CN113186262B - 用于mgi平台高通量测序文库快速定量的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于MGI平台高通量测序文库快速定量方法及试剂盒。该方法包括利用含有引物和探针的组合物对待测高通量测序文库进行荧光定量PCR检测；含有引物和探针的组合物包括检测MGI文库的第一引物和第一探针，和检测拟南芥PHYA基因的第二引物和第二探针，第一引物包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列，第一探针包括SEQ IDNO:3所示序列。试剂盒包括第一引物和第一探针，还包括第二引物和第二探针，第二引物包括SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列，第二探针包括SEQ ID NO:6所示序列。所提供的方法或试剂盒可用于对高通量测序文库快速定量。
Description
技术领域
本发明属于基因测序领域，具体涉及一种用于MGI平台高通量测序文库快速定量的方法及试剂盒。
背景技术
高通量测序(NGS)文库制备的目的是，在片段化后的待测核酸片段上连接特异性的接头序列，让它们能够在高通量测序平台上进行测序。NGS文库的质量对于高通量测序产出的数据质量至关重要。因此，NGS文库在上机测序之前，需要对其浓度进行精准测定，以便上机测序时能够调整得到合适的上机测序浓度，最终获得最优的测序数据结果。
对NGS文库进行荧光定量PCR(QPCR)法检测，可以实现样品的定量检测。其是使用特异性引物对文库中两端接头连接完整的样品，进行检测，通过该方法可以排除单端或双端都不连接接头的不可测序文库的干扰，是目前行业内进行文库定量的首选方法。
然而，常规的QPCR法均采用荧光染料法，不仅特异性低，其非特异性扩增也会增加定量不准的风险。因此，针对高通量测序文库的荧光定量检测还需要进一步改进。
发明内容
本发明在一定程度上解决上述技术问题。针对NGS文库的QPCR法定量检测，是以Taqman探针法为主。要实现高通量测序文库的绝对定量，需要将待测NGS文库的检测结果，与标准品制备的标准曲线进行比较，通过标准曲线进行相对定量，然后再根据待测NGS文库的片段与标准品片段的大小差异进行定量结果的校正。理论上，NGS文库定量方法Taqman探针QPCR定量检测，能够比较准确的定量NGS文库，为上机测序提供准确的浓度信息。为此本发明提供了一种用于MGI平台高通量测序文库快速定量的方法及试剂盒。
本发明的第一方面提供了一种用于MGI平台高通量测序文库定量检测的方法，其包括：
提供待测高通量测序文库；
利用含有引物和探针的组合物对所述待测高通量测序文库进行荧光定量PCR检测，以便获得摩尔浓度定量结果；
所述含有引物和探针的组合物包括：检测MGI文库的第一引物和第一探针，和检测拟南芥PHYA基因的第二引物和第二探针，
所述第一引物包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列，所述第一探针包括SEQID NO:3所示序列。
本发明所提供的方法可以用于高通量测序文库的快速定量。本发明基于多重荧光定量PCR技术，采用MGI文库特异性引物和荧光标记探针，引入外源拟南芥基因PHYA作为内标，能够在保证扩增体系成功的条件评估靶标扩增质量，进一步保证结果的准确性和有效性。相对于现有的QUBIT和QSEQ100核酸文库的浓度定量检测，操作繁琐，时间人力成本高，定量出的DNA片段大小本身不一致难以绝对统一等诸多弊端而言；本发明所提供的方法能够更准确的获得高通量测序文库的实际摩尔浓度，且无需进行基于高通量测序文库DNA片段大小的校正，这对高通量测序具有重要意义，可以提高测序质量，从而获得最优的测序数据结果。
本发明的第二方面提供了一种用于高通量测序文库定量检测的试剂盒，包括：
检测MGI文库的第一引物和第一探针，所述第一引物包括SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示序列，所述第一探针包括SEQ ID NO:3所示序列；
检测拟南芥PHYA基因的第二引物和第二探针，所述第二引物包括SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列，所述第二探针包括SEQ ID NO:6所示序列。
本发明试剂盒能够更准确的获得高通量测序文库的实际摩尔浓度，且无需进行基于高通量测序文库DNA片段大小的校正，这对高通量测序具有重要意义，可以提高测序质量，从而获得最优的测序数据结果，能够用于高通量测序文库的快速定量。
附图说明
图1是根据本发明的实施例提供的实验组引物探针与对照组引物探针比较结果图。
图2是根据本发明的实施例提供的利用引物探针对阳性标准品扩增分析结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，旨在用于解释本发明，但所述实施不构成对本发明的限制。
本发明提供了一种用于MGI平台高通量测序文库定量检测的方法，包括：
提供待测高通量测序文库；
利用含有引物和探针的组合物对所述待测高通量测序文库进行荧光定量PCR检测，以便获得摩尔浓度定量结果；
所述含有引物和探针的组合物包括：检测MGI文库的第一引物和第一探针，和检测拟南芥PHYA基因的第二引物和第二探针，
所述第一引物包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列，所述第一探针包括SEQID NO:3所示序列。
