴性表示样品被检测出不含NOS终止子，NTC(反应中没有模板)为阴性对照，Plasmid(DNA模板为含有NOS终止子的质粒)为阳性对照。横坐标代表反应产物的FAM荧光值，纵坐标代表反应产物的的HEX荧光值；
图2引物组合的验证。图中正方形表示反应中没有模板，三角形表示模板是含有转基因元件的植物DNA，圆形表示模板是不含转基因元件的植物DNA，菱形表示模板是含有转基因元件的质粒；
图3利用本发明方法进行高通量的转基因检测。(A)利用KPM743检测油菜样品是否含有NOS终止子；(B)利用KPM119检测玉米样品是否含有NOS终止子(C)利用KPM588检测玉米样品是否含有35S启动子。图中正方形表示反应中没有模板，三角形表示模板是含有转基因元件的植物DNA，圆形表示模板是不含转基因元件的植物DNA，菱形表示模板是含有转基因元件的质粒；
图4利用本发明方法检测含有不同比例HPT成分的水稻样品。图中正方形表示反应中没有模板(NTC)，三角形表示模板是含有HPT的水稻DNA(GMO)，圆形表示模板是野生型水稻DNA(WT)，菱形表示模板是含有HPT的质粒(Plasmid)。图形百分数表示样品中HPT的含量。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的装置和方法的例子。
在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
应当理解，尽管在本发明可能采用术语第一、第二、第三等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如，在不脱离本发明范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。取决于语境，如在此所使用的词语“如果”可以被解释成为“在……时”或“当……时”或“响应于确定”。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1应用本发明的方法检测玉米样品是否含有NOS终止子转基因成分
1.DNA模板的准备
利用TPS或者CTAB的DNA提取方法，从101份玉米叶片提取DNA作为PCR反应的模板。同时准备对照的模板：阳性对照为含有NOS终止子转基因玉米和含有NOS终止子的质粒，阴性对照为非转基因玉米，空白对照为无菌超纯水。
2.引物的设计和合成
根据Genbank中基因片段的序列设计了NOS终止子(表1)和玉米内源基因zSSIIb特异性扩增引物(表2)。在NOS终止子正向引物的5'端添加FAM标签序列变成“GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGTGGTCCCAAAGATGGAC”；在zSSIIb正向引物的5'端添加HEX标签序列变成“GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATCTGCTCCGAAGCAAAGTC”。合成上述两个基因的引物。
3.反应体系的构建
利用LGC SNPLine仪器平台的replicator将DNA模板转移至384孔PCR反应板，植物样品的DNA模板量是60ng，质粒的模板量为10-3ng。然后将PCR反应板在2000rpm离心1分钟，之后将PCR反应板放在65℃温箱里烘干40分钟，之后取出反应板备用。
将KASP Master Mix、NOS终止子引物以及zSSIIb引物按表4所示的比例进行混合，其中KASP Master Mix从LGC公司购买，它含有FAM、HEX荧光染料、淬灭基团、高保真的Taq酶、dNTP以及缓冲液。
通过LGC SNPLine仪器平台的Meridian将表4的PCR反应混合液转移至到上述备用的PCR反应板。加样完成之后，反应板需要封膜和离心。
表4：PCR反应体系的构建
4.反应的进行
将加样完毕的PCR反应板放置于LGC SNPLine仪器平台的水浴PCR仪中进行PCR反应，反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个Touch Down循环(每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃)；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。
5.结果分析
反应结束后，利用LGC SNPLine仪器平台的Pherastar对PCR反应产物进行扫描，获得每一个样品产物的FAM和HEX荧光值，仪器的系统对这些荧光值自动进行处理并且生成散点图。根据散点图判断该样品是否含有的NOS终止子转基因成分：如果从某样品中能同时能检测到显著的FAM荧光和HEX荧光，则判定该样品为含有NOS终止子的玉米；如果从某样品中仅检测到显著的HEX荧光但没有检测到FAM荧光，则判定该样品为不含有NOS终止子的玉米；如果从样品中检测不到明显FAM荧光和HEX荧光，表明该样品在DNA提取或者KASP反应体系构建过程中出现了问题，需要重新检测其基因型。
根据本实验散点图的结果判定101份样品中54份样品含有NOS终止子，47份样品不含NOS终止子(图1)。为了验证该数据的准确性，采用TaqMan探针法荧光定量PCR(农业部1782号公告—2—2012)对样品进行了检测，两种方法检测结果一致。
实施例2引物的配对组合
利用本发明方法进行检测时，反应体系中加入了一对转基因元件引物和一对内源基因的引物，如何保证两个基因的引物之间没有互相干扰成为本应用的一个难点。通过实验，筛选出的一系列的引物配对(表5)。利用已知阴阳性样品对这些配对的引物进行验证。具体实验步骤如下：
(1)准备DNA模板:准备非转基因样品的DNA、含转基因元件的植物样品DNA、含转基因元件的大肠杆菌质粒DNA。
