CN111793717A - 用于检测新型冠状病毒的特异性引物对、探针及试剂盒 - Google Patents

用于检测新型冠状病毒的特异性引物对、探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测新型冠状病毒的特异性引物对、探针及试剂盒。本发明以新型冠状病毒中S基因为检测靶点，通过恒温扩增技术，使用特异性的引物和探针组合，提高了新型冠状病毒型的检测便捷性和特异性，同时检测时间也大大缩短。与PCR检测方法相比，本发明的方法省去了产物电泳验证过程，避免了假阳性结果出现，提高检测的准确度。与qPCR相比，本发明的方法简便易行，也不需要操作复杂的仪器设备，节约了成本，提高了检测效率，同时便于在大范围内推广使用。与其他恒温扩增方法相比，本发明的检测方法所需时间更短，检测的准确率更高。

Description

用于检测新型冠状病毒的特异性引物对、探针及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及用于检测新型冠状病毒的特异性引物对、探针、检测试剂盒。
背景技术
目前实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chainreaction，qPCR)是筛查和诊断新型冠状病毒的重要手段。该技术起初是1996年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种核酸新定量试验技术，荧光定量PCR是在常规PCR基础上加入荧光探针或相应的荧光染料来实现实时定量的。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。在实时荧光定量PCR技术中Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。目前新型冠状病毒检测及鉴定的方法很有限，荧光定量PCR技术是病毒诊断的重要检测方法，但是实时荧光定量PCR需要配套价格高昂的荧光定量PCR仪器，而且设备维护费用高，机器设置操作复杂，需专业人员，因此难以得到全面推广。
发明内容
本发明所要解决技术问题是提供了一种用于检测新型冠状病毒的特异性引物对、探针及试剂盒。本发明引物对针对新型冠状病毒常见的保守基因，具体为保守性强的S基因作为目标扩增区段，结合与所述的引物对配合使用的探针，确保种类的保守性及种间的特异性；同时本发明还提供了包含上述引物对和/或与引物对配合使用的探针的试剂盒。
为了解决现有技术存在的问题，本发明采用以下技术方案：
一种用于检测新型冠状病毒的特异性引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2 、SEQ ID NO：4 、SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：8所示。
本发明还公开了用于检测新型冠状病毒的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ IDNO：9 、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示。进一步的，所述用于检测新型冠状病毒的探针与上述用于检测新型冠状病毒的特异性引物对配合使用。
本发明中，所述探针为荧光染料标记的探针，所述荧光染料为SYTO-13，SYTO-82，FAM，FITC, SYBR Green I，SYTO-13，SYTO-82，VIC，HEX，JOE，TAMRA，TET，Cy3 ，ROX，TEXAS-Red或Cy5中的一种。
本发明中，所述探针的长度为35-55个核苷酸碱基，位于第28-35位的一个碱基被替换为核酸类似物，所述核酸类似物为THF；THF两侧的两个T碱基分别标记荧光基团和淬灭基团，探针在3’-末端通过封闭基团进行封闭。在本发明公开探针序列的基础上，替换、标记、封闭都为常规技术。
本发明公开了所述特异性引物对、所述探针在制备新型冠状病毒检测或诊断试剂盒中的应用；或者所述特异性引物对、所述探针在制备新型冠状病毒检测或诊断试剂中的应用。
本发明还公开了一种新型冠状病毒检测试剂盒，所述新型冠状病毒检测试剂盒包括所述引物对和/或所述探针。
进一步的，所述新型冠状病毒检测试剂盒包括：重组酶，聚合酶，单链DNA结合蛋白，核酸酶，引物对，探针，dNTP、拥挤试剂、重组加载蛋白、能量系统和盐离子。