本发明基于多重荧光定量PCR技术，采用MGI文库特异性引物和荧光标记探针，引入外源拟南芥基因PHYA作为内标，能够在保证扩增体系成功的条件评估靶标扩增质量，进一步保证结果的准确性和有效性。本发明所提供的方法可以对NGS文库进行定量检测，可实现NGS文库的绝对定量。而且所提供的方法能更准确的获得NGS文库的实际浓度，且无需进行基于NGS文库DNA片段大小的校正，这对高通量测序具有重要意义，可以提高测序质量，从而获得最优的测序数据结果。另外，拟南芥是一种模式植物，其基因序列的亲缘关系远离于动物或微生物，以拟南芥PHYA基因作为非植物物种基因组分析技术如测序技术或荧光PCR技术的内标物质，能够进一步保证结果的准确性和有效性。
其中各具体序列如下：
SEQ ID NO:1 AACTCCTTGGCTCACAGAACG
SEQ ID NO:2 CTAAGACCGCTTGGCCTCC
SEQ ID NO:3 CATGGCTACGATCCGA
在本发明的至少一些实施方式中，所述第二引物包括SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列，所述第二探针包括SEQ ID NO:6所示序列。
其中各具体序列如下：
SEQ ID NO:4 GCTGATGCTGGGCCAATAAGT
SEQ ID NO:5 CCAACCACGTTTTCATGGAGA
SEQ ID NO:6 TGCATGCGCAAGTAGAGA
在本发明的至少一些实施方式中，所述拟南芥PHYA基因序列如SEQ ID NO:7所示。
GCATTTCCTCACACTTGTTGAAGATTCTTCAGTGGAAATCGTTAAAAGGATGCTAGAGAACGCATTAGAAGGAACTGAGGAGCAGAATGTCCAGTTTGAGATCAAGACACATCTGTCCAGGGCTGATGCTGGGCCAATAAGTTTAGTTGTAAATGCATGCGCAAGTAGAGATCTCCATGAAAACGTGGTTGGGGTGTGTT(SEQ ID NO:7)。
在本发明的至少一些实施方式中，所述方法进一步包括：
提供阳性标准品，所述阳性标准品为含有MGI文库片段的质粒；
利用含有检测MGI文库的第一引物和第一探针的组合物对所述阳性标准品进行荧光定量PCR检测，得到标准曲线；
将所述利用含有引物和探针的组合物对所述待测高通量测序文库的检测值和所述标准曲线进行比较，以便获得所述高通量测序文库的摩尔浓度定量结果。
在本法发明的至少一些实施方式中，所述阳性标准品中所含有的MGI文库片段序列如SEQ ID NO:8所示。
CTCTCAGTACGTCAGCAGTTCGTCGATGACCAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTCAGCTCTCTTGTATAAAGACAAGATATGGAAACTGGGAACAACTCCAAGTGAGTTCCACCTGCAGGAGATAGCTTCATGGTTGTGTGAATACCACATGGATTCAACGGGTTTGAGCACTGATAGTTTGCATGACGCCGGGTTTCCTAGGGCTCTATCTCTCGGGGATTCGGTATGTGGGATGGCAGCTGTGAGGATATCAAAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAATAACACGACGCTGATAAGGTCGCCATGC(SEQ ID NO:8)。
本发明还提供了一种用于高通量测序文库定量检测的试剂盒，包括：
检测MGI文库的第一引物和第一探针，所述第一引物包括SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示序列，所述第一探针包括SEQ ID NO:3所示序列；
检测拟南芥PHYA基因的第二引物和第二探针，所述第二引物包括SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列，所述第二探针包括SEQ ID NO:6所示序列。
在至少一些实施方式中，所述试剂盒进一步包括PCR反应液，所述PCR反应液为荧光定量PCR检测试剂。
在至少一些实施方式中，所述试剂盒进一步包括阴性对照品，所述的阴性对照品为无DNase/RNase水。
在至少一些实施方式中，所述试剂盒进一步包括：阳性标准品，所述阳性标准品为含有MGI文库片段的质粒。根据本发明的实施例，所述阳性标准品中所含有的MGI文库片段序列如SEQ ID NO:8所示。根据本发明的实施例，所述阳性标准品的浓度为0.01pM～100pM，由此可以获得更加准确的结果。
在至少一些实施方式中，所述第一引物的浓度为1-10μM，所述第一探针的浓度为1-10μM。
所述第二引物的浓度为1-10μM，所述第二探针的浓度为1-10μM。
所述第一探针和所述第二探针的5’端具有荧光基团修饰，3’端具有淬灭基团修饰；用于探针修饰的荧光基团和淬灭基团可以选用价格便宜、容易合成、性能良好且适用于市场上所有的定量仪器的FAM、VIC、CY5、ROX等，其对应的荧光猝灭基团标记的探针为MGB。
根据本发明的实施例，所述荧光基团修饰选自FAM、VIC、CY5、ROX中的至少一种，所述淬灭基团修饰选自MGB。
根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括文库稀释液，所述文库稀释液为拟南芥PHYA基因组片段，所述拟南芥PHYA基因组片段如SEQ ID NO:7所示。
