CN112063743A - 一种精准定量检测转基因耐除草剂大豆zh10-6的方法 - Google Patents

一种精准定量检测转基因耐除草剂大豆zh10-6的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种精准定量检测转基因耐除草剂大豆ZH10‑6的方法，它是采用一对特异性的引物、带有荧光标记的探针及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在PCR反应前由微滴发生器将PCR体系分配到足够小的反应单元中，实现每个反应单元只有单个模板分子，在60℃左右对核酸进行PCR扩增，再采用泊松分布原理，根据阳性微滴与阴性微滴数的比例计算目标分子拷贝数，实现绝对定量分析，无需标准品，无需构建标准曲线。其结果鉴定通过微滴读取器读取阳性微滴以及阴性微滴的个数，并以外源基因与内标准基因拷贝数浓度的比值计算样品的转基因含量和转化体拷贝数。本发明的检测方法具有精准定量、高特异性、高灵敏度、快速、简便等优点。

Description

一种精准定量检测转基因耐除草剂大豆ZH10-6的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，特别是涉及一种转基因产品的精准定量检测方法，具体说是一种基于数字PCR的转基因大豆ZH10-6精准定量检测方法，通过将体系溶液生成微滴，将PCR体系分配到足够小的反应单元中，实现每个反应单元只有单个模板分子，经PCR反应扩增后，由微滴读取器读取微滴并计算内外基因拷贝数浓度比值，实现精准定量检测转基因大豆ZH10-6的方法构建及其应用。
背景技术
转基因作物的发展突飞猛进，很多国家和地区均实施了标识管理措施，并设定了阈值。如欧盟等国实施强制性的转基因标签制度；美国和加拿大实施自愿性的转基因标签制度，我国目前对转基因产品实施强制标识制度，对转基因产品精准定量检测方法的研制至关重要。目前，转基因检测的方法主要是基于核酸检测的聚合酶链式反应（polymerasechain reaction，PCR）技术、核酸杂交技术和基因芯片技术；基于蛋白质检测的WesternBlot、酶联免疫吸附测定等。其中应用最广泛的是基于核酸检测的普通PCR方法和实时荧光PCR方法。我国已经研制了ZH10-6大豆的定性PCR检测方法标准，但是其数字PCR定量方法未见报道。相对于转基因成分定性PCR检测方法，定量PCR检测方法不仅可以检测产品含有的转基因成分，而且可以确定转基因成分的含量，更加有助于转基因产品的行政监管。
数字PCR（digital polymerase chain reaction，dPCR）是近年来在实时荧光PCR基础上发展起来的微量DNA分子定量检测新技术。dPCR是将PCR体系分配到足够小的反应单元中，实现每个反应单元只有单个模板分子进行PCR扩增，再采用泊松分布原理，根据阳性微滴与阴性微滴数的比例计算目标分子拷贝数，实现绝对定量。该方法降低了标准曲线对测量结果产生影响等问题，降低了基体效应，实现了PCR扩增的样品分离，消除了本底信号的影响，提高了低拷贝DNA的扩增灵敏度。相比实时荧光PCR，数字PCR 具有更好的测量独立性，且无需任何校准物，具有更高的特异性、灵敏度、精确性和稳定性。
转基因耐除草剂大豆ZH10-6是由中国农业科学院作物科学研究所研发的转G2- EPSPS基因和GAT基因耐除草剂大豆新品系。研发人采用农杆菌介导转化法，将整合有G2- EPSPS和GAT两个基因的独立表达载体DNA导入大豆受体中，通过多代筛选获得对草甘膦具有抗性的ZH10-6转化体，在我国具有重要产业化应用前景。本研究以ZH10-6转化体特异性序列为靶标，通过对引物探针浓度的优化确定了扩增体系，并对其特异性、灵敏度、准确度等进行测试，建立了微滴式数字PCR精准定量PCR检测方法，旨在为该转化体的安全评价、行政监管和知识产权保护提供重要的技术支撑。
发明内容
本发明克服了定性PCR检测转基因大豆ZH10-6技术只可定性无法定量的缺陷，提供一种精准定量检测转基因大豆ZH10-6的方法。本发明的目的是解决定量检测转基因大豆ZH10-6方法空缺的问题，具有快速、高效、精准定量检测等优势。
本发明的技术内容如下：
一种用于检测转基因大豆ZH10-6的特异性引物及探针，其特征在于包括ZH10-6后一个插入位点5’端外源基因侧翼序列：
正向引物序列：5’-GCGGTTTCTTCAAATCCTATGG-3’ SEQ ID NO:1
反向引物序列：5’-CGTTTCCCGCCTTCAGTTTA-3’ SEQ ID NO:2
探针序列：FAM-AATGCCACCTTCTGGCTCCTTCAAACAC-BHQ1 SEQ ID NO:3
内源基因Lectin基因序列：
正向引物序列：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’ SEQ ID NO:4
反向引物序列：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’ SEQ ID NO:5
探针序列：FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1；SEQ ID NO:6
本发明进一步公开了用于检测转基因大豆ZH10-6的特异性引物及探针精准定量检测转基因耐除草剂大豆ZH10-6的方法，其特征在于如下步骤：
（1）转化体特异性引物序列：
正向引物序列：5’-GCGGTTTCTTCAAATCCTATGG-3’,
反向引物序列：5’-CGTTTCCCGCCTTCAGTTTA-3’，
探针序列：FAM-AATGCCACCTTCTGGCTCCTTCAAACAC-BHQ1；
内参基因Lectin基因序列：
正向引物序列：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’，
