CN113373262A - 一种用于新型冠状病毒检测的引物探针、试剂盒及快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于新型冠状病毒检测的引物探针、试剂盒及快速检测方法，引物探针包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的上游引物和下游引物，以及含有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的探针，所述SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中，自5′端起第32位碱基标记有FAM发光基团，第33位碱基后连接脱碱基位点，第35位碱基标记淬灭基团BHQ1。本发明提供的用于新型冠状病毒快速检测方法，使用微量核酸释放剂与RT‑RPA相结合的方法，对新型冠状病毒进行检测，30分钟内即可完成核酸提取和检测的全过程，大大缩短检测时间，提高检测效率，有效降低人力成本和时间成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于新型冠状病毒检测的引物探针、试剂盒及快速检测方法，属于生物检测技术领域。
背景技术
目前，核酸提取是核酸检测的重要环节，传统的核酸提取有物理方法，包括有煮沸法、磁珠法、超声波法等；化学方法包括有表面活性剂、碱裂解法等；生物方法主要有酶法等。现有免提取核酸释放剂存在的主要问题有细胞裂解不完全，造成核酸不能彻底释放，导致核酸不稳定，尤其是RNA，并且受温度、酶等因素易降解；此外，细胞内蛋白含量较高，且含有大量抑制核酸检测的物质，造成提取试剂与检测体系不匹配，导致检测结果不准确。
RT-RPA，重组酶聚合酶扩增，是与荧光定量PCR最为相似的检测技术，该方法具有较高的灵敏度及特异性，但是其没有一个成熟的引物探针筛选规则，只能通过设计和筛选大量的引物探针，形成灵敏度高、特异性强的检测试剂。微量核酸释放剂与PCR相结合的检测方法报道较多，但由于设计引物和筛选的难度较大，目前未见微量核酸释放剂与RT-RPA方法相结合检测新型冠状病毒的文献报道。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种用于新型冠状病毒检测的引物探针、试剂盒及快速检测方法。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
一种用于新型冠状病毒检测的引物探针，其包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的上游引物和下游引物，以及含有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的探针，所述SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中，自5′端起第32位碱基标记有FAM发光基团，第33位碱基后连接脱碱基位点，第35位碱基标记淬灭基团BHQ1。
一种用于新型冠状病毒检测的试剂盒，其包括如上所述的用于新型冠状病毒检测的引物和探针。
如上所述的试剂盒，优选地，所述试剂盒包括A buffer和B buffer。
如上所述的试剂盒，还包括微量核酸释放剂，所述微量核酸释放剂包括按体积百分比计0.5～10％的Triton X-100、0.5～10％的Tween-20、10～30％的乙醇、5～20％的异戊醇，余量为无酶无菌水，及包含终浓度50～80mmol/L的异硫氰酸胍。
优选地，所述核酸释放剂与样本的比例为1:1～1.5混合使用。
一种用于新型冠状病毒快速检测方法，其包括如下步骤：
S1、采用核酸释放剂提取样品的RNA；
S2、每个干粉管中加入29μL A buffer；
S3、向每个反应管分别加入5μL如上所述的上游引物、下游引物和探针；
S4、向反应管中加入13.5μL所述微量核酸释放剂和样本；
S5、向反应管中加入2.5μL B buffer并充分混合；
S6、混匀后，将反应液甩至管子底部，然后立即将反应管放入一体机内进行检测；荧光检测程序为：恒温42℃；每30s采集一次FAM通道荧光值；反应时间20min。
如上所述的快速检测方法，微量核酸释放剂和样本按体积比为1:1～1.5进行混匀。
如上所述的快速检测方法，还包括结果判定：扩增结果有扩增曲线，说明新型冠状病毒阳性，未见扩增曲线说明为新型冠状病毒阴性。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：
本发明提供的用于检测新型冠状病毒的引物对和探针，对检测新型冠状病毒S基因具有良好的特异性，重复性。
本发明采用微量核酸释放剂可快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放核酸，可大大缩短核酸提取纯化的时间，易于配置，操作简便，其所需样本量少，可对微量珍贵样本进行检测；可以直接对血清、全血、血浆、咽拭子、粪便等样本核酸进行提取，无需加热，离心等复杂步骤，只需要一步加样过程，即可完成核酸的提取和释放过程。
