CN111394346A - Rna核酸释放剂和pcr扩增试剂的冻干微球制备方法及其应用 - Google Patents

Rna核酸释放剂和pcr扩增试剂的冻干微球制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂的冻干微球制备方法及其应用。本发明涉及生物技术领域，解决RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂无法常温运输和储存，使用时的操作繁琐的问题。本发明通过分别按比例将RNA核酸释放剂以及PCR扩增试剂各组分加入无核酶的离心管中，并混合均匀，得到混合溶液，将液氮倒入无菌的药杯中，利用移液枪将混合溶液以10μL体积滴入液氮中，凝结成圆形小球，采用无菌膜对药杯进行封口，并在无菌膜上扎出数个孔，将药杯放入已预冷的冻干机中，冻干机的冷阱温度设置为‑69℃，真空冻干6h以上，分别得到RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂的冻干微球，该冻干微球稳定性好，方便运输和储存，使用方便，可节约时间，提高效率，有助于降低成本。

Description

RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂的冻干微球制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂的冻干微球制备方法及其应用。
背景技术
核酸检测由于其灵敏度高、特异性强、操作简便、所需时间短等特点，已广泛应用于临床医学、检验检疫等多个领域，尤其在聚合酶链式反应(英文：Polymerase ChainReaction，简称：PCR)、等温扩增等核酸扩增技术中。然而，核酸扩增技术对于临床或直接获得的标本中的干扰物质较为敏感，会造成检测结果的假阴性，故在核酸扩增前需进行样品核酸提取与纯化。但一直以来，样本中核酸的提取和纯化是整个实验中最耗时，最繁琐的过程，严重影响样本检测的速度以及现场应用。迄今为止，核酸提取方法主要有煮沸法、离心柱法以及磁珠法。煮沸法提取时需要多次换管离心等步聚，样本处理时间长，且仍存在少量抑制扩增物质，对后续扩增会有抑制效应。离心柱法提取效果较好，但步聚繁多，且该过程中存在核酸容易丢失或污染的不足。磁珠法提取步聚简单，回收率高，易于自动化提取，但产品价格十分昂贵，目前应用并不广泛。可见，目前的核酸提取方法存在样本需求量大，时间长，提取效果差的问题。
PCR试剂广泛应用在食品检测、病原体检测和癌基因诊断等方面。但PCR试剂在保存和运输条件上要求苛刻，一般需要保存在-20℃并且对溶液冻融次数有限制，普遍需要干冰运输。这些条件如果得不到满足，会对PCR试剂的性能造成很大的影响，甚至导致试剂失效。而且现有的PCR试剂不易封装和贮存，冻干粉试剂不易定量，均无法满足即时检测类产品的需求。
因此，如何使得RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂能够便于常温运输和储存，并简化RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂在使用时的操作过程，成为业内亟待解决的问题。
发明内容
本发明提供一种核酸释放剂和PCR扩增试剂的冻干微球制备方法及其应用，以解决RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂无法常温运输和储存，使用时的操作繁琐的问题。
第一方面，本发明提供一种RNA核酸释放剂的冻干微球制备方法，所述方法包括：
按比例将RNA核酸释放剂各组分加入无核酶的离心管中，并混合均匀，得到混合溶液；
将液氮倒入无菌的药杯中，利用移液枪将所述混合溶液以10μL体积滴入所述液氮中，凝结成圆形小球；
采用无菌膜对所述药杯进行封口，并在所述无菌膜上扎出数个孔；
将所述药杯放入已预冷的冻干机中，所述冻干机的冷阱温度设置为-69℃，真空冻干6h以上，得到RNA核酸释放剂的冻干微球。
结合第一方面，在第一方面的第一种可实现方式中，所述RNA核酸释放剂包括：基础组分和冻干保护组分；
所述基础组分包括：裂解剂、RNA酶抑制剂和消泡剂；
所述裂解剂包括：NaOH、NP40、Triton100、明胶、DMSO、EDTA、Tween20、LLS、沙凡婷和NAC中的一种或多种的组合；