其中，重组酶，聚合酶，单链DNA结合蛋白，核酸酶，dNTP、拥挤试剂、重组加载蛋白、能量系统和盐离子为本领域常规组分，比如所述重组酶选自噬菌体UvsX 蛋白，大肠杆菌recA蛋白的任一种或一种以上的组合；所述聚合酶选自klenow聚合酶，bsu聚合酶或phi29聚合酶及其这些酶的突变体或大片段的任一种或一种以上的组合；所述单链DNA结合蛋白选自大肠杆菌SSB蛋白，GP32蛋白的任一种或其组合；所述核酸酶选自核酸外切酶III或核酸内切酶IV的任一种或一种以上的组合；所述重组加载蛋白选自噬菌体UvsY蛋白，大肠杆菌RecO 或大肠杆菌RecR的任一种或一种以上的组合；所述拥挤试剂选自聚乙二醇，聚乙烯醇，右旋糖酐或聚蔗糖的一种或一种以上的组合，其中，所述聚乙二醇选自PEG1450，PEG3000，PEG8000，PEG10000，PEG14000， PEG20000，PEG25000，PEG30000，PEG35000或PEG40000中的一种或几种；所述能量系统选自ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶的一种或一种以上的组合；所述盐离子选自Tris，镁离子或钾离子的任一种或一种以上的组合。
优选的，本发明的引物对和探针的组合可以有以下四种组合：
组合一：
上游引物：5’-CTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCA -3’
下游引物：5’-GTGCACAGTCTACAGCATCTGTAATGGTTC -3’
探针：
5’-CTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCC(FAM-dT)(THF)G(BHQ1-dT) GATTCTTCTTCAGG-3’(C3-SPACER)
组合二：
上游引物：5’-TGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTT -3’
下游引物：5’-TCTGAGAGAGGGTCAAGTGCACAGTCTAC-3’
探针序列：
5’-CTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCC(FAM-dT)(THF)G(BHQ1-dT) GATTCTTCTTCAGG-3’(C3-SPACER)
组合三：
上游引物：5’-TGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCA-3’
下游引物：5’-TGCACAGTCTACAGCATCTGTAATGGTTCC-3’
探针序列：
5’-TACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGAT(FAM-dT)(THF)T(BHQ1-dT)CTTCAGGTTGGACAG-3’(C3-SPACER)
或组合四：
上游引物：5’-CGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTA-3’
下游引物：5’-CTGAGAGAGGGTCAAGTGCACAGTCTACAG -3’
探针序列：
5’-ATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCT(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)
TCAGGTTGGACAGCT -3’(C3-SPACER)
重组酶聚合酶扩增技术在扩增时间、扩增特异性、扩增所需要的能耗等方面均具有明显的优势。原理为通过反应体系中通常为28-35个碱基的两条特异性引物与重组酶形成复合物，在模板DNA上寻找同源序列发生链交换，并在DNA聚合酶作用下发生延伸。经过上下游引物在模板的特异性区段两端分别结合延伸，循环往复发生指数级扩增。扩增产物虽然可通过添加SYBR Green染料实现荧光信号的增加，但因荧光染料无法区分非特异性，而本发明采用特异性荧光探针技术进行检测，从而大大提高了检测的特异性。
本发明选取新型冠状病毒糖蛋白S基因部分区域作为目标扩增区段，将其构建至载体puc57中，制备成新型冠状病毒的阳性质粒，质粒由南京擎科生物科技有限公司合成，选取的糖蛋白S基因部分序列如下：
ATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTA（SEQ ID NO：12）。
本发明公开了一种检测新型冠状病毒的重组酶聚合酶扩增体系，包括模板、重组酶，聚合酶，单链DNA结合蛋白，核酸酶，dNTP、拥挤试剂、重组加载蛋白、能量系统和盐离子、上述引物对、上述探针；所述重组酶选自噬菌体UvsX 蛋白，大肠杆菌recA蛋白的任一种或一种以上的组合；所述聚合酶选自klenow聚合酶，bsu聚合酶或phi29聚合酶及其这些酶的突变体或大片段的任一种或一种以上的组合；所述单链DNA结合蛋白选自大肠杆菌SSB蛋白，GP32蛋白的任一种或其组合；所述核酸酶选自核酸外切酶III或核酸内切酶IV的任一种或一种以上的组合；所述重组加载蛋白选自噬菌体UvsY蛋白，大肠杆菌RecO 或大肠杆菌RecR的任一种或一种以上的组合；所述拥挤试剂选自聚乙二醇，聚乙烯醇，右旋糖酐或聚蔗糖的一种或一种以上的组合，其中，所述聚乙二醇选自PEG1450，PEG3000，PEG8000，PEG10000，PEG14000，PEG20000，PEG25000，PEG30000，PEG35000或PEG40000中的一种或几种；所述能量系统选自ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶的一种或一种以上的组合；所述盐离子选自Tris，镁离子或钾离子的任一种或一种以上的组合。