本发明提供的用于新型冠状病毒快速检测方法，使用微量核酸释放剂与RT-RPA相结合的方法，对新型冠状病毒进行检测，30分钟内即可完成核酸提取和检测的全过程，大大缩短检测时间，提高检测效率，有效降低人力成本和时间成本。
附图说明
图1为特异性引物探针验证实验结果图；
图2为重复性验证实验结果图；
图3为检出限验证实验(S2中值)结果图；
图4为检出限验证实验(S1低值)结果图；
图5为检出限验证实验(S0弱阳)结果图。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。本发明中所用样本为广州邦德盛生物科技有限公司的2019新型冠状病毒室内质控品S2(中值)、S1低值、S0。
实施例1
本发明提供一种基于重组酶聚合酶扩增技术检测新型冠状病毒S基因的引物、探针，经大量实验验证最后确定选用具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的上游引物和下游引物，以及含有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的探针。其中，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中，自5′端起第32位碱基标记有FAM发光基团，第33位碱基后连接脱碱基位点，第35位碱基标记淬灭基团BHQ1，序列详见表1。委托生工生物工程(上海)股份有限公司按表1所示合成引物探针。
表1新型冠状病毒E基因RPA检测引物探针汇总表
(2)特异性验证实验
选择中国检验检科院研究院卫检所生物样本库内冠状病毒阳性样本：包括冠状病毒NL63阳性样本4份、冠状病毒OC43阳性样本4份、冠状病毒HKU1阳性样本4份以及新型冠状病毒室内质控品S2(中值)4份，结合微量核酸释放剂，进行RT-RPA扩增，用于验证引物探针的特异性。
其中微量核酸释放剂是由含有50mmol/L异硫氰酸胍、按体积百分比计，为0.05％的Tween-20、0.05％的Triton X-100、25％的乙醇、20％的异戊醇和余量为无酶无菌水组成。微量核酸释放剂与待测样本1:1进行混合，提取待测样本中的核酸。
RPA引物探针浓度及反应体系如下：其中，所用的RT-RPA试剂盒为荧光型RNA恒温快速扩增试剂盒。
1)由移液机构向每个干粉管中加入29μL A buffer(注意：A buffer需完全融化混匀)
2)由移液机构向每个反应管分别加入5μL引物探针混合液(2μL上述的上游引物、2μL上述的下游引物和1μL上述的探针，上游、下游引物、探针的浓度均为10μM)，或将引物、探针与干粉管由厂家进行混合。
3)由移液机构向反应管中加入13.5μL所述微量核酸释放剂和样本。
4)由移液机构向反应管中加入2.5μL B buffer并充分混合。
5)混匀后，将反应液甩至管子底部，然后立即将反应管放入一体机内进行检测。荧光检测程序为：恒温42℃；每30s采集一次FAM通道荧光值；反应时间20min。
6)分析检测结果。
结果显示如图1所示，除新型冠状病毒室内质控品S2(中值)外，未见扩增曲线，说明本发明所设计的引物探针具有较强的特异性。
实施例2
建立用于新型冠状病毒的RT-RPA检测方法，其包括如下步骤：
将待测样品，可为血清、全血、血浆、咽拭子、粪便为10％的液体溶液，微量核酸释放剂与待测样本1:1进行混合，提取待测样本中的核酸。
RPA引物探针浓度及反应体系如下：其中，所用的RT-RPA试剂盒为荧光型RNA恒温快速扩增试剂盒。
1)由移液机构向每个干粉管中加入29μL A buffer；
2)由移液机构向每个反应管分别加入5μL引物探针混合液(2μL实施例1中所示的上游引物、2μL实施例1中所示的下游引物和1μL实施例1中所示的探针，浓度均为10μM)。
3)由移液机构向反应管中加入13.5μL所述微量核酸释放剂和样本。
4)由移液机构向反应管中加入2.5μL B buffer并充分混合。
5)混匀后，将反应液甩至管子底部，然后立即将反应管放入一体机内进行检测。荧光检测程序为：恒温42℃；每30s采集一次FAM通道荧光值；反应时间20min。
6)分析检测结果。
扩增结果有扩增曲线，说明新型冠状病毒阳性，未见扩增曲线说明为新型冠状病毒阴性。
其中，微量核酸释放剂配制方法为由含有50mmol/L异硫氰酸胍、按体积百分比计，取0.05mL的Tween-20、0.05mL的Triton X-100、25mL的乙醇、20mL的异戊醇混合后，用无酶无菌水补足100mL，混匀。称取异硫氰酸胍0.59g加入配制好的混合液中即得含50mmol/L异硫氰酸胍的微量核酸释放剂。
实施例3重复性验证实验
按实施例2所述的方法对新型冠状病毒室内质控品S2(中值)、S1(低值)(用PBS稀释)，进行RT-RPA扩增，每个样本重复三次实验，用于验证本方法的重复性。
结果表2，扩增图见图2，结果表明新型冠状病毒室内质控品S2(中值)、S1(低值)3次实验的重复性较好。