根据本发明的实施例，所述拟南芥PHYA基因组片段的浓度为0.01-100pM。
本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
实施例1设计了实验组和对照组，其中实验组选用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2引物以及SEQ ID NO:3探针；对照组选用对照引物和对照探针，所用到的对照引物和对照探针序列如下：
对照引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物为SEQ ID NO:9所示序列，下游引物为SEQ ID NO:10所示序列，对照探针为SEQ ID NO:11所示序列。
SEQ ID NO:9CAACTCCTTGGCTCACAGAACG
SEQ ID NO:10TCCTAAGACCGCTTGGCCTC
SEQ ID NO:11CATGGCTACGATCCGAC
分别采用上述引物探针与对照引物探针，对阳性标准品进行检测，具体PCR扩增体系如表1所示，扩增条件如表2所示。其中GoldStar Probe Mix为市购的探针法荧光定量扩增反应液。所用到的阳性标准品为含有MGI文库片段的质粒，所含有的MGI文库片段序列如SEQ ID NO:7所示。
表1 TaqMan探针法PCR扩增反应体系
表2 TaqMan探针法PCR扩增反应条件
其中扩增结果如图1所示，从图1可以看出实验组相较于对照组来说，检测结果更优异。
实施例2
为确定本发明所提供的引物、探针的最低检测限，首先对5μg质粒干粉，再用100μL无核酸酶水稀释成50ng/μL作为储存液，然后将储存液梯度稀释101～108倍，最后利用引物探针测试梯度扩增情况，以分析本发明引物探针的扩增效率和线性。
其中PCR扩增体系如上述实施例1表1所示，扩增条件如上述实施例1中表2所示。图2为引物探针对稀释101～107倍的阳性标准品检测的扩增曲线结果。
表3为所提供的引物探针对各浓度阳性对照品的检测CT值
| 组别 | 检测CT值 |
| 稀释10<sup>1</sup>倍的质粒溶液 | 11.12 |
| 稀释10<sup>2</sup>倍的质粒溶液 | 14.58 |
| 稀释10<sup>3</sup>倍的质粒溶液 | 19.19 |
| 稀释10<sup>4</sup>倍的质粒溶液 | 23.50 |
| 稀释10<sup>5</sup>倍的质粒溶液 | 27.40 |
| 稀释10<sup>6</sup>倍的质粒溶液 | 31.91 |
| 稀释10<sup>7</sup>倍的质粒溶液 | 未检出 |
通过表3与图2可以发现引物探针的最低检测限是31.91，即当扩增曲线CT值小于或等于31.91时，则可认为文库构建成功，否则认为文库未构建成功，需要重新构建文库。由此可以看出本发明引物探针对文库的扩增效率和线性较好。
实施例3
本发明中选择拟南芥PHYA基因片段作为内标，采用多重荧光PCR技术，对文库进行定量的同时，可以对扩增反应过程的质量进行控制。在本实施例中，内标存在于文库稀释液中，工作浓度为0.1pM，一方面可以作为文库的稀释液，同时也可以实现内标的功能。
实施例1选用了10个质检合格的文库作为扩增模板，样本类型涵盖肺泡灌洗液、痰液、血液、脑脊液、组织等，通过荧光PCR的方法(反应体系和条件参考实施例中表1和表2)进行检测。其中引物探针工作液中还含有10μM内标上游引物SEQ ID NO:4、10μM内标下游引物SEQ ID NO:5、10μM内标探针SEQ ID NO:6。其中探针SEQ ID NO:3分别具有FAM荧光基团和MGB淬灭基团，探针SEQ ID NO:6分别具有CY5荧光基团和MGB淬灭基团。
实验结果见表4所示，内标引物探针只能对文库稀释液中的拟南芥基因序列进行扩增，文库引物探针无法扩增拟南芥基因序列，且引物探针在阴性对照中均未出现扩增现象。所以，选择拟南芥PHYA基因片段可以作为动物或微生物分析的内标，且采用本发明的特异性引物和探针具有较强的特异性。
表4实验结果
| 组别 | FAM(CT值) | CY5(CT值) |
| 文库稀释液 | 未检出 | 22.15 |
| 阴性对照 | 未检出 | 未检出 |
| 文库1 | 24.83 | 未检出 |
| 文库2 | 23.64 | 未检出 |
| 文库3 | 21.16 | 未检出 |
| 文库4 | 26.52 | 未检出 |
| 文库5 | 25.14 | 未检出 |
| 文库6 | 24.31 | 未检出 |
| 文库7 | 24.74 | 未检出 |
| 文库8 | 23.67 | 未检出 |
| 文库9 | 22.49 | 未检出 |
| 文库10 | 24.62 | 未检出 |
实施例4
实施例4采用临床样本肺泡灌洗液提取的DNA进行基于MGI测序平台的高通量测序文库构建。具体采用Hieff
OnePot II DNA Library Prep Kit for MGI试剂盒，对十个肺泡灌洗液DNA进行高通量测序文库构建。高通量测序文库构建的具体步骤参考Hieff
OnePot II DNA Library Prep Kit for MGI试剂盒使用说明书，十个肺泡灌洗液DNA构建的高通量测序文库分别标记为文库1、文库2、文库3、文库4、文库5、文库6、文库7、文库8、文库9和文库10。
采用本发明所提供的引物与探针，对本实施例构建的文库1、文库2、文库3、文库4、文库5、文库6、文库7、文库8、文库9和文库10进行浓度检测，具体的PCR扩增体系如表1所示，扩增条件如表2所示。