反向引物序列：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’，
探针序列：FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1；
（2）PCR反应体系：总体积为20 μL，包括BIO-RAD ddPCR Supermix for Probes 10 μL，10 µmol/L上游引物1 μL，10 µmol/L下游引物1 μL，10 µmol/L探针1 μL，25 ng/μL DNA模板1 μL，最终用无菌水补充至20 μL；
（3）微滴生成：将20 μL反应体系小心转移至微卡发生器，避免产生气泡，同时与微卡发生器相应位置加入微滴生成油70 μL，盖上垫片，放入微滴生成器中生成微滴，微滴生成后用移液器倾斜30-45度吸取40 μL反应产物，小心转移至数字96孔反应板中，170℃热封膜；
（4）PCR反应程序：94 ℃预变性热激活10 min，1个循环；94 ℃变性30 s，60 ℃退火1min，40个循环；98℃酶失活10 min，1个循环；
（5）结果分析：微滴数字PCR仪自动计算每个反应的拷贝数浓度、总微滴数和阳性微滴数，总微滴数大于10000以上视为有效结果，按照公式A=B/C×100%，计算出试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列百分含量；公式中A为转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列百分含量，B为转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列的拷贝数浓度，C为内参基因Lectin基因的拷贝数浓度。
本发明更进一步公开了用于检测转基因大豆ZH10-6的特异性引物及探针在用于ZH10-6快速定量高效筛查方面的应用。实验结果显示本检测方法的引物特异性强、稳定性好、准确度和灵敏度高，可快捷简便高效的用于对转基因大豆ZH10-6品系成分的定量检测，并可为其他转基因大豆品系及其他转基因作物的微滴式数字PCR定量检测方法建立提供参考。
本发明主要考察了定量检测转基因大豆ZH10-6引物探针对转化体的特异性问题，重点是解决筛选合适的特异性引物对转基因大豆ZH10-6进行定量检测的问题，发明的难点在于转基因大豆ZH10-6拥有两个独立的插入位点，即有4个边界位置，选择合适的边界设计特异性引物探针用于转基因大豆的定量检测，本发明的创新点在于首次建立了精准定量检测转基因大豆ZH10-6的数字PCR方法，为基于转基因大豆ZH10-6转化体的定量检测提供了可靠的技术手段。
本发明试验效果如下：
（1）以转基因玉米混合样、转基因大豆混合样、转基因油菜混合样、转基因水稻混合样、转基因棉花混合样和非转基因大豆的基因组DNA为模板，进行微滴式数字PCR扩增。结果见图1，只有以转基因耐除草剂大豆ZH10-6基因组DNA为模板时生成有阳性微滴，而以其他转基因作物和非转基因大豆基因组DNA为模板时，没有检测到阳性微滴生成，表明本检测方法的特异性良好。
（2）将提取的转基因耐除草剂大豆ZH10-6的基因组DNA（100%，170 ng/μL）稀释至50%、10%、2%、0.4%、0.08%、0.016% 共7个浓度梯度，分别进行大豆内源Lectin和转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列的微滴式数字PCR扩增（以体系中所含DNA量/μL为横坐标，以目标序列的拷贝数/μL为纵坐标绘制标准曲线（图2；图3），结果显示大豆内源基因Lectin和转基因耐除草剂大豆ZH10-6特异性序列标准曲线的相关系数R2均大于0.99。并确定了本数字PCR定量检测方法定量检测下限为0.136 ng/μL，检出限为0.0272 ng/μL。
（3）计算试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列含量
将转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列的拷贝数浓度和内源基因Lectin的拷贝数浓度带入公式，计算出试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列百分含量。计算试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列百分含量的公式：
A=B/C×100%，
式中：
A—试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列的百分含量(%)；
B—转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列的拷贝数浓度；
C—Lectin内源基因的拷贝数浓度；
试验结论：
本研究建立了微滴式数字PCR精准定量检测转基因大豆ZH10-6的方法。该方法以转基因耐除草剂大豆ZH10-6的5’端边界序列为定量靶序列，设计了PCR扩增引物和TaqMan探针，并对引物探针浓度进行优化，建立了微滴式数字PCR定量检测体系。特异性实验结果显示只有以转基因耐除草剂大豆ZH10-6基因组为模板才有扩增信号；灵敏度、线性和准确性测试结果显示，在相对标准偏差≤25%的情况下，本方法的检出限（LOD）为0.0272 ng/μL；定量限（LOQ）为0.136 ng/μL，即在20 μL的体系中最低可稳定定量5个拷贝的转基因大豆ZH10-6特异性序列分子；PCR扩增反应模板含量与样品拷贝数之间线性相关系数R2≥0.998。结果表明本研究建立的转基因大豆ZH10-6转化体定量方法特异性强、稳定性好、准确度和灵敏度高，可快捷简便高效的用于对转基因大豆ZH10-6品系成分的定量检测，并可为其他转基因大豆品系及其他转基因作物的微滴式数字PCR定量检测方法建立提供参考。