所述RNA酶抑制剂包括：异硫氰酸胍，SDS和尿素中的一种或多种的组合；
所述消泡剂包括：异丙醇、乙醇和Foam ban中的一种或多种的组合；
所述冻干保护组分包括：明胶、甘油、DMSO、BSA、PVP、海藻糖、葡萄糖、蔗糖、消泡剂和防腐剂中的两种或多种的组合。
结合第一方面的第一种可实现方式，在第一方面的第二种可实现方式中，所述裂解剂采用NaOH、NP40和LLS的组合，所述RNA酶抑制剂采用异硫氰酸胍和SDS的组合，所述消泡剂采用Foam ban，所述冻干保护组分采用PVP和海藻糖的组合。
结合第一方面的第二种可实现方式，在第一方面的第三种可实现方式中，所述NaOH的摩尔浓度为0.1M-0.5M，所述NP40的体积百分比为0.5％-3％，所述LLS的质量体积百分比为0.2％-2％；
所述异硫氰酸胍的摩尔浓度为0.02M-1M，所述SDS的质量体积百分比为0.1％-2％；
所述Foam ban的质量体积百分比为0.05％-1％；
所述PVP的质量体积百分比为2％-5％，所述海藻糖的质量体积百分比为4％-8％。
第二方面，本发明提供上述任一种RNA核酸释放剂的冻干微球制备方法所制备的RNA核酸释放剂的冻干微球在检测领域的应用。
第三方面，本发明提供一种PCR扩增试剂的冻干微球制备方法，所述方法包括：
按比例将PCR扩增试剂各组分加入无核酶的离心管中，并混合均匀，得到混合溶液；
将液氮倒入无菌的药杯中，利用移液枪将所述混合溶液以20μL体积滴入所述液氮中，凝结成圆形小球；
采用无菌膜对所述药杯进行封口，并在所述无菌膜上扎出数个孔；
将所述药杯放入已预冷的冻干机中，所述冻干机的冷阱温度设置为-69℃，真空冻干6h以上，得到PCR扩增试剂冻干微球。
结合第三方面，在第三方面的第一种可实现方式中，所述PCR扩增试剂包括：扩增组分和冻干保护组分；
所述扩增组分包括：2x RT-PCR Buffer、dNTP、上下游引物、探针、Taq酶和RT酶；
所述2x RT-PCR Buffer包括Tris-HCl8.0、KCl、MgCl2、DTT和甘油；
所述冻干保护组分包括：BSA、海藻糖、蔗糖、PVP、甘氨酸、甜菜碱和甘露醇。
结合第三方面的第一种可实现方式，在第三方面的第二种可实现方式中，所述Tris-HCl8.0的摩尔浓度为30mM-60mM，所述KCl的摩尔浓度为300mM-500mM，所述MgCl2的摩尔浓度为2mM-4mM，所述DTT的摩尔浓度为0.2mM-0.6mM，所述甘油的体积百分比为0.2％-0.8％；
所述dNTP的摩尔浓度为0.2mM-0.6mM，所述上下游引物的摩尔浓度为0.2μM-0.6μM，所述探针的摩尔浓度为0.1μM-0.3μM，所述Taq酶的使用浓度为0.02U/μL-0.06U/μL，所述RT酶的使用浓度为0.4U/μL-0.8U/μL；
所述BSA的质量体积百分比为0.05％-0.3％，所述海藻糖的质量体积百分比为4％-6％，所述蔗糖的质量体积百分比为50％-100％，所述PVP的质量体积百分比为2％-8％，所述甘氨酸的质量体积百分比为2％-5％，所述甜菜碱的摩尔浓度为0.4mM-0.8mM，所述甘露醇的质量体积百分比为20％-50％。
第四方面，本发明提供上述任一种PCR扩增试剂的冻干微球制备方法所制备的PCR扩增试剂的冻干微球在检测领域的应用。
第五方面，本发明提供一种RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂的冻干微球的使用方法，RNA核酸释放剂的冻干微球采用上述任一种RNA核酸释放剂的冻干微球制备方法所制备，PCR扩增试剂的冻干微球采用上述任一种PCR扩增试剂的冻干微球制备方法所制备，所述方法包括：
吸取咽拭子样本、血清样本或者血浆样本10μL-20μL，将所述样本加入到装有RNA核酸释放剂的冻干微球的PCR管中溶解冻干微球，室温静置3min-5min，使病毒颗粒充分降解，释放出遗传物质，得到溶解后的RNA核酸释放剂；
吸取DEPC处理水15μL-40μL，将所述DEPC处理水加入到装有PCR扩增试剂冻干微球的PCR管中溶解冻干微球，得到溶解后的PCR扩增试剂；
将所述溶解后的PCR扩增试剂全部转移至装有溶解后的RNA核酸释放剂的PCR管中，盖上管盖，对PCR管瞬时离心后，将PCR管放置在扩增仪上检测。