(2)构建反应体系:将转基因元件引物(正向引物的5'端添加FAM标签序列)、内源基因引物(正向引物的5'端添加HEX标签序列)、KASP Master Mix、以及DNA模板混合构建反应体系，植物样品的DNA模板量是30～60ng，质粒的模板量为10-3ng，反应板封膜之后按照本发明方法提供的条件进行反应。
(3)结果判定：反应完成之后进行荧光扫描，根据产物释放的荧光种类判断样品是否含有转基因元件。根据散点图发现，所有含转基因元件的植物样品DNA的PCR反应产物(三角形散点)释放出FAM和HEX荧光，所有非转基因样品DNA的PCR反应产物(圆形散点)的PCR反应产物释放出HEX荧光(图2)，检测结果跟样品本身的基因型信息完全吻合。
通过该实验发现表5中所有的引物组合均能准确地区分转基因样品和非转基因样品，证明我们筛选出来配对的引物相互之间的干扰很小、实验数据的准确可靠。
表5:转基因元件和内源基因的引物组合
实施例3利用本发明方法进行高通量检测的准确性。
利用本发明方法对大量样品进行检测时，在扫描结果散点图上清楚地区分阳性和阴性样品成为本应用的一个难点。为了确定利用本发明方法对大量样品进行高通量检测的效果，以表5的KPM743、KPM119、KPM588为例对384个已知阴阳性样品进行检测，将检测结果与样品本身的基因型行比较，验证该方法检测大批量样品的准确性。具体实验步骤如下：
(1)准备DNA模板:准备非转基因植物样品的DNA、含有35S启动子或者NOS终止子的植物样品的DNA、含转基因元件的大肠杆菌质粒。
(2)构建反应体系:将35S启动子或者NOS终止子(正向引物的5'端添加FAM标签序列)、内源基因引物(正向引物的5'端添加HEX标签序列)、KASP Master Mix、以及DNA模板混合构建反应体系，按照本发明方法提供的条件进行反应。
(3)结果判定：反应完成之后进行荧光扫描。反应完成之后进行荧光扫描，根据产物释放的荧光种类判断样品是否含有转基因元件。根据散点图发现，所有含转基因元件的植物样品DNA的PCR反应产物(三角形散点)释放出FAM和HEX荧光，所有非转基因样品DNA的PCR反应产物(圆形散点)的PCR反应产物释放出HEX荧光(图3)，检测结果跟样品本身的基因型信息完全吻合。
通过该实验发现利用本发明的方法得到的实验结果与样品本身的基因型信息完全一致。上述结果显示使用本发明方法进行高通量检测时的准确性很高。
实施例4对该方法灵敏度的测试
为了测试本发明方法的灵敏度，我们以HPT(潮霉素基因)为例，对含有不同比例HPT成分的样品进行检测。具体步骤如下：
(1)准备DNA模板:将相同浓度(10ng/UL)的转基因水稻(含HPT成分)的DNA和非转基因水稻(日本晴)的DNA以一定的比例进行混合，分别配制了含有100％、50％、25％、12.5％、6.25％、3.13％、1.56％、0.78％、0.39％、0.2％、0.1％、0.05％HPT成分的样品DNA。另外准备非转基因样品、含HPT基因的大肠杆菌质粒作为对照。
(2)构建反应体系:将KPM15引物组合、以及KASP反应液、DNA模板混合后构建反应体系。
(3)结果判定：反应完成之后进行荧光扫描，根据扫描结果(图4)确定样品是否含有35S启动子或者NOS终止子转基因元件成分。分析发现当样品含有0.39％以上的HPT成分时，利用本发明的方法能够准确地区分转基因样品和非转基因样品。该实验结果证明，本发明方法灵敏度较高，能够检测一定比例的混样。针对单株样品的检测，该发明方法比荧光定量PCR更具优势，它能够有效地避免由于微量转基因成分污染而造成的假阳性检测结果的情况。
应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.KASP在检测转基因产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品为玉米、水稻、油菜或大豆。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：通过KASP检测待测产品基因中是否含有转基因元件来判断待测产品是否为转基因产品。
4.一种检测作物中转基因元件的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：(1)设计转基因元件的引物及内源基因的引物；(2)提取样品的DNA；(3)利用上述转基因元件的引物、内源基因的引物、KASP反应液以及样品DNA，进行PCR反应，判断样品是否含有转基因元件。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，基因转化体的引物为引物组1-5(SEQ ID NO.1-10)中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，内源基因的引物为引物组6-10(SEQ ID NO.11-20)中的一种或多种。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述转基因元件的引物、内源基因的引物为添加了标签序列的转基因元件引物和内源基因引物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：转基因元件引物和内源基因引物添加不同的标签，所述标签为FAM标签、HEX标签中的一种。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，KASP反应液为KASP MasterMix。
10.一种转基因产品检测试剂盒，包括引物组1-5的一组或多组引物，及引物组6-10的一组或多组引物。
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