作为对比，同时采用赛默飞文库染料法QPCR对相同的十个文库进行定量检测，检测方法参考MGI测序平台的推荐方案。结果如表5所示。
表5不同文库的浓度检测结果
将按照两种定量方法得到的同一文库的不同浓度结果，即表5所示浓度，进行上机测序，具体采用MGISEQ-2000测序平台进行测序，具体的上机测序步骤参考华大智造官方出版的《MGISEQ-2000测序指南》，采用SE50模式进行上机测序，根据质检浓度计算结果，测序浓度选择1PM。
测序数据部分质控结果如表6所示。
表6基于不同测定浓度的测序数据部分质控结果
表6的结果显示，基于本发明的NGS文库探针法定量检测的NGS文库浓度与基于赛默飞文库染料法定量检测的NGS文库浓度同时进行上机测序，发现基于本发明的NGS文库探针法定量检测的NGS文库浓度能够获得更高的文库测序下机数据量，而文库测序下机数据Dup更低。结果表明，基于本发明的特异性引物和探针对NGS文库定量检测相比传统赛默飞文库染料法，可以更精确的测量到NGS文库的浓度，并且不需要对检测结果进行校正。
由此本发明所提供的试剂盒可以精准有效的检测高通量测序文库的浓度，尤其是对于片段多峰等异常文库类型，在无法准确评估其片段大小的情况下，通过使用本发明所提供的试剂盒和检测方法仍可以稳定地获得高通量测序文库样本的真实浓度值，有效的保证了NGS测序数据产出的质量。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海锐翌生物科技有限公司
<120> 用于MGI平台高通量测序文库快速定量的方法及试剂盒
<130> SI4210094
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 第一引物
<400> 1
aactccttgg ctcacagaac g 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 第一引物
<400> 2
ctaagaccgc ttggcctcc 19
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 第一探针
<400> 3
catggctacg atccga 16
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 第二引物
<400> 4
gctgatgctg ggccaataag t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 第二引物
<400> 5
ccaaccacgt tttcatggag a 21
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 第二探针
<400> 6
tgcatgcgca agtagaga 18
<210> 7
<211> 200
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 拟南芥PHYA基因
<400> 7
gcatttcctc acacttgttg aagattcttc agtggaaatc gttaaaagga tgctagagaa 60
cgcattagaa ggaactgagg agcagaatgt ccagtttgag atcaagacac atctgtccag 120
ggctgatgct gggccaataa gtttagttgt aaatgcatgc gcaagtagag atctccatga 180
aaacgtggtt ggggtgtgtt 200
<210> 8
<211> 332
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 阳性标准品
<400> 8
ctctcagtac gtcagcagtt cgtcgatgac caactccttg gctcacagaa cgacatggct 60
acgatccgac ttcagctctc ttgtataaag acaagatatg gaaactggga acaactccaa 120
gtgagttcca cctgcaggag atagcttcat ggttgtgtga ataccacatg gattcaacgg 180
gtttgagcac tgatagtttg catgacgccg ggtttcctag ggctctatct ctcggggatt 240
cggtatgtgg gatggcagct gtgaggatat caaagtcgga ggccaagcgg tcttaggaag 300
acaataacac gacgctgata aggtcgccat gc 332
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 对照组上游引物
<400> 9
caactccttg gctcacagaa cg 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 对照组下游引物
<400> 10
tcctaagacc gcttggcctc 20
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 对照探针
<400> 11
catggctacg atccgac 17
Claims (8)
1.一种用于MGI平台高通量测序文库定量检测的方法，其特征在于，包括：