本发明具有以下有益效果：本发明的RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂的冻干微球制备方法，通过分别按比例将RNA核酸释放剂以及PCR扩增试剂各组分加入无核酶的离心管中，并混合均匀，得到混合溶液，将液氮倒入无菌的药杯中，利用移液枪将混合溶液以10μL体积滴入液氮中，凝结成圆形小球，采用无菌膜对药杯进行封口，并在无菌膜上扎出数个孔，将药杯放入已预冷的冻干机中，冻干机的冷阱温度设置为-69℃，真空冻干6h以上，分别得到RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂的冻干微球，本发明的方法制备的RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂冻干微球在37℃加速条件下，15天仍保持极高的稳定性，在常温条件下可稳定存放6个月以上，-4℃条件下可稳定存放1年以上，方便运输和储存，且用于冻干的冻干成分较为常见，价格低廉，易于大规模生产和推广应用，冻干微球大小形态均一，定量稳定且准确，而且取用方便，易于封装。本发明的方法所制备的RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂的冻干微球在使用时，实验操作过程简便快捷，既节约时间提高效率，又有助于降低成本，且有利于实现POCT自动化操作。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的RNA核酸释放剂的冻干微球制备方法的流程图。
图2为RNA核酸释放剂的冻干微球示意图。
图3为本发明提供的PCR扩增试剂的冻干微球制备方法的流程图。
图4为PCR扩增试剂的冻干微球的示意图。
图5为本发明提供的RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂的冻干微球的使用方法的流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例及相应的附图对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下结合附图，详细说明本发明各实施例提供的技术方案。
请参阅图1，为本发明实施例提供的一种RNA核酸释放剂的冻干微球制备方法的流程图，所述方法包括：
步骤S101，按比例将RNA核酸释放剂各组分加入无核酶的离心管中，并混合均匀，得到混合溶液。
在本实施例中，所述RNA核酸释放剂包括：基础组分和冻干保护组分。
其中，所述基础组分包括：裂解剂、RNA酶抑制剂和消泡剂。所述裂解剂可以包括：NaOH(氢氧化钠)、NP40(乙基苯基聚乙二醇)、Triton100(曲拉通100)、明胶、DMSO(二甲基亚砜)、EDTA(乙二胺四乙酸二钠盐)、Tween20(吐温20)、LLS(十二烷基硫酸锂)、沙凡婷和NAC(N-乙酰基-L-半胱氨酸)中的一种或多种的组合。所述RNA酶抑制剂可以包括：异硫氰酸胍，SDS(十二烷基硫酸钠)和尿素中的一种或多种的组合。所述消泡剂可以包括：异丙醇、乙醇和Foam ban(一种消泡剂)中的一种或多种的组合。所述冻干保护组分包括：明胶、甘油、DMSO、BSA(牛血清白蛋白)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、海藻糖、葡萄糖、蔗糖、消泡剂和防腐剂中的两种或多种的组合。
进一步地，所述裂解剂采用NaOH、NP40和LLS的组合，所述RNA酶抑制剂采用异硫氰酸胍和SDS的组合，所述消泡剂采用Foam ban，所述冻干保护组分采用PVP和海藻糖的组合。
进一步地，所述NaOH的摩尔浓度为0.1M-0.5M，所述NP40的体积百分比(mL/mL)为0.5％-3％，所述LLS的质量体积百分比(mg/mL)为0.2％-2％。所述异硫氰酸胍的摩尔浓度为0.02M-1M，所述SDS的质量体积百分比为0.1％-2％。所述Foam ban的质量体积百分比为0.05％-1％。所述PVP的质量体积百分比为2％-5％，所述海藻糖的质量体积百分比为4％-8％。
步骤S102，将液氮倒入无菌的药杯中，利用移液枪将所述混合溶液以10μL体积滴入所述液氮中，凝结成圆形小球。
步骤S103，采用无菌膜对所述药杯进行封口，并在所述无菌膜上扎出数个孔。
利用可精确定量的移液枪，将准备好的混合溶液以10μL体积滴入液氮中，凝结成圆形小球，采用无菌膜封口并用牙签或者枪头扎3-5个孔。
步骤S104，将所述药杯放入已预冷的冻干机中，所述冻干机的冷阱温度设置为-69℃，真空冻干6h以上，得到RNA核酸释放剂的冻干微球。