优选的，在检测新型冠状病毒的重组酶聚合酶扩增体系中，三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液 pH8.0 终浓度为20-60mM，更优选为30mM；醋酸钾终浓度为60-120mM，更优选为120mM；引物终浓度为0.1-0.5nM，更优选为0.42nM；聚乙二醇选自终浓度5%PEG8000或PEG20000，更优选为5% PEG20000，二硫苏糖醇终浓度为1-10mM，更优选为3mM；ATP终浓度为1-10mM，更优选为2mM；磷酸肌酸终浓度为10-50mM，更优选为20mM；肌酸激酶终浓度为50-250ng/μl，更优选为100ng/ul；噬菌体gp32蛋白终浓度为100-1000ng/μl，更优选为600ng/μl；噬菌体uvsX蛋白终浓度为50-500ng/μl，更优选为150ng/μl；噬菌体uvsY蛋白终浓度为10-100ng/μl，更优选为25ng/μl；klenow聚合酶终浓度为5-100ng/μl，更优选为80ng/μl；逆转录酶终浓度为25-300U，更优选为200U；核酸外切酶III终浓度为10-200ng/μl，更优选为50ng/μl。
本发明所述检测新型冠状病毒的重组酶聚合酶扩增体系中，反应温度为25-45℃，优选为37-42℃，更优选为40℃；反应时间为15-60分钟，优选为15-20分钟。
本发明公开了检测新型冠状病毒的重组酶聚合酶扩增方法，包括以下步骤，将上述检测新型冠状病毒的重组酶聚合酶扩增体系在25-45℃下反应15-60分钟；完成检测新型冠状病毒的重组酶聚合酶扩增。
本发明还包括了检测新型冠状病毒的方法，该方法采用的扩增体系同前所述检测试剂盒的体系，该方法至少包括两条引物和一条探针，引物分别结合于待扩增区域的上游和下游，引物的长度为15-45核苷酸碱基，优选为28-35核苷酸碱基；所述探针长度为35-55个核苷酸碱基，优选地46-52个碱基，探针中位于第28-35位的一个碱基被替换为核酸类似物，所述核酸类似物优选为THF，在THF的两侧分别为两个T碱基并标记荧光基团和淬灭基团，探针在3’-末端通过封闭基团进行封闭。引物和探针的组合同前所述的四种组合。具体的，检测新型冠状病毒的方法为，将上述检测新型冠状病毒的重组酶聚合酶扩增体系在25-45℃下反应15-60分钟；完成检测新型冠状病毒的重组酶聚合酶扩增；在反应过程中，将荧光检测仪检测体系的荧光变化值，根据检测结果完成新型冠状病毒的检测。
上述扩增反应过程中，在荧光检测仪上检测扩增体系的荧光变化值，每30s一次，一直到反应结束；阳性对照以指数型扩增趋势显示“S”型曲线，TT值为4-8分钟，9000<荧光信号<13000；阴性对照则是一条趋于平缓的水平直线，无任何扩增趋势，荧光信号<200；根据荧光检测仪检测结果可以检测出新冠病毒。
与现有技术相比，本发明的优点是：
（1）本发明以新型冠状病毒中S基因为检测靶点，通过恒温扩增技术，使用特异性的引物和探针组合，提高了新型冠状病毒的检测便捷性和特异性，同时检测时间也大大缩短。
（2）与PCR检测方法相比，本发明的检测方法省去了产物电泳验证过程，避免了假阳性结果出现，提高检测的准确度。与qPCR相比，本发明的方法简便易行，也不需要操作复杂的仪器设备，节约了成本，提高了检测效率，同时便于在大范围内推广使用。与其他恒温扩增方法相比，本发明的检测方法所需时间更短，检测的准确率更高。
（3）本发明的检测方法依赖于酶促扩增反应，在恒定的温度下即可进行连续的扩增反应，其扩增速率远远高于常规的PCR变温反应。整个扩增在20分钟即检测完成；而且在操作上，不需要对多种参数进行设置，不需要具备很专业的技能也可以进行检测操作。
（4）本发明的反应条件为37~42℃，对温度控制不需要特别严格，并且采用了特异性的荧光探针，可以更好的区分非特异性扩增。因此，对于基层测试使用更为便捷，且耗能更低，对于现场操作尤为适合。
附图说明
图1为新型冠状病毒重组酶聚合酶扩增（结合核酸外切酶III）方法灵敏度测试结果；1.质粒7（10-5ng/μl） 2. 质粒8（10-6ng/μl） 3. 质粒9（10-7ng/μl） 4. 质粒10（10-8ng/μl） 5.ddH2O；
图2为新型冠状病毒重组酶聚合酶扩增（结合核酸内切酶IV）方法灵敏度测试结果；1.质粒7（10-5ng/μl） 2. 质粒8（10-6ng/μl） 3. 质粒9（10-7ng/μl） 4. 质粒10（10-8ng/μl）5.ddH2O；