（1）提供待测高通量测序文库，其包括文库稀释液，所述文库稀释液中存在拟南芥PHYA基因片段，所述拟南芥PHYA基因片段序列如SEQ ID NO:7所示；所述高通量测序文库为非植物物种基因组文库；
（2）提供阳性标准品，所述阳性标准品为含有MGI文库片段的质粒，所述阳性标准品中所含有的MGI文库片段序列如SEQ ID NO:8所示；
（3）利用检测MGI文库的第一引物和第一探针对所述阳性标准品进行荧光定量PCR检测，得到标准曲线；
（4）将利用含有引物和探针的组合物对所述待测高通量测序文库进行荧光定量PCR检测得到的检测值与所述标准曲线进行比较，以便获得所述待测高通量测序文库的摩尔浓度定量结果；
所述含有引物和探针的组合物包括：检测MGI文库的第一引物和第一探针，和检测所述拟南芥PHYA基因片段的第二引物和第二探针；
所述第一引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述第一探针的序列如SEQID NO:3所示；
所述第二引物的序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，所述第二探针的序列如SEQID NO:6所示；
所述第一探针和第二探针的5’端具有不同的荧光基团修饰。
2.一种用于MGI平台高通量测序文库定量检测的试剂盒，其特征在于，包括：
检测MGI文库的第一引物和第一探针，所述第一引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示，所述第一探针的序列如SEQ ID NO:3所示；
文库稀释液，所述文库稀释液中存在拟南芥PHYA基因片段，所述拟南芥PHYA基因片段如SEQ ID NO:7所示；
检测拟南芥PHYA基因片段的第二引物和第二探针，所述第二引物的序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO:6所示；
所述第一探针和所述第二探针的5’端具有荧光基团修饰，3’端具有淬灭基团修饰；所述第一探针和第二探针的5’端具有不同的荧光基团修饰；
进一步包括：阳性标准品，所述阳性标准品为含有MGI文库片段的质粒，所述阳性标准品中所含有的MGI文库片段序列如SEQ ID NO:8所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括PCR反应液，所述PCR反应液为荧光定量PCR检测试剂。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括阴性对照品，所述的阴性对照品为无DNase/RNase水。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品的浓度为0.01pM~100pM。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述第一引物的浓度为1-10µM，所述第一探针的浓度为1-10µM；
所述第二引物的浓度为1-10µM，所述第二探针的浓度为1-10µM。
7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团修饰选自FAM、VIC、CY5、ROX中的一种，所述淬灭基团修饰为MGB。
8.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述拟南芥PHYA基因片段的浓度为0.01-100pM。
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- 2021-04-09 CN CN202110383434.4A patent/CN113186262B/zh active Active
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|---|---|---|---|---|
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| CN111041563A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-21 | 广州精科医学检验所有限公司 | 一种靶向序列捕获及pcr建库方法 |
| CN111088328A (zh) * | 2020-01-15 | 2020-05-01 | 深圳海普洛斯医学检验实验室 | 一种用于高通量测序文库定量检测的试剂盒及检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Quantitation of next generation sequencing library preparation protocol efficiencies using droplet digital PCR assays - a systematic comparison of DNA library preparation kits for Illumina sequencing;Louise Aigrain等;《BMC Genomics》;20160613;第17卷;全文 * |
| 二代测序平台进行核酸检测的新技术研究;陈科;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 基础科学辑》;20190615;全文 * |
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