冷冻干燥就是把含有大量水分物质，预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使固态水直接升华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后体积不变，疏松多孔。在升华时要吸收热量，引起产品本身温度的下降而减慢升华速度，为了增加升华速度，缩短干燥时间，必须要对产品进行适当加热。整个干燥是在较低的温度下进行的，冷冻干燥在低温下进行，因此对于许多热敏性的物质特别适用。试剂冻干后，排除97％以上的水分，而蛋白质、微生物之类不会发生变性或失去生物活力，干燥后的产品能够常温保存而不致变质，因此冷冻干燥技术在医药上得到广泛地应用。
如图2所示，可以将冻干完成的RNA核酸释放剂冻干微球2转入PCR八联管1中保存。
本发明还提供如上述RNA核酸释放剂的冻干微球制备方法所制备的RNA核酸释放剂的冻干微球在检测领域的应用。
请参阅图3，本发明还提供一种PCR扩增试剂的冻干微球制备方法，所述方法包括：
步骤S301，按比例将PCR扩增试剂各组分加入无核酶的离心管中，并混合均匀，得到混合溶液。
在本实施例中，所述PCR扩增试剂包括：扩增组分和冻干保护组分。所述扩增组分包括：2x RT-PCR Buffer(2X RT-PCR缓冲液)、dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)、上下游引物、探针、Taq酶和RT酶。所述2x RT-PCR Buffer包括Tris-HCl8.0(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)、KCl(氯化钾)、MgCl2(氯化镁)、DTT(二硫苏糖醇)和甘油。所述冻干保护组分包括：BSA、海藻糖、蔗糖、PVP、甘氨酸、甜菜碱和甘露醇。
进一步地，所述Tris-HCl8.0的摩尔浓度为30mM-60mM，所述KCl的摩尔浓度为300mM-500mM，所述MgCl2的摩尔浓度为2mM-4mM，所述DTT的摩尔浓度为0.2mM-0.6mM，所述甘油的体积百分比为0.2％-0.8％。
进一步地，所述dNTP的摩尔浓度为0.2mM-0.6mM，所述上下游引物的摩尔浓度为0.2μM-0.6μM，所述探针的摩尔浓度为0.1μM-0.3μM，所述Taq酶的使用浓度为0.02U/μL-0.06U/μL，所述RT酶的使用浓度为0.4U/μL-0.8U/μL。
进一步地，所述BSA的质量体积百分比为0.05％-0.3％，所述海藻糖的质量体积百分比为4％-6％，所述蔗糖的质量体积百分比为50％-100％，所述PVP的质量体积百分比为2％-8％，所述甘氨酸的质量体积百分比为2％-5％，所述甜菜碱的摩尔浓度为0.4mM-0.8mM，所述甘露醇的质量体积百分比为20％-50％。
步骤S302，将液氮倒入无菌的药杯中，利用移液枪将所述混合溶液以20μL体积滴入所述液氮中，凝结成圆形小球。
步骤S303，采用无菌膜对所述药杯进行封口，并在所述无菌膜上扎出数个孔。
利用可精确定量的移液枪，将准备好的混合溶液以20μL体积滴入液氮中，凝结成圆形小球，采用无菌膜封口并用牙签或者枪头扎3-5个孔
步骤S304，将所述药杯放入已预冷的冻干机中，所述冻干机的冷阱温度设置为-69℃，真空冻干6h以上，得到PCR扩增试剂冻干微球。
如图4所示，可以将冻干完成的PCR扩增试剂冻干微球3转入PCR八联管1中保存。
本发明还提供如上述PCR扩增试剂的冻干微球制备方法所制备的PCR扩增试剂的冻干微球在检测领域的应用。
请参阅图5，为本发明提供的一种RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂的冻干微球的使用方法的流程图，其中，该RNA核酸释放剂的冻干微球采用上述RNA核酸释放剂的冻干微球制备方法所制备，PCR扩增试剂的冻干微球采用上述PCR扩增试剂的冻干微球制备方法所制备，所述方法包括：
步骤S501，吸取咽拭子样本、血清样本或者血浆样本10μL-20μL，将所述样本加入到装有RNA核酸释放剂的冻干微球的PCR管中溶解冻干微球，室温静置3min-5min，使病毒颗粒充分降解，释放出遗传物质，得到溶解后的RNA核酸释放剂；
步骤S502，吸取DEPC处理水15μL-40μL，将所述DEPC处理水加入到装有PCR扩增试剂冻干微球的PCR管中溶解冻干微球，得到溶解后的PCR扩增试剂；