图3为新型冠状病毒重组酶聚合酶扩增（结合核酸外切酶III）方法，不同引物浓度测试结果；1、3、5、7. 质粒7（10-5ng/μl） 2、4、6、8. ddH2O ；
图4为新型冠状病毒检测试剂盒（结合核酸外切酶III）方法灵敏度测试结果；1. 质粒8（10-6ng/μl） 2. 质粒9（10-7ng/μl） 3. 质粒10（10-8ng/μl） 4. ddH2O；
图5为新型冠状病毒检测试剂盒假病毒样本灵敏度测试结果；1.质粒8（10-6ng/μl） 2.样本1 3. 样本2 4. 样本3 5. ddH2O。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例是为了对本发明作进一步详细说明，并非对发明的限制；实施例中，聚乙二醇的浓度为质量体积比。
本发明中采用的新型冠状病毒质粒DNA由南京擎科生物科技有限公司合成，新型冠状病毒假病毒样本（包含S基因部分区域）由上海交通大学提供；涉及的具体实验方法以及序列合成为常规方法。
新型冠状病毒的阳性质粒的获得：根据常见的新型冠状病毒S基因保守区域，选取S基因部分区域作为目标扩增区段，将其构建至载体puc57中，制备成新型冠状病毒的阳性质粒，质粒DNA由南京擎科生物科技有限公司合成，选取的S基因部分区域的序列如下：
ATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTA
模板处理：用NanoDrop标定阳性质粒的浓度，用TE先将其稀释至10ng/μl（命名为质粒1），随后10倍依次稀释，稀释至1ng/μl（命名为质粒2）、稀释至10-1ng/μl（命名为质粒3）、稀释至10-2ng/μl（命名为质粒4）、稀释至10-3ng/μl（命名为质粒5）、稀释至10-4ng/μl（命名为质粒6）、稀释至10-5ng/μl（命名为质粒7）、稀释至10-6ng/μl（命名为质粒8）、稀释至10-7ng/μl（命名为质粒9）、稀释至10-8ng/μl（命名质粒10）。
在重组酶聚合酶扩增反应中，在荧光检测仪上检测扩增体系的荧光变化值，每30s一次，一直到反应结束；阳性对照以指数型扩增趋势显示“S”型曲线，TT值为4-8分钟，9000<荧光信号<13000；阴性对照则是一条趋于平缓的水平直线，无任何扩增趋势，荧光信号<200。
实施例1
以合成的含有新型冠状病毒S基因序列的质粒为检测目标。
上游引物序列是：5’-CTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCA-3’（Seq ID NO：1）；
下游引物序列是：5’- GTGCACAGTCTACAGCATCTGTAATGGTTC-3’（Seq ID NO：2）；
探针：5’-CTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCC(FAM-dT)(THF)G(BHQ1-dT)GATTCTTCTTCAGG -3’(C3-SPACER) ；
其中探针的核酸序列为CTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGT（SEQID NO：9）。
利用重组酶聚合酶扩增（结合核酸外切酶III）方法扩增反应体系进行扩增，构建25μl扩增反应体系如下：
30mM 三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液 pH8.0
100mM 醋酸钾
14mM 醋酸镁
3mM 二硫苏糖醇
5% 聚乙二醇（分子量20000）
2mM ATP
20mM 磷酸肌酸
100ng/μl 肌酸激酶
600ng/μl 大肠杆菌SSB蛋白
150ng/μl 噬菌体uvsX蛋白
25ng/μl 噬菌体uvsY蛋白
80ng/μl klenow聚合酶大片段（exo-）
50ng/μl 核酸外切酶III
200U 逆转录酶
450μM dNTP
420nM 每条上游引物
420nM 每条下游引物
120nM 每条荧光探针
模板为合成的阳性质粒 2μl
扩增温度为40℃，反应20min，反应过程中，用GS8荧光恒温扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光，直至反应结束。在荧光检测仪上阳性对照以指数型扩增趋势显示“S”型曲线，TT（时间阈值）值为4-8分钟，9000<荧光信号<13000；阴性对照则是一条趋于平缓的水平直线，无任何扩增趋势，荧光信号差值<200。
重组酶聚合酶扩增不需要复杂的样品DNA前处理过程，不需要模板的热变性，反应在较低的恒定温度条件下完成，反应敏感度高，特异性强，上机检测20min即可出结果。反应通过荧光数值判读，省去了PCR产物电泳验证的过程，避免了气溶胶污染。