表2新型冠状病毒E基因RPA检测重复性验证实验
实施例4最低检出限验证实验
本实验所用室内质控品见表3，用该质控品的S2(中值)、S1(低值)、S0(弱阳)、L1(弱阳)分别按实施例2的方法进行以下实验，用于验证该方法的最低检出限。
结果见图3、图4、图5，新型冠状病毒室内质控品S2(中值)、S1(低值)、S0(弱阳)均有扩增曲线，L1(弱阳)未见扩增曲线，故本方法的最低检出限为50copies/mL。
表3室内质控品参考值
| 浓度编号 | 均值(copies/μL) | 产品用途 |
| S2(中值) | 1.61E+03 | / |
| S1(低值) | 1.53E+02 | 适用于检测限：100copies/mL |
| S0(弱阳) | 9.77E+01 | 适用于检测限：50copies/mL |
| L1(弱阳) | 5.12E+01 | 适用于检测限：20copies/mL |
本发明提供的新型冠状病毒RT-RPA快速检测技术，可实现现场快速检测30分钟内即可完成核酸提取和检测的全过程，大大缩短检测时间，提高检测效率，有效降低人力成本和时间成本。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何本领域技术人员可以利用上述公开的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 一种用于新型冠状病毒检测的引物探针、试剂盒及快速检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctaacaatct tgattctaag gttggtggta a 31
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctctgtatgg ttggtaacca acaccattag tg 32
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caactgaaat ctatcaggcc ggtagcacac ctgtaatggt gttgaagg 48
Claims (8)
1.一种用于新型冠状病毒检测的引物探针，其特征在于，其包括如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示核苷酸序列的上游引物和下游引物，以及含有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的探针，所述SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中，自5′端起第32位碱基标记有FAM发光基团，第33位碱基后连接脱碱基位点，第35位碱基标记淬灭基团BHQ1。
2.一种用于新型冠状病毒检测的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1所述的用于新型冠状病毒检测的引物探针。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括A buffer和B buffer。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括微量核酸释放剂，所述微量核酸释放剂包括按体积百分比计0.5～10％的Triton X-100、0.5～10％的Tween-20、10～30％的乙醇、5～20％的异戊醇，余量为无酶无菌水，及包含终浓度50～80mmol/L的异硫氰酸胍。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂与样本的比例为1:1～1.5混合使用。
6.一种用于新型冠状病毒快速检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1、采用核酸释放剂提取样品的RNA；
S2、每个干粉管中加入29μL A buffer；
S3、向每个反应管分别加入5μL如权利要求1所述的上游引物、下游引物和的探针；
S4、向反应管中加入13.5μL所述微量核酸释放剂和样本；
S5、向反应管中加入2.5μL B buffer并充分混合；
S6、混匀后，将反应液甩至管子底部，然后立即将反应管放入一体机内进行检测；荧光检测程序为：恒温42℃；每30s采集一次FAM通道荧光值；反应时间20min。
7.如权利要求6所述的快速检测方法，其特征在于，所述微量核酸释放剂和样本按体积比为1:1～1.5进行混匀。
8.如权利要求6所述的快速检测方法，其特征在于，还包括结果判定：扩增结果有扩增曲线，说明新型冠状病毒阳性，未见扩增曲线说明为新型冠状病毒阴性。
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2021
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