附图说明
图1：微滴式数字PCR特异性检测结果；如图标注：B06-C06，阳性对照；E06-F06，转基因耐除草剂大豆ZH10-6；G06-H06，非转基因大豆样品；B07-C07，转基因玉米混样；E07-F07，其它转基因大豆混样；G07-H07，转基因油菜混样；B08-C08，转基因水稻混样；E08-F08，转基因棉花混样；G08-H08，阴性对照；
图2：数字PCR内源Lectin基因定量线性范围PCR扩增结果；
图3：数字PCR转化体ZH10-6特异性序列定量线性范围PCR扩增结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
实施例1
（1）样品1：转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列成分为50%的自制模拟混合样品，混合方式50g转基因大豆ZH10-6粉末+50g非转基因大豆受体ZH10粉末。
（2）试剂：BIO-RAD ddPCR Supermix for Probes预混液；上海生工合成的大豆内源Lectin基因和转化体特异性序列扩增引物。
转化体特异性序列：
正向引物序列：5’-GCGGTTTCTTCAAATCCTATGG-3’
反向引物序列：5’-CGTTTCCCGCCTTCAGTTTA-3’
探针序列：FAM-AATGCCACCTTCTGGCTCCTTCAAACAC-BHQ1；
内源基因Lectin基因序列：
正向引物序列：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’
反向引物序列：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’
探针序列：FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1；
（3）PCR反应体系：总体积为20 μL，包括BIO-RAD ddPCR Supermix for Probes 10 μL，上游引物（10 µmol/L）1 μL，下游引物（10 µmol/L）1 μL，探针（10 µmol/L）1 μL，DNA模板（25 ng/μL）1 μL，最终用无菌水补充至20 μL。
（4）微滴生成：将20 μL反应体系小心转移至微卡发生器，避免产生气泡，同时与微卡发生器相应位置加入微滴生成油70 μL，盖上垫片，放入微滴生成器中生成微滴，微滴生成后用移液器倾斜30-45度吸取40 μL反应产物，小心转移至数字96孔反应板中，170℃热封膜；
（5）PCR反应程序：94 ℃预变性热激活10 min，1个循环；94 ℃变性30 s，60 ℃退火1min，40个循环；98℃酶失活10 min，1个循环。
（6）微滴数字PCR仪自动计算每个反应的拷贝数浓度、总微滴数和阳性微滴数，总微滴数大于10000以上视为有效结果。按照公式A=B/C×100%，计算出试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列百分含量。将转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列的拷贝数浓度和内源基因Lectin的拷贝数浓度带入公式，
结果见表1，计算出试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列百分含量为51.22%。
式中：
A—试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列的百分含量(%)；
B—转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列的拷贝数浓度；
C—Lectin内源基因的拷贝数浓度；
表1 盲样1测试结果
Figure 266408DEST_PATH_IMAGE001
实施例2
（1）样品2：转基因耐除草剂大豆ZH10-6三个世代的大豆样品。
（2）试剂：BIO-RAD ddPCR Supermix for Probes预混液；上海生工合成的大豆内源Lectin基因和转化体特异性序列扩增引物。
转化体特异性序列：
正向引物序列：5’-GCGGTTTCTTCAAATCCTATGG-3’
反向引物序列：5’-CGTTTCCCGCCTTCAGTTTA-3’
探针序列：FAM-AATGCCACCTTCTGGCTCCTTCAAACAC-BHQ1；
内源基因Lectin基因序列：
正向引物序列：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’
反向引物序列：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’
探针序列：FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1；
（3）PCR反应体系：总体积为20 μL，包括BIO-RAD ddPCR Supermix for Probes 10 μL，上游引物（10 µmol/L）1 μL，下游引物（10 µmol/L）1 μL，探针（10 µmol/L）1 μL，DNA模板（25 ng/μL）1 μL，最终用无菌水补充至20 μL。
（4）微滴生成：将20 μL反应体系小心转移至微卡发生器，避免产生气泡，同时与微卡发生器相应位置加入微滴生成油70 μL，盖上垫片，放入微滴生成器中生成微滴，微滴生成后用移液器倾斜30-45度吸取40 μL反应产物，小心转移至数字96孔反应板中，170℃热封膜；