不同浓度的模板进行平行实验；经过检测最终确认其灵敏度能检测到10-8ng/μl（命名为质粒10），结果参见图1，其中1.质粒7（10-5ng/μl） 、2. 质粒8（10-6ng/μl） 、3. 质粒9（10-7ng/μl） 、4. 质粒10（10-8ng/μl）、5.ddH2O，灵敏度可检测到10-8ng/μl。
实施例2
以合成的含有新型冠状病毒S基因序列的质粒为检测目标，选取如下引物及探针序列：
上游引物序列是：5’-TGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTT -3’（SEQ ID NO：3）；
下游引物序列是：5’-TCTGAGAGAGGGTCAAGTGCACAGTCTAC-3’（SEQ ID NO:4）；
探针：5’-CTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCC (FAM-dT)(THF)G(BHQ1-dT)GATTCTTCTTCAGG -3’(C3-SPACER)。
通过合成含有新型冠状病毒 S基因序列的质粒为检测目标，进行重组酶聚合酶扩增（结合核酸内切酶III）方法版本扩增测试，构建50μl扩增反应体系如下：
60mM 三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液 pH8.0
100mM 醋酸钾
14mM 醋酸镁
3mM 二硫苏糖醇
5% 聚乙二醇（20000）
2mM ATP
20mM 磷酸肌酸
100ng/μl 肌酸激酶
600ng/μl 大肠杆菌SSB蛋白
150ng/μl 噬菌体uvsX蛋白
25ng/μl 噬菌体uvsY蛋白
80ng/μl klenow聚合酶大片段（exo-）
50ng/μl 核酸外切酶III
200U 逆转录酶
450μM dNTP
420nM 每条上游引物
420nM 每条下游引物
120nM 每条荧光探针
模板为合成的阳性质粒 2μl
扩增温度为40℃，反应20min，用GS8荧光恒温扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。以上述合成的阳性质粒为模板进行检测。
不同浓度的模板进行平行实验；经过检测最终确认其灵敏度能检测到10-8ng/μl（质粒10），见图2，其中1.质粒7（10-5ng/μl）、2. 质粒8（10-6ng/μl）、3. 质粒9（10-7ng/μl）、4. 质粒10（10-8ng/μl）、5.ddH2O。
实施例3
选择实施例2中设计的引物对和探针序列，利用重组酶聚合酶扩增（结合核酸内切酶IV）方法扩增反应体系进行扩增，构建50μl扩增反应体系如下：
60mM 三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液 pH8.0
100mM 醋酸钾
14mM 醋酸镁
3mM 二硫苏糖醇
5% 聚乙二醇（分子量20000）
2mM ATP
20mM 磷酸肌酸
100ng/μl 肌酸激酶
400ng/μl 大肠杆菌recA蛋白
200ng/μl 大肠杆菌SSB蛋白
60ng/μl 大肠杆菌recO蛋白
40ng/μl 大肠杆菌recR蛋白
60ng/μl 大肠杆菌recF蛋白
8Units 枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I
50ng/μl 核酸内切酶IV
200U 逆转录酶
450μM dNTP
420nM 每条上游引物
420nM 每条下游引物
120nM 荧光探针
模板为合成的阳性质粒 2μl
扩增温度为42℃，反应20min，用GS8荧光恒温扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。以实施例1合成的阳性质粒为模板进行检测。
模板处理：同实施例2，经过检测最终确认其灵敏度能检测到10-7ng/μl质粒9。
实施例4
选择通过合成含有新型冠状病毒 S基因序列的质粒为检测目标，
上游引物序列是：5’-TGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCA-3’（SEQ ID NO:5）；
下游引物序列是：5’-TGCACAGTCTACAGCATCTGTAATGGTTCC-3’（SEQ ID NO:6）；
探针：5’-TACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGAT(FAM-dT)(THF)T(BHQ1-dT)
CTTCAGGTTGGACAG-3’(C3-SPACER)；
其中探针的核酸序列为TACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAG（SEQID NO：10）。
利用重组酶聚合酶扩增（结合核酸外切酶III）方法扩增反应体系进行扩增，构建50μl扩增反应体系如下：
30mM 三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液 pH8.0