步骤S503，将所述溶解后的PCR扩增试剂全部转移至装有溶解后的RNA核酸释放剂的PCR管中，盖上管盖，对PCR管瞬时离心后，将PCR管放置在扩增仪上检测。
本发明的RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂的冻干微球的使用时可以有效减少实验操作步骤，简化实验流程，从而提高检测效率。
以下通过具体的实验和数据来体现本发明的有益效果。
实验1：采用本发明制备的RNA核酸释放剂冻干微球和PCR扩增试剂冻干微球对HCV阳性血清样本进行检测并进行稳定性测试。
1.1按照下表比例进行RNA核酸释放剂无冻干组分和含冻干组分配制以及HCV-PCR扩增试剂无冻干组分和含冻干组分配制。
表1.RNA核酸释放剂各组分含量表
序号 组分 含冻干组分浓度 无冻干组分浓度
1 NaOH 0.1M 0.1M
2 NP40 1％ 1％
3 LLS 0.5％ 0.5％
4 异硫氰酸胍 0.1M 0.1M
5 SDS 0.20％ 0.20％
6 Foamban 0.50％ 0.50％
7 PVP 3％ -
表2.HCV-PCR扩增试剂各组分含量表
序号 组分 含冻干组分浓度 无冻干组分浓度
1 Tris-HCl8.0 50mM 50mM
2 KCl 400mM 400mM
3 MgCl2 2mM 2mM
4 DTT 0.5mM 0.5mM
5 甘油 0.20％ 0.20％
6 dNTP 0.5mM 0.5mM
7 HCV-F/R 0.4μM 0.4μM
8 HCV-P 0.2μM 0.2μM
9 Taq酶 0.05U/μL 0.05U/μL
10 RT酶 0.4U/μL 0.4U/μL
11 BSA 0.10％ -
12 海藻糖 4％ -
13 蔗糖 50％ -
14 PVP 5％ -
15 甘氨酸 3％ -
16 甜菜碱 0.4μM -
17 甘露醇 10％ -
1.2 RNA核酸释放剂冻干微球和HCV-PCR扩增试剂冻干微球制备。
将液氮倒入无菌的药杯中，利用可精确定量的移液枪，将准备好的RNA核酸释放剂含冻干组分的混合溶液和HCV-PCR扩增试剂含冻干组分的混合溶液分别以10μL和20μL体积滴入液氮中，凝结成圆形小球，采用无菌膜封口并用牙签或者枪头扎3-5个孔。放入已预冷的冻干机中，冷阱温度设置成-69℃，真空冻干6h以上。
1.3冻干微球加速稳定性测试。
将RNA核酸释放剂冻干微球和HCV-PCR扩增试剂冻干微球作为实验组，RNA核酸释放剂无冻干组分和HCV-PCR扩增试剂无冻干组分作为对照组，实验组和对照组均分成5组，分别37℃环境下加速放置0天，3天，7天，15天和30天，每组15T，用于HCV阳性血清样本三个浓度1E4IU/mL，1E3IU/mL和1E2IU/mL的测试，每个时间点的每个浓度检测5个重复。
1.4 RNA核酸释放剂冻干微球溶解和HCV核酸释放。
1.4.1实验组：吸取HCV血清样本10μL，加入到装有RNA核酸释放剂冻干微球的PCR管中溶解冻干微球，室温静置3min，以便HCV病毒裂解，核酸充分释放。
1.4.2对照组：吸取HCV血清样本10μL加入预分装有10μLRNA核酸释放剂无冻干组分的PCR管中，并吹打混匀，室温静置3min，以便HCV病毒裂解，核酸充分释放。
1.5 HCV-PCR扩增试剂冻干微球溶解和PCR扩增体系构建。
1.5.1实验组：吸取20μL DEPC处理水至装有HCV-PCR扩增试剂冻干微球的PCR管中溶解冻干微球，并将其全部转移到实验组装有RNA核酸释放剂冻干微球的PCR管中。
1.5.2对照组：在对照组的PCR管中加入10μL混匀的无冻干组分的PCR扩增试剂。
1.5.3将构建完成的实验组和对照组的PCR扩增体系放入扩增仪中检测。
表3.扩增程序
Figure BDA0002419188320000091
1.6用于HCV阳性血清样本扩增的引物探针序列如下：
HCV-F:5'-GAGTAGTGTTGGGTCGCGAA-3'；
HCV-R:5'-GGTGCACGGTCTACGAGACCT-3'；
HCV-P:5'-CTAGCCATGGCGTTAGTAYGAGTGTCG-3'。
1.7实验组和对照组各时间点的检测结果如下：
表4.实验组各浓度不同时间点CT值检测结果统计表
Figure BDA0002419188320000101
表5.实验组各浓度不同时间点检出率统计表