（5）PCR反应程序：94 ℃预变性热激活10 min，1个循环；94 ℃变性30 s，60 ℃退火1min，40个循环；98℃酶失活10 min，1个循环。
（6）PCR扩增后进行微滴读取，结果表明：应用微滴式数字PCR方法在转基因大豆ZH10-6三个世代样品中均扩增到转化体序列，且通过外源基因与内源基因的比值确定转基因大豆ZH10-6三个世代的转化体序列拷贝数均为1，即三个世代大豆均为纯合子。表明建立的精准定量检测转基因大豆ZH10-6的方法特异性良好，稳定性好。
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津市农业科学院
<120> 一种精准定量检测转基因耐除草剂大豆ZH10-6的方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> r人工序列
<400> 1
gcggtttctt caaatcctat gg 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgtttcccgc cttcagttta 20
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aatgccacct tctggctcct tcaaacac 28
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gccctctact ccaccccca 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcccatctgc aagccttttt 20
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agcttcgccg cttccttcaa cttcac 26

Claims (3)

1.一种用于检测转基因大豆ZH10-6的特异性引物及探针，其特征在于包括ZH10-6后一个插入位点5’端外源基因侧翼序列：
正向引物序列：5’-GCGGTTTCTTCAAATCCTATGG-3’
反向引物序列：5’-CGTTTCCCGCCTTCAGTTTA-3’
探针序列：FAM-AATGCCACCTTCTGGCTCCTTCAAACAC-BHQ1；
内源基因Lectin基因序列：
正向引物序列：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’
反向引物序列：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’
探针序列：FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1。
2.一种采用权利要求1所述用于检测转基因大豆ZH10-6的特异性引物及探针精准定量检测转基因耐除草剂大豆ZH10-6的方法，其特征在于如下步骤：
（1）转化体特异性引物序列：
正向引物序列：5’-GCGGTTTCTTCAAATCCTATGG-3’,
反向引物序列：5’-CGTTTCCCGCCTTCAGTTTA-3’，
探针序列：FAM-AATGCCACCTTCTGGCTCCTTCAAACAC-BHQ1；
内参基因Lectin基因序列：
正向引物序列：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’，
反向引物序列：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’，
探针序列：FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1；
（2）PCR反应体系：总体积为20 μL，包括BIO-RAD ddPCR Supermix for Probes 10 μL，10 µmol/L上游引物1 μL，10 µmol/L下游引物1 μL，10 µmol/L探针1 μL，25 ng/μL DNA模板1 μL，最终用无菌水补充至20 μL；
（3）微滴生成：将20 μL反应体系小心转移至微卡发生器，避免产生气泡，同时与微卡发生器相应位置加入微滴生成油70 μL，盖上垫片，放入微滴生成器中生成微滴，微滴生成后用移液器倾斜30-45度吸取40 μL反应产物，小心转移至数字96孔反应板中，170℃热封膜；
（4）PCR反应程序：94 ℃预变性热激活10 min，1个循环；94 ℃变性30 s，60 ℃退火1min，40个循环；98℃酶失活10 min，1个循环；
（5）结果分析：微滴数字PCR仪自动计算每个反应的拷贝数浓度、总微滴数和阳性微滴数，总微滴数大于10000以上视为有效结果，按照公式A=B/C×100%，计算出试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列百分含量；公式中A为转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列百分含量，B为转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列的拷贝数浓度，C为内参基因Lectin基因的拷贝数浓度。
3.权利要求1所述的用于检测转基因大豆ZH10-6的特异性引物及探针在用于ZH10-6快速定量高效筛查方面的应用。
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CN112609020A (zh) * 2020-12-24 2021-04-06 天津市农业科学院 一种微滴数字pcr分析耐除草剂转基因大豆zh10-6拷贝数的方法

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