50mM 醋酸钾
14mM 醋酸镁
3mM 二硫苏糖醇
5% 聚乙二醇（分子量20000）
2mM ATP
20mM 磷酸肌酸
100ng/μl 肌酸激酶
600ng/μl 大肠杆菌SSB蛋白
150ng/μl 噬菌体uvsX蛋白
25ng/μl 噬菌体uvsY蛋白
80ng/μl klenow聚合酶大片段（exo-）
50ng/μl 核酸外切酶III
200U 逆转录酶
450μM dNTP
420nM 每条上游引物
420nM 每条下游引物
120nM 每条荧光探针
模板为合成的阳性质粒 2μl
扩增温度为40℃，反应20min，用GS8荧光恒温扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。
不同浓度的模板进行平行实验；经过检测最终确认其灵敏度能检测到10-6ng/μl质粒8。
实施例5
选择通过合成含有新型冠状病毒保守区基因序列的质粒为检测目标，
上游引物序列是：5’-CGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTA-3’（SEQ ID No. 7）；
下游引物序列是：5’-CTGAGAGAGGGTCAAGTGCACAGTCTACAG-3’（SEQ ID No. 8）；
探针：5’-ATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCT(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)
TCAGGTTGGACAGCT -3’(C3-SPACER)；
其中探针对应的模板核酸序列为ATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCT（SEQ ID NO：11）。
利用重组酶聚合酶扩增（结合核酸外切酶III）方法扩增反应体系进行扩增，构建50μl扩增反应体系如下：
30mM 三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液 pH8.0
100mM 醋酸钾
14mM 醋酸镁
3mM 二硫苏糖醇
5% 聚乙二醇（分子量20000）
2mM ATP
20mM 磷酸肌酸
100ng/μl 肌酸激酶
600ng/μl 噬菌体gp32蛋白
150ng/μl 噬菌体uvsX蛋白
25ng/μl 噬菌体uvsY蛋白
70ng/μl klenow聚合酶大片段（exo-）
50ng/μl 核酸外切酶III
200U 逆转录酶
450μM dNTP
400nM 每条上游引物
400nM 每条下游引物
120nM 每条荧光探针
模板为合成的阳性质粒 2μl
扩增温度为40℃，反应20min，用GS8荧光恒温扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。
不同浓度的模板进行平行实验；经过检测最终确认其灵敏度能检测到10-6ng/μl质粒8。
实施例6
选取如下引物及探针序列：
上游引物序列是：5’-CGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACT -3’（SEQ ID NO：3）；
下游引物序列是：5’-ACACTTTGTTTCTGAGAGAGGGTCAAGTGC-3’（SEQ ID NO:4）；
探针：5’-CTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCC (FAM-dT)(THF)G(BHQ1-dT)GATTCTTCTTCAGGT -3’(C3-SPACER)。
利用重组酶聚合酶扩增（结合核酸外切酶III）方法扩增反应体系进行扩增，构建50μl扩增反应体系如下：
60mM 三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液 pH8.0
100mM醋酸钾
14mM 醋酸镁
3mM 二硫苏糖醇
5% 聚乙二醇（分子量20000）
2mM ATP
20mM 磷酸肌酸
100ng/μl 肌酸激酶
600ng/μl 大肠杆菌SSB蛋白
150ng/μl 噬菌体uvsX蛋白
25ng/μl 噬菌体uvsY蛋白
80ng/μl klenow聚合酶大片段（exo-）
50ng/μl 核酸外切酶III
200U 逆转录酶
450μM dNTP
每条上游引物
每条下游引物
120nM 每条荧光探针
模板为合成的阳性质粒（质粒8），2μl
扩增温度为40℃，反应20min，用GS8荧光恒温扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。
上下游引物浓度分别为400nM、420nM、450nM、500nM，经过检测最终确认不同引物浓度的扩增体系都能检测10-5ng/μl（命名为质粒7），结果参见图3，其中曲线1、3、5、7分别对应上下游引物浓度为400nM、420nM、450nM、500nM。