Figure BDA0002419188320000102
表6.对照组各浓度不同时间点CT值检测结果统计表
Figure BDA0002419188320000111
表7.对照组各浓度不同时间点检出率统计表
Figure BDA0002419188320000112
1.8结果分析。从表4-表7可以看出，37℃加速实验中，实验组1E4浓度各时间点均能检出，且30天内的各时间点的变异系数均控制在1％以内，第30天的变异系数为0.73％。1E3浓度各时间点也均能检出，且30天内的各时间点的变异系数均控制在2％以内，第30天的变异系数为1.13％。1E2浓度前15天内的各时间点的变异系数均控制在3％以内，第15天的变异系数为2.14％，第30天5例中出现1例未能检出。由此可见，冻干微球在37℃加速的条件下，其稳定性≥15天。37℃加速实验中，对照组0天时，实验结果和实验组差不多，但1E4浓度在7天时，5例中有2例未能检出，1E3浓度在3天时出现2例未能检出，1E2浓度在3天时即出现5例均未能检出的情况。其稳定性远远低于实验组。
实验2：采用本发明制备的RNA核酸释放剂冻干微球和PCR扩增试剂冻干微球对FluA阳性口咽拭子样本进行检测并进行稳定性测试。
2.1按照下表比例进行RNA核酸释放剂无冻干组分和含冻干组分配制以及FluA-PCR扩增试剂无冻干组分和含冻干组分配制。
表8.RNA核酸释放剂各组分含量表
序号 组分 含冻干组分浓度 无冻干组分浓度
1 NaOH 0.1M 0.1M
2 NP40 1％ 1％
3 LLS 0.5％ 0.5％
4 异硫氰酸胍 0.1M 0.1M
5 SDS 0.20％ 0.20％
6 Foamban 0.50％ 0.50％
7 PVP 3％ -
表9.FluA-PCR扩增试剂各组分含量表
序号 组分 含冻干组分浓度 无冻干组分浓度
1 Tris-HCl8.0 50mM 50mM
2 KCl 400mM 400mM
3 MgCl2 2mM 2mM
4 DTT 0.5mM 0.5mM
5 甘油 0.20％ 0.20％
6 dNTP 0.5mM 0.5mM
7 FluA-F/R 0.4μM 0.4μM
8 FluA-P 0.2μM 0.2μM
9 Taq酶 0.05U/μL 0.05U/μL
10 RT酶 0.4U/μL 0.4U/μL
11 BSA 0.10％ -
12 海藻糖 4％ -
13 蔗糖 50％ -
14 PVP 5％ -
15 甘氨酸 3％ -
16 甜菜碱 0.4μM -
17 甘露醇 10％ -
2.2 RNA核酸释放剂冻干微球和FluA-PCR扩增试剂冻干微球制备。
将液氮倒入无菌的药杯中，利用可精确定量的移液枪，将准备好的RNA核酸释放剂含冻干组分的混合溶液和FluA-PCR扩增试剂含冻干组分的混合溶液分别以10μL和20μL体积滴入液氮中，凝结成圆形小球，采用无菌膜封口并用牙签或者枪头扎3-5个孔。放入已预冷的冻干机中，冷阱温度设置成-69℃，真空冻干6h以上。
2.3冻干微球加速稳定性测试。
将RNA核酸释放剂冻干微球和FluA-PCR扩增试剂冻干微球作为实验组，RNA核酸释放剂无冻干组分和FluA-PCR扩增试剂无冻干组分作为对照组，实验组和对照组均分成5组，分别37℃环境下加速放置0天，3天，7天，15天和30天，每组15T，用于FluA口咽拭子样本高中低三个浓度的测试，每个时间点的每个浓度检测5个重复。
2.4 RNA核酸释放剂冻干微球溶解和FluA核酸释放。
2.4.1实验组：吸取FluA口咽拭子样本10μL，加入到装有RNA核酸释放剂冻干微球的PCR管中溶解冻干微球，室温静置3min，以便FluA病毒裂解，核酸充分释放。
2.4.2对照组：吸取FluA口咽拭子样本10μL加入预分装有10μLRNA核酸释放剂无冻干组分的PCR管中，并吹打混匀，室温静置3min，以便FluA病毒裂解，核酸充分释放。
2.5 FluA-PCR扩增试剂冻干微球溶解和PCR扩增体系构建
2.5.1实验组：吸取20μL DEPC处理水至装有FluA-PCR扩增试剂冻干微球的PCR管中溶解冻干微球，并将其全部转移到实验组装有RNA核酸释放剂冻干微球的PCR管中。
2.5.2对照组：在对照组的PCR管中加入10μL混匀的无冻干组分的PCR扩增试剂。
2.5.3将构建完成的实验组和对照组的PCR扩增体系放入扩增仪中检测。
表10.扩增程序
Figure BDA0002419188320000141