实施例7 试剂盒的组成
构建的50μl扩增反应体系，将试剂盒组分划分4种，具体如下：
第一种试剂盒：
Figure 128094DEST_PATH_IMAGE002
更换引物对与荧光探针，分别得到第二种试剂盒（实施例1的引物对/探针组合）、第三种试剂盒（实施例4的引物对/探针组合）、第四种试剂盒（实施例5的引物对/探针组合）。
实施例8 采用试剂盒进行实际的应用验证并进行性能评估
选择实施例7中第一种试剂盒，利用所配试剂盒检测新型冠状病毒样本的灵敏度、特异性以及稳定性，具体扩增体系同实施例7。
扩增温度为40℃，反应20min，反应过程用GS8荧光恒温扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。
核酸提取采用常规RNA提取试剂盒采用赛默飞世尔科技（中国）有限公司PureLink™ RNA Mini Kit（目录号：12183018A），取待检假病毒样本150μl，RNA提取过程按照试剂盒内标准抽提步骤，将提取好的核酸进行分装，冻存于-80℃ 备用。用TE缓冲液将提取好的核酸进行10倍稀释（命名为样本1），然后依次稀释至1000倍，均能检出阳性扩增曲线（见图5）。
特异性检测：为了验证引物及探针的特异性，以新型冠状病毒的阳性样本为模板进行检测；经过检测仅新型冠状病毒阳性样品出现正常扩增，阴性对照(ddH2O) 未出现扩增。
本发明上述新型冠状病毒检测试剂盒（结合核酸外切酶III）方法，经过检测最终确认其灵敏度能检测到10-8ng/μl 质粒10（见图4）；经过检测仅新型冠状病毒阳性样品出现正常扩增，阴性对照(ddH2O) 未出现扩增（见图5）。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 苏州先达基因科技有限公司
<120> 用于检测新型冠状病毒的特异性引物对、探针及试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcggcttta gaaccattgg tagatttgcc a 31
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgcacagtc tacagcatct gtaatggttc 30
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgccaatagg tattaacatc actaggttt 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tctgagagag ggtcaagtgc acagtctac 29
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgccaatagg tattaacatc actaggtttc a 31
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgcacagtct acagcatctg taatggttcc 30
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cggtattaac atcactaggt ttcaaacttt a 31
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctgagagagg gtcaagtgca cagtctacag 30
<210> 11
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cttgctttac atagaagtta tttgactcct ggtgattctt cttcaggt 48
<210> 12
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacag 48
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atagaagtta tttgactcct ggtgattctt cttcaggttg gacagct 47
<210> 10
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
attgcacttt tgaatatgtc tctcagcctt ttcttatgga ccttgaagga aaacagggta 60
atttcaaaaa tcttagggaa tttgtgttta agaatattga tggttatttt aaaatatatt 120
ctaagcacac gcctattaat ttagtgcgtg atctccctca gggtttttcg gctttagaac 180
cattggtaga tttgccaata ggtattaaca tcactaggtt tcaaacttta cttgctttac 240
atagaagtta tttgactcct ggtgattctt cttcaggttg gacagctggt gctgcagctt 300
attatgtggg ttatcttcaa cctaggactt ttctattaaa atataatgaa aatggaacca 360
ttacagatgc tgtagactgt gcacttgacc ctctctcaga aacaaagtgt acgttgaaat 420
ccttcactgt agaaaaagga atctatcaaa cttctaactt tagagtccaa ccaacagaat 480
ctattgttag atttcctaat attacaaact tgtgcccttt tggtgaagtt tttaacgcca 540
ccagatttgc atctgtttat gcttggaaca ggaagagaat cagcaactgt gttgctgatt 600
a 601

Claims (10)

1.一种用于检测新型冠状病毒的特异性引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2 、SEQ ID NO：4 、SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：8所示。
2.根据权利要求1所述用于检测新型冠状病毒的特异性引物对，其特征在于，所述引物对为SEQ ID NO：1/ SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3/ SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5/ SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：8。
3.一种用于检测新型冠状病毒的特异性探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9 、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示。
4.根据权利要求3所述用于检测新型冠状病毒的特异性探针，其特征在于，所述探针为荧光染料标记的探针，所述荧光染料为SYTO-13、SYTO-82、FAM、FITC、SYBR Green I、SYTO-13、SYTO-82、VIC、HEX、JOE、TAMRA、TET、Cy3、ROX、TEXAS-Red或Cy5中的一种。
5.权利要求1所述用于检测新型冠状病毒的特异性引物对、权利要求3所述用于检测新型冠状病毒的特异性探针在制备新型冠状病毒检测或诊断试剂盒中的应用。
6.一种新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述新型冠状病毒的检测试剂盒包括权利要求1所述引物对和/或权利要求3所述探针。
7.根据权利要求6所述新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括：重组酶、聚合酶、单链DNA结合蛋白、核酸酶、dNTP、拥挤试剂、重组加载蛋白、能量系统和盐离子。
8.根据权利要求6所述新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述引物对为SEQ IDNO：1/ SEQ ID NO：2，探针为SEQ ID NO：9；或者所述引物对为SEQ ID NO：3/ SEQ ID NO：4，探针为SEQ ID NO：9；或者所述引物对为SEQ ID NO：5/ SEQ ID NO：6，探针为SEQ ID NO：10；或者所述引物对为SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：8，探针为SEQ ID NO：11。
9.一种检测新型冠状病毒的重组酶聚合酶扩增体系，其特征在于，所述检测新型冠状病毒的重组酶聚合酶扩增体系包括模板、重组酶，聚合酶，单链DNA结合蛋白，核酸酶，dNTP、拥挤试剂、重组加载蛋白、能量系统和盐离子、权利要求1所述引物对、权利要求3所述探针。
10.一种检测新型冠状病毒的重组酶聚合酶扩增方法，其特征在于，包括以下步骤，将检测新型冠状病毒的重组酶聚合酶扩增体系在25-45℃下反应15-60分钟；完成检测新型冠状病毒的重组酶聚合酶扩增；所述检测新型冠状病毒的重组酶聚合酶扩增体系包括模板、重组酶，聚合酶，单链DNA结合蛋白，核酸酶，dNTP、拥挤试剂、重组加载蛋白、能量系统和盐离子、权利要求1所述引物对、权利要求3所述探针。
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