2.6用于FluA口咽拭子样本扩增的引物探针序列如下：
FluA-F:5'-GAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTA-3'；
FluA-R:5'-TCTTCAAGTCTCTGCGCGAT-3'；
FluA-P:5'-CGAAACGTACGTTCTTTCTATCAT-3'。
2.7实验组和对照组各时间点的检测结果如下：
表11.实验组各浓度不同时间点CT值检测结果统计表
Figure BDA0002419188320000151
表12.实验组各浓度不同时间点检出率统计表
序号 FluA样本 0天 3天 7天 15天 30天
1 高浓度 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5
2 中浓度 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5
3 低浓度 5/5 5/5 5/5 5/5 4/5
表13.对照组各浓度不同时间点CT值检测结果统计表
Figure BDA0002419188320000161
表14.对照组各浓度不同时间点检出率统计表
序号 FluA样本 0天 3天 7天 15天 30天
1 高浓度 5/5 5/5 2/5 0/5 0/5
2 中浓度 5/5 3/5 0/5 0/5 0/5
3 低浓度 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5
2.8结果分析。
从表11-表14可以看出，37℃加速实验中，实验组高浓度各时间点均能检出，且30天内的各时间点的变异系数均控制在1％以内，第30天的变异系数为0.50％。中浓度各时间点也均能检出，且30天内的各时间点的变异系数均控制在1％以内，第30天的变异系数为0.91％。低浓度前15天内的各时间点的变异系数均控制在2％以内，第15天的变异系数为1.56％，第30天5例中出现1例未能检出。由此可见，冻干微球在37℃加速的条件下，其稳定性≥15天。37℃加速实验中，对照组0天时，实验结果和实验组差不多，但高浓度在7天时，5例中有3例未能检出，中浓度在3天时出现2例未能检出，低浓度在3天时即出现5例均未能检出的情况。其稳定性远远低于实验组。
通过实验1和实验2可以看出，两组不含冻干成分的RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂，在37℃加速实验条件下，其稳定性均不足3天，而含此冻干成分的冻干试剂在37℃加速实验条件下，其稳定性≥15天，显著延长。因此本发明所述的RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂两种冻干试剂可以明显提高RNA类PCR扩增试剂的稳定性。
综上所述，本发明的方法制备的RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂冻干微球在37℃加速条件下，15天仍保持极高的稳定性，在常温条件下可稳定存放6个月以上，-4℃条件下可稳定存放1年以上，方便运输和储存，且用于冻干的冻干成分较为常见，价格低廉，易于大规模生产和推广应用，冻干微球大小形态均一，定量稳定且准确，而且取用方便，易于封装。
以上所述的本发明实施方式并不构成对本发明保护范围的限定。

Claims (10)

1.一种RNA核酸释放剂的冻干微球制备方法，其特征在于，所述方法包括：
按比例将RNA核酸释放剂各组分加入无核酶的离心管中，并混合均匀，得到混合溶液；
将液氮倒入无菌的药杯中，利用移液枪将所述混合溶液以10μL体积滴入所述液氮中，凝结成圆形小球；
采用无菌膜对所述药杯进行封口，并在所述无菌膜上扎出数个孔；
将所述药杯放入已预冷的冻干机中，所述冻干机的冷阱温度设置为-69℃，真空冻干6h以上，得到RNA核酸释放剂的冻干微球。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA核酸释放剂包括：基础组分和冻干保护组分；
所述基础组分包括：裂解剂、RNA酶抑制剂和消泡剂；
所述裂解剂包括：NaOH、NP40、Triton100、明胶、DMSO、EDTA、Tween20、LLS、沙凡婷和NAC中的一种或多种的组合；
所述RNA酶抑制剂包括：异硫氰酸胍，SDS和尿素中的一种或多种的组合；
所述消泡剂包括：异丙醇、乙醇和Foam ban中的一种或多种的组合；
所述冻干保护组分包括：明胶、甘油、DMSO、BSA、PVP、海藻糖、葡萄糖、蔗糖、消泡剂和防腐剂中的两种或多种的组合。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述裂解剂采用NaOH、NP40和LLS的组合，所述RNA酶抑制剂采用异硫氰酸胍和SDS的组合，所述消泡剂采用Foam ban，所述冻干保护组分采用PVP和海藻糖的组合。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述NaOH的摩尔浓度为0.1M-0.5M，所述NP40的体积百分比为0.5％-3％，所述LLS的质量体积百分比为0.2％-2％；
所述异硫氰酸胍的摩尔浓度为0.02M-1M，所述SDS的质量体积百分比为0.1％-2％；
所述Foam ban的质量体积百分比为0.05％-1％；
所述PVP的质量体积百分比为2％-5％，所述海藻糖的质量体积百分比为4％-8％。
5.一种如权利要求1～4任一项所述的RNA核酸释放剂的冻干微球制备方法所制备的RNA核酸释放剂的冻干微球在检测领域的应用。
6.一种PCR扩增试剂的冻干微球制备方法，其特征在于，所述方法包括：
按比例将PCR扩增试剂各组分加入无核酶的离心管中，并混合均匀，得到混合溶液；
将液氮倒入无菌的药杯中，利用移液枪将所述混合溶液以20μL体积滴入所述液氮中，凝结成圆形小球；
采用无菌膜对所述药杯进行封口，并在所述无菌膜上扎出数个孔；
将所述药杯放入已预冷的冻干机中，所述冻干机的冷阱温度设置为-69℃，真空冻干6h以上，得到PCR扩增试剂冻干微球。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括：扩增组分和冻干保护组分；
所述扩增组分包括：2x RT-PCR Buffer、dNTP、上下游引物、探针、Taq酶和RT酶；所述2xRT-PCR Buffer包括Tris-HCl8.0、KCl、MgCl2、DTT和甘油；
所述冻干保护组分包括：BSA、海藻糖、蔗糖、PVP、甘氨酸、甜菜碱和甘露醇。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述Tris-HCl8.0的摩尔浓度为30mM-60mM，所述KCl的摩尔浓度为300mM-500mM，所述MgCl2的摩尔浓度为2mM-4mM，所述DTT的摩尔浓度为0.2mM-0.6mM，所述甘油的体积百分比为0.2％-0.8％；
所述dNTP的摩尔浓度为0.2mM-0.6mM，所述上下游引物的摩尔浓度为0.2μM-0.6μM，所述探针的摩尔浓度为0.1μM-0.3μM，所述Taq酶的使用浓度为0.02U/μL-0.06U/μL，所述RT酶的使用浓度为0.4U/μL-0.8U/μL；
所述BSA的质量体积百分比为0.05％-0.3％，所述海藻糖的质量体积百分比为4％-6％，所述蔗糖的质量体积百分比为50％-100％，所述PVP的质量体积百分比为2％-8％，所述甘氨酸的质量体积百分比为2％-5％，所述甜菜碱的摩尔浓度为0.4mM-0.8mM，所述甘露醇的质量体积百分比为20％-50％。
9.一种如权利要求6～8任一项所述的PCR扩增试剂的冻干微球制备方法所制备的PCR扩增试剂的冻干微球在检测领域的应用。
10.一种RNA核酸释放剂和PCR扩增试剂的冻干微球的使用方法，其特征在于，RNA核酸释放剂的冻干微球采用如权利要求1～4任一项所述的RNA核酸释放剂的冻干微球制备方法所制备，PCR扩增试剂的冻干微球采用如权利要求6～8任一项所述的PCR扩增试剂的冻干微球制备方法所制备，所述方法包括：
吸取咽拭子样本、血清样本或者血浆样本10μL-20μL，将所述样本加入到装有RNA核酸释放剂的冻干微球的PCR管中溶解冻干微球，室温静置3min-5min，使病毒颗粒充分降解，释放出遗传物质，得到溶解后的RNA核酸释放剂；
吸取DEPC处理水15μL-40μL，将所述DEPC处理水加入到装有PCR扩增试剂冻干微球的PCR管中溶解冻干微球，得到溶解后的PCR扩增试剂；
将所述溶解后的PCR扩增试剂全部转移至装有溶解后的RNA核酸释放剂的PCR管中，盖上管盖，对PCR管瞬时离心后，将PCR管放置在扩增仪上检测。
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